ინფორმაცია

როგორ ავაწყოთ სამი 60 მერიანი ნტ პცრ-ით?

როგორ ავაწყოთ სამი 60 მერიანი ნტ პცრ-ით?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Დილა მშვიდობისა,

მე ახალი ვარ მოლეკულურ ბიოლოგიაში. კითხვა შეიძლება სულელური იყოს, მაგრამ მინდა ვიცოდე პასუხი. მე მაქვს სამი 60მერიანი ერთჯაჭვიანი სინთეზური ოლიგონუკლეოტიდი. კერძოდ, ტეგი 1 - 3. ჩემი მიზანია ამ სამის ერთად შეკრება pcr-ით. ასე რომ, მე დავაპროექტე ორი პრაიმერი, რომელთა გადახურვაა 18nts თითოეული ტეგიდან 1 და ტეგი 2 და შემდეგ Tag 2 და tag 3 (მე აღვნიშნე ჩემი პრაიმერების ორიენტაცია). რა არის აწყობის საუკეთესო საშუალება. წავიკითხე PCR-ზე დაფუძნებული ორსაფეხურიანი დნმ-ის სინთეზის შესახებ. მაგრამ მსურს მეტი ვიცოდე ამის შესახებ.

თუ თქვენ გაქვთ რაიმე შეკითხვები, გთხოვთ გამოაქვეყნოთ. მადლობა და მოუთმენლად ველი თქვენს ღირებულ პასუხებს

[]


თქვენი TAG ოლიგოების PCR-ით აწყობისთვის, თქვენ დაგჭირდებათ თქვენი პრაიმერების ხელახალი დიზაინი, რათა ისინი შეავსონ TAG ოლიგოს, რადგან დნმ პოლიმერაზები მუშაობენ ნუკლეოტიდების დამატებით დნმ-ის ჯაჭვის 3' ბოლოში.

თქვენი დიზაინი ასე გამოიყურება:

ახლა ამ დიზაინით თქვენ ვერ შეძლებთ ყველაფრის ერთად აწყობას, რადგან TAG-3 პრაიმერის 2-ის კომპლემენტარულობა მხოლოდ 5' ბოლოებს წარმოადგენს გასაგრძელებლად, რასაც თქვენი დნმ პოლიმერაზა არ შეუძლია. ასე რომ, თქვენ შეგიძლიათ შეუკვეთოთ თქვენი TAG-3 ოლიგოს მთელი საპირისპირო კომპლემენტი, ან შეიმუშავოთ პრაიმერი 3, რომელიც ანეირდება TAG-3-ის 3' ბოლოზე TAG-3-ის გასაძლიერებლად.

ყველა ამ ნაწილთან ერთად, თქვენ უნდა შეგეძლოთ ყველაფრის აწყობა ერთ რეაქციაში, მაგრამ თქვენი ქვემო პროცესიდან გამომდინარე, შესაძლოა მოგიწიოთ საინტერესო პროდუქტის გაწმენდა, რადგან ერთი რეაქცია წარმოქმნის შუალედებს (1, 2, 3, 1+2, 2+3).


მე გირჩევდი გიბსონის ასამბლეის გამოყენებას. მე არ ვარ ექსპერტი, მაგრამ ეს არის პრობლემის გადაჭრა. ალბათ არსებობს ამის გაკეთება PCR-ით, მაგრამ იმედი მაქვს, რომ ეს საკმაოდ რთული იქნება.

იხილეთ ეს ციტატა იმ გვერდიდან (ჩემი ხაზგასმა):

რჩევა: ფრაგმენტების „გაკერვა“ ოლიგოს გამოყენებით

როდესაც საჭიროა ორ PCR პროდუქტს შორის შუალედური თანმიმდევრობა, ერთი მეთოდია რამდენიმე ოლიგოს ერთმანეთთან „დაკერვა“. ეს ტექნიკა არის განსაკუთრებით სასარგებლოა პრომოტორების, ტერმინატორების და სხვა მოკლე თანმიმდევრობების შეკრებაში შესაყვანად და გამოიყენება მაშინ, როდესაც ჩასმული ნაწილი ძალიან გრძელია გადაფარვის PCR პრაიმერებზე (>60 bp), მაგრამ ძალიან მოკლეა საკუთარი ნაწილის შესაქმნელად (<150 bp. ).

გთხოვთ, გაითვალისწინოთ, რომ „შეკერვის“ პრაიმერების დიზაინის მეთოდი და მათი რაოდენობა, რომელიც უნდა ჩაერთოს გიბსონის რეაქციაში, განსხვავდება ჩვეულებრივი PCR პრაიმერებისგან. დეტალები გამოქვეყნებულია (Nat Methods 2010; 7:901-3).

რჩევა: ერთდროულად აწყობილი ფრაგმენტების რაოდენობა

რამდენიმე ფრაგმენტი შეიძლება შეიკრიბოს ერთ რეაქციაში. თუმცა, ზოგიერთმა ლაბორატორიამ დააფიქსირა წარმატების მკვეთრი შემცირება ერთდროულად 5-ზე მეტი ფრაგმენტის აწყობისას.

განახლება

როგორც ჩანს, არიან ადამიანები, რომლებიც ამტკიცებენ, რომ გიბსონი შეუძლებელია მოკლე ფრაგმენტებით ან რომ ის კარგად მუშაობს. ამის შესახებ მეტი ინფორმაციაა აქ, აქ და აქ. თქვენი რეაქციის შედარებით რთული ბუნების გამო, ვფიქრობ, რომ გიბსონმა შეიძლება დაგიზოგოთ დრო. მაგრამ იქ დაკავშირებული სხვა ადამიანები ამტკიცებენ, რომ PCR უკეთ მუშაობს.

განახლება 2

GaelC-ის ზემოთ მოცემულ პასუხს აქვს უკეთესი/უფრო კონკრეტული მეთოდოლოგიური რჩევები PCR შეკრების შესახებ.


Უყურე ვიდეოს: 7 Trainer Street, Muirhead NT (აგვისტო 2022).