ინფორმაცია

თავისუფალი ნუკლეოტიდების ცვლილებები

თავისუფალი ნუკლეოტიდების ცვლილებები



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ჩვენ ვიცით, რომ რნმ-ს შეუძლია შეცვალოს ტრანსკრიპციის შემდგომ (რნმ მოდიფიკაცია). ასე რომ, როდესაც რნმ იშლება, შესაძლებელია თუ არა ასეთი მოდიფიკაციები ცალკეულ ნუკლეოტიდებზე კვლავ იყოს წარმოდგენილი -- ისეთი, რომ როდესაც ნუკლეოტიდები გადამუშავდება სხვა რნმ-ის ასაგებად, ეს მოდიფიკაციები შენარჩუნდეს?


ნუკლეოტიდი

ნუკლეოტიდი არის ორგანული მოლეკულა, რომელიც წარმოადგენს დნმ-ისა და რნმ-ის სამშენებლო ბლოკს. მათ ასევე აქვთ უჯრედების სიგნალიზაციასთან, მეტაბოლიზმთან და ფერმენტულ რეაქციებთან დაკავშირებული ფუნქციები. ნუკლეოტიდი შედგება სამი ნაწილისაგან: ფოსფატის ჯგუფი, 5 ნახშირბადიანი შაქარი და აზოტოვანი ბაზა. დნმ-ში ოთხი აზოტოვანი ბაზაა ადენინი, ციტოზინი, გუანინი და თიმინი. რნმ შეიცავს ურაცილს, თიმინის ნაცვლად. ნუკლეოტიდი ჯაჭვში ქმნის ყველა ცნობილი ცოცხალი არსების გენეტიკურ მასალას. ისინი ასევე ასრულებენ უამრავ ფუნქციას გენეტიკური ინფორმაციის შენახვის მიღმა, როგორც მესინჯერები და ენერგიის მოძრავი მოლეკულები.

სამი ნუკლეოტიდის სერია დნმ-ში ცნობილია როგორც a კოდონიდა ხელმძღვანელობს უჯრედის შიგნით არსებულ ცილებს, რომ მიამაგრონ კონკრეტული ცილა დნმ-ის დანარჩენი ნაწილით მითითებულ სერიას. სპეციალური კოდონები კი აზუსტებენ მანქანას, სად უნდა შეჩერდეს და დაიწყოს პროცესი. დნმ-ის ტრანსლაციაროგორც ცნობილია, დნმ-დან მიღებული ინფორმაცია ცილების ენად გარდაქმნის. ამინომჟავების ეს ჯაჭვი შეიძლება სწორად დაიკეცოს და უზრუნველყოს უჯრედში არსებული მრავალი ფუნქცია.


რნმ-ის დამუშავების რეგულირება

როდესაც ევკარიოტული გენი ბირთვში ტრანსკრიბირებულია, პირველადი ტრანსკრიპტი (ახლად დამზადებული რნმ-ის მოლეკულა) ჯერ კიდევ არ განიხილება მესენჯერ რნმ-ად. ამის ნაცვლად, ეს არის “ მოუმწიფებელი” მოლეკულა, რომელსაც ეწოდება პრე-მრნმ.

პრე-მრნმ-მა უნდა გაიაროს გარკვეული ცვლილებები, რათა გახდეს მომწიფებული mRNA მოლეკულა, რომელსაც შეუძლია დატოვოს ბირთვი და გადაითარგმნოს. ეს მოიცავს შერწყმას, დაფარვას და პოლი-A კუდის დამატებას, რაც პოტენციურად შეიძლება დარეგულირდეს - დააჩქაროს, შეანელოს ან შეიცვალოს სხვა პროდუქტის მისაღებად.

ალტერნატიული შერწყმა

პრე-მრნმ მოლეკულების უმეტესობას აქვს სექციები, რომლებიც ამოღებულია მოლეკულიდან, ე.წ ინტრონებიდა სექციები, რომლებიც დაკავშირებულია ან ერთად, რათა საბოლოო mRNA, ე.წ ეგზონები. ამ პროცესს ე.წ შერწყმა.

Პროცესში ალტერნატიული შერწყმაmRNA-ის სხვადასხვა ნაწილი შეიძლება შეირჩეს ეგზონებად გამოსაყენებლად. ეს საშუალებას აძლევს ორი (ან მეტი) mRNA მოლეკულის შექმნას ერთი პრე-მრნმ-ისგან.

სურათი 1. სურათი შეცვლილია “ევკარიოტული პოსტტრანსკრიპციული გენის რეგულაციებიდან” OpenStax College, ბიოლოგია (CC BY 3.0).

ალტერნატიული შერწყმა არ არის შემთხვევითი პროცესი. ამის ნაცვლად, ის ჩვეულებრივ კონტროლდება მარეგულირებელი ცილების მიერ. პროტეინები აკავშირებს სპეციფიკურ უბნებს პრე-მრნმ-ზე და “ უთხარით” შერწყმის ფაქტორებს, რომლებიც უნდა იქნას გამოყენებული ეგზონები. სხვადასხვა ტიპის უჯრედებს შეუძლიათ გამოხატონ სხვადასხვა მარეგულირებელი ცილები, ამიტომ სხვადასხვა ეგზონის კომბინაცია შეიძლება გამოყენებულ იქნას თითოეულ უჯრედულ ტიპში, რაც იწვევს სხვადასხვა ცილების წარმოებას.


1.4: დნმ-ის მოდიფიკაციის ფერმენტები

  • წვლილი მაიკლ ბლაბერმა
  • პროფესორი (ბიოსამედიცინო მეცნიერებები) ფლორიდის სახელმწიფო უნივერსიტეტში

მეთილაზები

ისევე, როგორც ბაქტერიული შეზღუდვა-მოდიფიკაციის სისტემის შესწავლამ უზრუნველყო სხვადასხვა სპეციფიკური ენდონუკლეაზები, ასევე ხელმისაწვდომია სხვადასხვა სპეციფიური დნმ მეთილაზა.

  • მეთილაზების ამოცნობის თანმიმდევრობა იგივეა, რაც ასოცირებული ენდონუკლეაზები (მაგ. EcoR1 მეთილაზა ამოიცნობს და მეთილაზებს მიმდევრობით "GAATTC").
  • ყველა მეთილაზა გადააქვს მეთილის ჯგუფს S-ადენოსილმეთიონინიდან (SAM) სპეციფიკურ ბაზაზე ამოცნობის თანმიმდევრობით და SAM არის აუცილებელი კომპონენტი მეთილაციის რეაქციაში.
  • დნმ-ის მეთილაცია ჩვეულებრივ მოქმედებს დნმ-ის დაცვასთან დაკავშირებული შეზღუდვის ენდონუკლეაზასგან. თუმცა, არსებობს მეთილაზები მინიმალური სპეციფიკურობით. Მაგალითად, Sss I მეთილაზა მოახდენს ციტოზინის ნარჩენების მეთილაციას 5' &hellip CG &hellip 3' თანმიმდევრობით. Ამ შემთხვევაში, მეთილირებული დნმ დაცული იქნება სხვადასხვა შეზღუდვის ენდონუკლეაზებისგან.
  • ზოგიერთი შეზღუდვის ენდონუკლეაზა ჭრის დნმ-ს მათ ამოცნობის ადგილებში მხოლოდ იმ შემთხვევაში, თუ დნმ არის მეთილირებული (მაგ. Dpn I).
  • შემცირდება სხვა შეზღუდვის ენდონუკლეაზები ორივე მეთილირებული და არამეთილირებული დნმ მათი ამოცნობის თანმიმდევრობით (მაგ. BamH I).

კაშხალი და dcm მეთილაცია

  • მეთილაზას მიერ კოდირებული კაშხალი გენი (დამ მეთილაზა) გადასცემს მეთილის ჯგუფს SAM-დან N-ში6 ადენინის ფუძის პოზიცია 5' &hellip GATC &hellip 3' მიმდევრობით.
  • მეთილაზას მიერ კოდირებული dcm გენი (dcm მეთილაზა) მეთილაციებს შიდა ციტოზინის ბაზას, C-ზე5 პოზიცია, მიმდევრობებში 5' &hellip CCAGG &hellip 3' და 5' &hellip CCTGG &hellip 3'.
  • თითქმის ყველა შტამი E. coli ჩვეულებრივ გამოიყენება კლონირებაში აქვს ა კაშხალი+dcm+ გენოტიპი. საქმე აქ არის არა რომ ჩვენ განსაკუთრებით გვინდა, რომ ჩვენი დნმ იყოს მეთილირებული, მაგრამ რომ მოხდეს ა კაშხალი-dcm- მასპინძელი ვინმემ უნდა მოახდინოს ბაქტერიების მუტაცია და სწორი მუტანტის იზოლირება. როგორც ჩანს, ეს არ გაკეთებულა მრავალი ბაქტერიული შტამისთვის. ალბათ იმიტომ, რომ კაშხალი და dcm მეთილაცია გავლენას ახდენს პოტენციური შეზღუდვის ენდონუკლეაზების მხოლოდ მცირე ქვეჯგუფზე

დნმ-ისგან იზოლირებული კაშხალი+dcm+ შტამების ფაქტიურად არ დაიჭრება ხელმისაწვდომი შეზღუდვის ენდონუკლეაზების მოკრძალებული ქვეჯგუფით:

ამოცნობის თანმიმდევრობა შეზღუდვის ფერმენტი GATC მომწერეთ ATC
TGATCA Bcl I + -
GATC მბო ი + -
ATCGAT Cla I + -
TCTAGA Xba I + -
TCGA ტაქ I + -
GAAGA მბო II + -
GGTGA Hph I + -

დნმ შეიძლება მომზადდეს E. coli შტამებისგან, რომლებიც არის dam-dcm-, რათა დაიჭრას ეს ფერმენტები.

დნმ პოლიმერაზები

პოლიმერაზების ფართო სპექტრი დახასიათებულია და კომერციულად ხელმისაწვდომია. ყველა დნმ პოლიმერაზას აქვს ორი ზოგადი მახასიათებელი:

  1. ისინი ამატებენ ნუკლეოტიდებს 3'-OH დასასრული პრაიმერის
  2. ახალშობილ პოლინუკლეოტიდში ნუკლეოტიდების რიგია მიმართულია შაბლონი

სურათი 1.4.1:დნმ-ის რეპლიკაცია

გარდა 5'->3' პოლიმერაზას აქტივობისა, პოლიმერაზები შეიძლება შეიცავდეს ეგზონუკლეაზას აქტივობას. ეს ეგზონუკლეაზას აქტივობა შეიძლება მიმდინარეობდეს ან 5'->3'მიმართულებით, ან 3'->5' მიმართულებით.

  • ეგზონუკლეაზას აქტივობა 3'->5' მიმართულებით საშუალებას აძლევს პოლიმერაზას გამოასწოროს შეცდომა, თუ ის შეიცავს არასწორ ნუკლეოტიდს (ე.წ.შეცდომის გამოსწორების აქტივობა"). მას ასევე შეუძლია ნელა დაქვეითდეს პრაიმერის 3' ბოლო.
  • ეგზონუკლეაზას აქტივობა 5'->3' მიმართულებით საშუალებას მისცემს მას დაქვეითდეს ნებისმიერი სხვა ჰიბრიდირებული პრაიმერი, რომელსაც შეიძლება შეხვდეს. 5'->3' ეგზონუკლეაზას აქტივობის გარეშე, ხელისშემშლელი პრაიმერები შეიძლება ფიზიკურად განადგურდეს ან არ იყოს, გამოყენებული პოლიმერაზას მიხედვით.

სხვადასხვა პოლიმერაზას აქვს არასწორი შეცდომის სიხშირე და პოლიმერიზაციის განსხვავებული სიხშირე.

E. coli დნმ პოლიმერაზა I E. coli დნმ პოლიმერაზა I - Klenow Fragment T4 დნმ პოლიმერაზა T7 დნმ პოლიმერაზა Taq დნმ პოლიმერაზა M-MuLV საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა
5'->3' ეგზონუკლეაზას აქტივობა * *
3'->5' ეგზონუკლეაზას აქტივობა * * * *
შეცდომის მაჩვენებელი (x10 -6) 9 40 <1 15 285
Strand გადაადგილება *
სითბოს ინაქტივაცია * * * *

პოლიმერაზების გამოყენება

სხვადასხვა პოლიმერაზების სხვადასხვა აქტივობა მათ მრავალფეროვან გამოყენებას აძლევს. მაგალითად, რესტრიქციულ ენდონუკლეაზებს შეუძლიათ წარმოქმნან დნმ-ის ფრაგმენტები 3' ან 5' ნუკლეოტიდურ "overhangs".

  • 5' გადახურვის შემთხვევაში, 5'->3' პოლიმერაზას აქტივობამ შეიძლება შეავსოს ისინი. ბლაგვი ბოლოები.
  • 3' გადახურვის შემთხვევაში, ზოგიერთ პოლიმერაზაში (განსაკუთრებით T4 დნმ პოლიმერაზაში) არსებული 3'->5' ეგზონუკლეაზას აქტივობა შეუძლია ამ ბოლოების "უკუღმა გადაღეჭვა" და ასევე ბლაგვი ბოლოებით დნმ-ის ფრაგმენტების შესაქმნელად.

სურათი 1.4.2:პოლიმერაზას აქტივობა

"ნიკ-თარგმანი"

ეს მეთოდი გამოიყენება მაღალრადიო მარკირებული ერთჯაჭვიანი დნმ-ის ფრაგმენტების მისაღებად, რომელიც იყენებს ზოგიერთ პოლიმერაზაში არსებულ 5'->3' ეგზონუკლეაზას აქტივობას.E. coli დნმ პოლიმერაზა I, მაგალითად).

  • ამ მეთოდით, ინტერესის მქონე დნმ-ის დუპლექსი არის "გაფორმებული" (ანუ ერთ-ერთი ჯაჭვი იჭრება იხილეთ დნმ-აზა I).
  • შემდეგ დნმ pol I ემატება რადიო მარკირებულ ნუკლეოტიდებთან ერთად. 5'->3' ეგზონუკლეაზას აქტივობა ღეჭავს 5' ბოლოს "ნიკის" ადგილზე და პოლიმერაზას აქტივობა აერთიანებს რადიო მარკირებულ ნუკლეოტიდებს. შედეგად მიღებული პოლინუკლეოტიდი იქნება ძალიან რადიოეტიკეტირებული და ჰიბრიდიზდება საინტერესო დნმ-ის თანმიმდევრობასთან.

სურათი 1.4.3:ნიკა-თარგმანი

  • თერმოსტაბილურ პოლიმერაზებს აქვთ უნარი დარჩნენ ფუნქციონალური ტემპერატურის დიაპაზონში, სადაც დნმ-ის დუპლექსი რეალურად "დნება" და დაშორდება. ამან საშუალება მისცა განვითარების "პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია" ტექნიკა (PCR), რომელმაც ღრმა გავლენა მოახდინა თანამედროვე ბიოტექნოლოგიაზე. ამ მეთოდს მოგვიანებით განვიხილავთ.
  • დიდოქსი ფუძეების (ანუ რიბოზა შაქრის 2' ან 3' ნახშირბადზე ჰიდროქსილის ჯგუფების არარსებობა) იწვევს პოლიმერაზული რეაქციის შეწყვეტა. ეს უფრო დეტალურად მოგვიანებით იქნება განხილული. თუმცა, ეს ჯაჭვის შეწყვეტა დიდოქსინუკლეოტიდების ინკორპორირებით არის დნმ-ის თანმიმდევრობის Sanger მეთოდის საფუძველი, ისევე როგორც თერაპიები ვირუსის რეპლიკაციის დათრგუნვის მიზნით.

ნუკლეაზები

ნუკლეაზა BAL-31

  • Ეს არის ეგზონუკლეაზა (იწყება ბოლოდან და მუშაობს შიგნით), რომელიც ანადგურებს ორჯაჭვიანი დნმ-ის 3' და 5' ბოლოებს. ის არ მოახდენს შიდა გახლეჩვას ("nicks"), თუმცა, ის დაარღვევს დნმ-ის ბოლოებს არსებულ შიდა "quotნიკებზე" (რომლებიც ქმნიან 3' და 5' ბოლოებს).
  • ბოლოების დეგრადაცია არ არის კოორდინირებული, რაც იმას ნიშნავს, რომ პროდუქტი არის არა 100% ბლაგვი ბოლოები (მიუხედავად იმისა, რომ თავდაპირველი დუპლექსი შესაძლოა ბლაგვი ბოლო იყო).
  • ასეთი "მოხვეული" ბოლოები შეიძლება ბლაგვი გახდეს შესაბამისი პოლიმერაზის (მაგ. T4 დნმ პოლიმერაზა) შევსებით და ღეჭვით. 1 ერთეულის ერთეული განმარტება არის ფერმენტის რაოდენობა, რომელიც საჭიროა 200 ბაზის წყვილის ამოსაღებად დუპლექსის დნმ-ის თითოეული ბოლოდან 10 წუთში 30 &°C ტემპერატურაზე.

სურათი 1.4.4:ნუკლეაზა BAL-31 აქტივობა

ეგზონუკლეაზა III

  • ახდენს ნუკლეოტიდების ეტაპობრივ მოცილებას დუპლექსის დნმ-ის 3' ჰიდროქსილის ბოლოებიდან.
  • ფერმენტი თავს დაესხმება 3' ჰიდროქსილს დუპლექსის დნმ-ზე ბლაგვი ბოლოებით, 5' გადახურვით ან შიდა "კვოტებით".
  • ვინაიდან საჭიროა დუპლექსური დნმ, ფერმენტი არ დნმ-ის დუპლექსის მე-3 დასასრულის მონელება, სადაც ბოლოები 3' გადახურულია.

სურათი 1.4.5:ეგზონუკლეაზა III აქტივობა

Mung Bean Nuclease (იზოლირებული mung ლობიოდან)

  • ცალკეული ღერო სპეციფიკური დნმ და რნმ ენდონუკლეაზა, რომელიც ანადგურებს დნმ-ისა და რნმ-ის ბოლოებიდან ერთჯაჭვიან გაფართოებებს და ტოვებს ბლაგვი ბოლოებს.
  • ერთი სტრიქონის გაფართოება შეიძლება იყოს 5' ან 3' გაფართოება - ორივე ამოღებულია და ბლაგვი დუპლექსი რჩება.

სურათი 1.4.6:Mung Bean Nuclease აქტივობა

დეოქსირიბონუკლეაზა I (დნმ I) მსხვილფეხა რქოსანი პანკრეასიდან

  • ეს ფერმენტი ჰიდროლიზებს დნმ-ის დუპლექს ან ცალკეულ ძაფებს უპირატესად ფოსფოდიესტერულ ბმებზე 5'-მდე პირიმიდინი ნუკლეოტიდები
  • Mg 2+ იონის თანდასწრებით, დნმ-აზა I თავს ესხმის თითოეულ ჯაჭვს დამოუკიდებლად და წარმოქმნის ნიკებს შემთხვევითი გზით (გამოყენებულია ნიკის თარგმნისთვის)
  • Mn2+ იონური დნმ-აზას თანდასწრებით, I წყვეტს დნმ-ის ორივე ჯაჭვს დაახლოებით ერთსა და იმავე პოზიციაზე (მაგრამ ტოვებს „კვოტაჟირებულ“ ბოლოებს)

ლიგაზები

  • ლიგაზები კატალიზაციას ახდენენ ფორმირება ფოსფოდიესტერული ბმა ნუკლეოტიდების შეთავსებულ 5'ფოსფატსა და 3'ჰიდროქსილის ბოლოებს შორის (პოტენციურად რნმ ან დნმ დამოკიდებულია ლიგაზაზე).
  • გარკვეული გაგებით, ისინი საპირისპიროა რესტრიქციული ენდონუკლეაზების, მაგრამ არ ჩანს, რომ მათზე გავლენას ახდენს ადგილობრივი თანმიმდევრობა, თავისთავად.
  • ლიგაზები მოითხოვს ან rATP ან NAD+ როგორც კოფაქტორიდა ეს ეწინააღმდეგება შეზღუდვის ენდონუკლეაზებს.

ქვემოთ მოცემულია ლიგაზების სხვადასხვა ტიპები და მათი მახასიათებლები.

T4 დნმ ლიგაზა

  • იზოლირებულია ბაქტერიოფაგ T4-დან.
  • დააკავშირებს დუპლექსის დნმ-ის ან რნმ-ის ბოლოებს.
  • ეს ფერმენტი შეუერთდება ბლაგვი ბოლო ბოლოებს, ისევე როგორც მთავრდება შეკრული (დამატებითი) გადაკიდებული ბოლოებით (ან 3' ან 5' დამატებითი გადახურვები).
  • ეს ფერმენტი ასევე აღადგენს დნმ-ის, რნმ-ის ან დნმ/რნმ-ის დუპლექსების ერთჯაჭვიან ნიკებს. მოითხოვს ATP როგორც კოფაქტორი.

Taq დნმ ლიგაზა

  • ეს ლიგაზა ახდენს ფოსფოდიესტერული კავშირის კატალიზებას ორ მიმდებარე ოლიგონუკლეოტიდს შორის, რომლებიც ჰიბრიდირებულია დნმ-ის დამატებით ჯაჭვთან:

სურათი 1.4.7:Taq დნმ ლიგაზას აქტივობა

  • ლიგირება ეფექტურია მხოლოდ იმ შემთხვევაში, თუ ოლიგონუკლეოტიდები იდეალურად ჰიბრიდირებულია შაბლონის ძაფთან.
  • ფერმენტი აქტიურია შედარებით მაღალ ტემპერატურაზე (45 - 65 & °C). მოითხოვს NAD+ როგორც კოფაქტორი.

T4 რნმ ლიგაზა

  • რნმ/რნმ ოლიგონუკლეოტიდებს, რნმ/დნმ ოლიგონუკლეოტიდებს ან დნმ/დნმ ოლიგონუკლეოტიდებს შორის კატალიზატორი იქნება ფოსფოდიესტერული ბმის წარმოქმნა.
  • მოითხოვს ATP როგორც კოფაქტორი.
  • ეს ფერმენტი არ საჭიროებს შაბლონის ძაფს.

T4 რნმ ლიგაზა შეიძლება გამოყენებულ იქნას სხვადასხვა მიზნებისთვის, მათ შორის რნმ/დნმ ჰიბრიდული მოლეკულების შესაქმნელად.

სურათი 1.4.8:T4 რნმ ლიგაზას აქტივობა

დნმ ლიგაზა (E. coli)

  • ახდენს ფოსფოდიესტერული კავშირის კატალიზებას დუპლექს დნმ-ს შორის შეკრული ბოლოების შემცველი.
  • Ეს იქნება არა ბლაგვი ბოლო ფრაგმენტების ეფექტურად ლიგირება.
  • მოითხოვს NAD+ როგორც კოფაქტორი.

სურათი 1.4.9:დნმ ლიგაზას (E. Coli) აქტივობა

T4 პოლინუკლეოტიდური კინაზა

  • აკატალიზებს ფოსფატის ჯგუფის გადაცემას და გაცვლას rATP-ის (ადენინ რიბოზა ტრიფოსფატის ნუკლეოტიდი) პოზიცია ორჯაჭვიანი და ერთჯაჭვიანი დნმ-ის ან რნმ-ის 5' ჰიდროქსილის ბოლოში, და ნუკლეოზიდი 3' მონოფოსფატები.
  • ფერმენტი ასევე ამოიღებს 3' ფოსფორილ ჯგუფს.
  • ოლიგონუკლეოტიდებს, რომლებიც მიიღება ავტომატური სინთეზატორებიდან, არ გააჩნიათ 5' ფოსფატური ჯგუფი და, შესაბამისად, არ შეიძლება იყოს ლიგირებული სხვა პოლინუკლეოტიდებთან..

T4 პოლინუკლეოტიდური კინაზა შეიძლება გამოყენებულ იქნას ასეთი პოლინუკლეოტიდების 5' ბოლოების ფოსფორილირებისთვის:

სურათი 1.4.10:T4 პოლინუკლეოტიდური კინაზას აქტივობა


სარგებელი

  • მაღალი სისუფთავე (>99%) HPLC-ის მიხედვით (Ფიგურა 1)
  • თავისუფალი DNase, RNase და qPCR, PCR და RT ინჰიბიტორებისგან
  • სტაბილურია 3 წლის განმავლობაში -20 o C ტემპერატურაზე
  • ხელმისაწვდომია საბაჟო ფორმულირებით და კომერციული მიწოდებისთვის


ხარისხის ტესტირება დაგეხმარებათ უზრუნველყოთ dNTP-ების ან NTP-ების განსაკუთრებული შესრულება თქვენს მოლეკულურ ბიოლოგიურ ექსპერიმენტებში. შეფასებები ხდება მთელი რიგი ანალიტიკური მეთოდების გამოყენებით (ცხრილი 1 სურათი 1).

ცხრილი 1. ხარისხობრივი პარამეტრები და სპეციფიკაციები

Პარამეტრიტესტებისპეციფიკაცია
ფიზიკურიკონცენტრაცია100 + 3 მმ
გარეგნობაგამჭვირვალე, უფერო ხსნარი
pH მნიშვნელობა7.3-7.5
სტაბილურობა -20 o C-ზე36 თვე
HPLCdNTP> 99% სისუფთავე
NTP> 99% სისუფთავე
პიროფოსფატი< 0.003 pmol PPi/pmol dNTP
ფუნქციონალურიDNase, RNase და ნიკირების აქტივობა არ არის გამოვლენილი
ბაქტერიული დნმ (qPCR, ე.კოლი 23S rRNA)არ არის გამოვლენილი
ადამიანის დნმ-ის დაბინძურება (qPCR, ადამიანის gDNA)არ არის გამოვლენილი

სურათი 1. ≥99% სუფთა dNTP-ების შედარებითი HPLC პროფილები. HPLC ანალიზი გვიჩვენებს 99%-ზე მეტ ტრიფოსფატის სისუფთავეს შეუცნობელი მონო-, დი- და ტეტრაფოსფატური ფორმებით.


პროდუქტები და შეკვეთა

[1] ტავერნიე და სხვ. (2011) mRNA, როგორც გენის თერაპიული საშუალება: როგორ გავაკონტროლოთ ცილის ექსპრესია. კონტროლირებადი დაავადების ჟურნალი 150:238.
[2] კარიკო და სხვ. (2011) თერაპიისთვის ოპტიმალური mRNA-ს გენერირება: HPLC გამწმენდი გამორიცხავს იმუნურ აქტივაციას და აუმჯობესებს ნუკლეოზიდით მოდიფიცირებული, პროტეინის კოდირებადი mRNA-ს ტრანსლაციას. Nuclei Acids Res. 39 (21):9329.
[3] პასკოლო და სხვ. (2006) ვაქცინაცია მესინჯერ რნმ-ით. In: მეთოდები მოლეკულურ მედიცინაში 127 (სოლცმანი). ჰუმანა პრესა.
[4] კორმანი და სხვ. (2011) თერაპიული ცილების გამოხატვა ქიმიურად მოდიფიცირებული mRNA-ს მიწოდების შემდეგ თაგვებში. ბუნება ბიოტექნოლოგია 29 (2):154.
[5] კარიკო და სხვ. (2008) ფსევდოურიდინის ინკორპორაცია mRNA-ში იძლევა უმაღლეს არაიმუნოგენურ ვექტორს გაზრდილი ტრანსლაციის უნარით და ბიოლოგიური სტაბილურობით. მოლ. იქ. 16 (11):1833.
[6] კარიკო და სხვ. (2005) რნმ-ის ამოცნობის ჩახშობა Toll-ის მსგავსი რეცეპტორებით: ნუკლეოზიდის მოდიფიკაციის გავლენა და რნმ-ის ევოლუციური წარმოშობა. იმუნიტეტი 23:165.
[7] ანდერსონი და სხვ. (2011) ნუკლეოზიდის მოდიფიკაციები რნმ-ში ზღუდავს 2'-5'-ოლიგოადენილატ სინთეტაზას აქტივაციას და ზრდის წინააღმდეგობას რნმ-აზა L-ის მიერ დაშლის მიმართ. Nuclei Acids Res. 39 (21):9329.
[8] უორენი და სხვ. (2011) უაღრესად ეფექტური რეპროგრამირება პლურიპოტენციამდე და ადამიანის უჯრედების მიმართული დიფერენციაცია სინთეზური მოდიფიცირებული mRNA-ით. უჯრედის ღეროვანი უჯრედი 7:618.
[9] ენდიები და სხვ. (2015) N (1)-მეთილფსევდოურიდინით ინკორპორირებული mRNA აღემატება ფსევდოურიდინით ინკორპორირებულ mRNA-ს პროტეინის გაძლიერებული ექსპრესიის და შემცირებული იმუნოგენურობის უზრუნველყოფით ძუძუმწოვრების უჯრედულ ხაზებსა და თაგვებში. J. კონტროლი. გათავისუფლება 217:337.
[10] ლი და სხვ. (2016) ქიმიურად მოდიფიცირებული მესენჯერის რნმ-ის ეფექტი ცილის ექსპრესიაზე ბიოკონიუგატი ქიმ. 27 (3):849.


5. CAP EPITRANSCRIPTOME-ის რუკების შედგენა

5.1. m 7 G და Nმ გაფართოებულ mRNA თავსახურში

მიუხედავად იმისა, რომ ბოლოდროინდელი ინტერესი ეპიტრანსკრიპტომიკაში ფოკუსირებულია მოდიფიცირებულ ნუკლეოტიდებზე, რომლებიც მდებარეობს შიდა უბნებზე (ანუ mRNA თავსახურსა და პოლი(A) კუდს შორის), რნმ-ის მოდიფიკაციის დონე მნიშვნელოვნად მაღალია mRNA ქუდზე შიდა უბნებთან შედარებით. m6 A-ს გარდა, mRNA-ში არის ოთხი სხვა უხვი მეთილის მოდიფიკაცია. ეს არის N-7 მეთილი m 7 G თავსახურში, ორი 2′--მეთილის მოდიფიკაციები, რომლებიც გვხვდება პირველ და მეორე შაბლონიან ნუკლეოტიდებში და 6-მეთილი, რომელიც გვხვდება 2′-თან ერთად-მეთილი მ 6 ა-ში რომელიც გვხვდება პირველ შაბლონურ ნუკლეოტიდზე. ერთად, ეს მეთილის ნიშნები მოიცავს mRNA-ის ხუთ ძირითად მეთილის მოდიფიკაციას.

ჯერჯერობით, არ არის მოხსენებული ტრანსკრიპტომის მასშტაბური ანალიზი მეთილის მოდიფიკაციისთვის m 7 G თავსახურში ან 2′--მეთილის მოდიფიკაციები პირველ და მეორე შაბლონიან ნუკლეოტიდებზე. მიუხედავად ამისა, არსებობს მტკიცებულება, რომ ეს ცვლილებები შეიძლება დარეგულირდეს. m 7 G-ის შემთხვევაში, ფერმენტი, რომელიც მეთილირებს გუანოზინს 7-მეთილგუანოზინი, RNMT, რეგულირდება კიბოს დროს და RNMT-ის გადაჭარბებული გამოხატვა ხელს უწყობს კიბოს განვითარებას (Cowling 2010a, 2010b). ეს ვარაუდობს, რომ ნორმალურ პირობებში, ზოგიერთი mRNA არ არის ეფექტურად მეთილირებული, რათა შეიქმნას m 7 G ქუდი, და RNMT-ის ექსპრესია საშუალებას აძლევს ამ mRNA-ებს მომწიფდეს და მიიღონ სრულად ფუნქციონალური m 7 G ქუდი. იმის გამო, რომ m 7 G ქუდი საჭიროა mRNA ბირთვული ექსპორტისთვის (Inesta-Vaquera and Cowling 2017), არამეთილირებული გუანოზინით დაფარული mRNA შეიძლება დარჩეს ბირთვში ან დეგრადირებული იყოს.

თავსახურთან დაკავშირებული 2′--მეთილის მოდიფიკაციები ასევე შეიძლება დარეგულირდეს. უნდა აღინიშნოს, რომ ზოგიერთ mRNA-ს შეიძლება არ ჰქონდეს 2′-- მეთილის მოდიფიკაციები საერთოდ. ამ mRNA-ებს მოიხსენიებენ, როგორც cap 0. სხვა mRNA-ებს შეიძლება ჰქონდეთ მხოლოდ 2′--მეთილის მოდიფიკაცია პირველ კოდირებულ ნუკლეოტიდზე, მაგრამ არა მეორეზე (მოხსენიებული როგორც �p 1”). ეს 2′--მეთილის მოდიფიკაცია დაინსტალირებულია CMTR1-ით, რომელიც საჭიროებს m 7 G-დახურულ რნმ-ს, როგორც სუბსტრატს (Bélanger et al. 2010 Inesta-Vaquera and Cowling 2017). CMTR1 ფიზიკურად ასოცირდება რნმ Pol II-თან (Haline-Vaz et al. 2008), რაც ვარაუდობს, რომ ეს მოდიფიკაცია შეიძლება კოტრანსკრიპციულად იყოს შეყვანილი mRNA-ში.

mRNA-ებს ასევე შეიძლება ჰქონდეთ როგორც პირველი, ასევე მეორე ტრანსკრიფირებული ნუკლეოტიდი მეთილირებული 2′-ჰიდროქსილზე, რომელიც მოიხსენიება როგორც cap 2 (Furuichi et al. 1975). mRNA-ებს სავარაუდოდ არ ექნებათ მხოლოდ მეორე შაბლონიანი ნუკლეოტიდი 2′--მეთილირებული, რადგან CMTR2, ფერმენტი, რომელიც შემოაქვს 2′--მეთილი მეორე ნუკლეოტიდზე აჩვენებს მეთილტრანსფერაზას გაზრდილ აქტივობას დახურული mRNA-ს მიმართ 2′--მეთილი პირველ ნუკლეოტიდზე (Werner et al. 2011).

2′-ის ერთი ძირითადი ფუნქცია-მეთილაცია არის ის, რომ ამ მოდიფიკაციამ შეიძლება ხელი შეუწყოს ანტივირუსული თავდაცვის გზას. ვირუსული ინფექცია დაკავშირებულია CMTR1-ის ინდუქციასთან, რომელიც გარდაქმნის cap 0 RNA-ს cap 1-ად და პოტენციურად cap 2 mRNA-დ (Daffis et al. 2010 Züst et al. 2011). 2′--ის არსებობა-მეთილის მოდიფიკაციები ხელს უშლის ამ mRNA-ებს IFIT ცილების შეკავშირებაში, რომლებიც ინდუცირებულია ინტერფერონის მიერ ვირუსული ინფექციის საპასუხოდ (Fensterl and Sen 2015). IFIT-ები აკავშირებენ თავიანთ სამიზნე mRNA-ებს გაფართოებულ ქუდის სტრუქტურაზე და თრგუნავენ ტრანსლაციას, კონკურენციას უწევენ თავსაბურავის შემაკავშირებელ ცილებს (Habjan et al. 2013 Kimura et al. 2013). ამრიგად, 2′--მეთილაცია იცავს მასპინძელი mRNA-ს ანტივირუსული პასუხისგან, რომელიც განკუთვნილია ვირუსული რნმ-ისკენ მიმართული.

თუმცა, 2′--მეთილაცია უჯრედებში ვლინდება ვირუსული ინფექციის არარსებობის შემთხვევაშიც და cap 1 და cap 2 დონეები, როგორც ჩანს, განსხვავდება უჯრედებს შორის (Furuichi et al. 1975). ამრიგად, 2′-- მეთილაცია თავსახურზე შეიძლება ჰქონდეს ფუნქციები ვირუსული ინფექციის არარსებობის შემთხვევაშიც კი. ჯერჯერობით, 2′--ის განაწილება-მეთილის მოდიფიკაციები, რომლებიც დაკავშირებულია mRNA ქუდებთან, არ არის გამოსახული ტრანსკრიპტომში.

5.2. m 6 am

ერთადერთი ქუდთან დაკავშირებული მეთილაცია, რომელიც პროფილირებულია ტრანსკრიპტომის მასშტაბით, არის m 6 Am. m 6 Am ერთდროულად აისახება m 6 A-სთან m 6 A miCLIP პროტოკოლში (აღწერილი ზემოთ), რომელიც იყენებს m 6 A ანტისხეულს. m 6 A ანტისხეულები ასევე აკავშირებს m 6 Am-ს (Munns et al. 1979) და, შესაბამისად, უფრო ზუსტად არის აღწერილი, როგორც 6-მეთილადენინის ანტისხეულები, რათა აისახოს მათი შეკავშირება 6-მეთილადენინის შემცველ ორ ნუკლეოტიდთან, m 6 A და m 6 Am.

miCLIP-ის განვითარებამდე m 6 A და m 6 Am ვერ გამოირჩეოდა. ამიტომ 5′ UTR-ში ნაპოვნი MeRIP-seq მწვერვალები არ შეიძლება ადვილად მინიჭებული იყოს, როგორც m 6 A ან m 6 Am. სავარაუდოა, რომ MeRIP-seq პიკის მდებარეობა 5′ UTR-ში შეიძლება მიუთითებდეს, რომ ის ასახავს m 6 A-ს და არა m 6 Am-ს, რომელიც ექსკლუზიურად გვხვდება ტრანსკრიფციის დაწყების ნუკლეოტიდში. 5′ UTR-ის შუაში პიკი აშკარად არ არის ტრანსკრიფციის დაწყების ნუკლეოტიდზე. სამწუხაროდ, ეს მსჯელობა არ არის მართებული. ბევრ ტრანსკრიპტს აქვს ტრანსკრიფციის დაწყების ალტერნატიული ადგილები, რომელთაგან ზოგიერთი შეიძლება იყოს ანოტირებული ტრანსკრიფციის დაწყების საიტებიდან (შირაკი და სხვ. 2003). მაშასადამე, m 6 Am იზოფორმიდან უფრო მოკლე 5′ UTR, ვიდრე ანოტირებული 5′ UTR იზოფორმა წარმოქმნის პიკს, რომელიც, როგორც ჩანს, არის ანოტირებული 5′ UTR-ის შუაში, მიუხედავად იმისა, რომ ის მდებარეობს სხვადასხვა mRNA იზოფორმის ტრანსკრიფციის დაწყების ადგილი.

MeRIP-seq-ში რნმ-ის ფრაგმენტები იმუნოპრეციპიტაციით ხდება და რნმ-ის საპირისპირო ტრანსკრიბცია ხდება cDNA-ს პირველი ჯაჭვის შესაქმნელად. შემდეგ, cDNA-ს მეორე ჯაჭვი მზადდება რნმ-ის ნიკაპის და დნმ-ის სინთეზის პრაიმერის სახით თავისუფალი ბოლოს გამოყენებით. ამ პროტოკოლში, რნმ-ის 5′ ბოლო არ არის დაცული, რადგან cDNA-ის მეორე ჯაჭვი იწყება გარკვეულწილად შემთხვევით, ნიკის პოზიციიდან გამომდინარე.

m 6 A-ს შემთხვევაში, 5′ ბოლოების შენარჩუნების ნაკლებობა არ არის მნიშვნელოვანი, რადგან m 6 A შეიძლება იყოს სადმე იმუნოპრეციპიტირებულ რნმ-ში. ამიტომ, m 6 A კვლავ იქნება მიღებული მწვერვალის შუაში. თუმცა, m 6 Am-ისთვის რნმ-ის ფრაგმენტები განსხვავებული იქნება— თითოეულ შემთხვევაში, m 6 Am ყოველთვის იქნება ზუსტად რნმ-ის 5′ ბოლოზე. აქედან გამომდინარე, 5′ დასასრულის დაკარგვა ნიშნავს, რომ MeRIP-seq განლაგდება m 6 Am-ის რეალური ადგილიდან ქვემოთ. მწვერვალი ჰგავს m 6 A მწვერვალს m 6 Am-ის რეალური ადგილიდან ქვემოთ.

miCLIP გადალახავს ამ პრობლემას იმუნოპრეციპიტაციური რნმ-ების ზუსტი 5′ ბოლოების შენარჩუნებით. იმის გამო, რომ ყველა წაკითხულს, რომელიც შეიცავს m 6 Am-ს, ექნება იგივე 5′ დასასრული (ანუ, ტრანსკრიფციის საწყისი ნუკლეოტიდი), ეს გამოიწვევს 𠇌liff” ან კიდეს, რომელიც მკაფიოდ ზღუდავს m 6 Am-ის პოზიციას. ბიბლიოთეკის მეთოდები, რომლებიც ინარჩუნებენ რნმ-ის 5′ ბოლოს, ამცირებს მწვერვალის მინიჭების გაურკვევლობას m 6 A ან m 6 Am.

m 6 Am-ის miCLIP-ის გამოყენებით რუკაზე დაყრდნობით, m 6 Am-ის ფუნქცია შეიძლება გამოვლინდეს. ჩვენმა ანალიზმა აჩვენა, რომ m6 Am-ის შემცველი mRNA-ები უფრო მეტ რნმ-ის ნახევარგამოყოფას აჩვენებენ, ვიდრე mRNA-ები, რომლებიც იწყება სხვა ნუკლეოტიდებით. m6 Am-ის სტაბილურობა, როგორც ჩანს, ნაწილობრივ მაინც განპირობებულია m6 Am-ის შემცველი mRNA-ების დაშლისადმი შემცირებული მგრძნობელობით. m6 Am-ის შემცველი რნმ-ების ბიოქიმიურმა ანალიზმა აჩვენა, რომ ისინი ამოღებულია Dcp2 გამანადგურებელი ფერმენტით, შესამჩნევად შემცირებული ეფექტურობით მსგავს რნმ-ებთან შედარებით, რომლებიც შეიცავდნენ Am-ს. ამრიგად, N-6 მეთილის ერთჯერადი მოდიფიკაცია იწვევს რნმ-ის დაქვეითებას. აღსანიშნავია, რომ m 6 Am mRNA-ები ასევე აჩვენებენ შემცირებულ მგრძნობელობას მიკრორნმ-ების მიმართ, რომლებიც იწვევენ დაშლის საფეხურს, როგორც რნმ-ის დეგრადაციის გამოწვევის მექანიზმის ნაწილი. ამრიგად, m 6 Am შეიძლება ჰქონდეს როლი mRNA-ების სტაბილიზაციაში.

ამჟამად, ფერმენტი, რომელიც აყალიბებს m 6 Am-ს Am-დან, ბიოქიმიურად არის გაწმენდილი (Keith et al. 1978), მაგრამ ჯერ არ არის კლონირებული. ამ ფერმენტის იდენტიფიკაცია საშუალებას მისცემს mRNA-ში ამ მოდიფიკაციის ფუნქციის უფრო ყოვლისმომცველ ანალიზს. გარდა ამისა, m 6 Am-ის “readers” ჯერ არ არის ცნობილი, მაგრამ მათ შეუძლიათ წვლილი შეიტანონ m 6 Am-ის შუამავლობით ტრანსლაციის გაძლიერების მექანიზმში ან m 6 Am-ის სხვა ეფექტებში.


თავისუფალი ნუკლეოტიდების მოდიფიკაციები - ბიოლოგია

A "რიბონუკლეოზიდი", A "დეოქსირიბონუკლეოზიდი", A "რიბონუკლეოტიდი"

ნუკლეოტიდის წარმოებულები :

ნახშირწყლების მეტაბოლიზმში ბევრი ბიოსინთეზური რეაქცია მოითხოვს ნუკლეოტიდის წარმოებულებს.

ანუ გლუკოზა-1-ფოსფატი + ATP ----> ADP-გლუკოზა

ნუკლეოტიდების სტრუქტურა

ნუკლეინის მჟავების ძირითადი სტრუქტურა:

ნუკლეოტიდების თანმიმდევრობა ან რიგი განსაზღვრავს დნმ-ისა და რნმ-ის პირველად სტრუქტურას. პოლიმერის ნუკლეოტიდები დაკავშირებულია ფოსფოდიესტერული ბმებით, რომლებიც აკავშირებენ ჟანგბადის 5' ნახშირბადის ჟანგბადს მეორის 3' ნახშირბადის ჟანგბადთან. ჟანგბადის და აზოტის ატომები ხერხემალში იძლევა დნმ-ს და რნმ-ს "პოლარობას".

ნუკლეინის მჟავების მეორადი სტრუქტურა:

პურინის ბაზა ყოველთვის წყვილდება პირიმიდინის ბაზასთან ან უფრო კონკრეტულად გუანოზინთან (G) ციტოზინთან (C) და ადენინთან (A) თიმინთან (T) ან ურაცილთან (U).

გაითვალისწინეთ, რომ G-C წყვილს აქვს სამი წყალბადის ბმა, ხოლო A-T წყვილს აქვს ორი წყალბადის ბმა.

დნმ: დნმ-ის მეორადი სტრუქტურა შედგება ორი პოლინუკლეოტიდური ჯაჭვისგან, რომლებიც ერთმანეთზეა გახვეული ორმაგი სპირალის შესაქმნელად. სპირალის ორიენტაცია, როგორც წესი, მარჯვნივ არის ორი ჯაჭვი, რომელიც ერთმანეთის ანტიპარალელურად მოძრაობს.

თითოეულ ჯაჭვზე ფუძეების თანმიმდევრობა განლაგებულია ისე, რომ ერთ ჯაჭვზე ყველა ფუძე წყვილდეს მეორე ჯაჭვზე ყველა ფუძესთან, ანუ გუანოზინების რაოდენობა ყოველთვის უდრის ციტოზინების რაოდენობას და ადენინების რაოდენობა ყოველთვის თიმინების რაოდენობას. .

ორმაგ სპირალზე არის ორი ღარი, ერთი ძირითადი და ერთი მცირე. პროტეინები და წამლები ურთიერთქმედებენ ფუნქციურ ჯგუფებთან ღარებში გამოვლენილ ბაზებზე.

დნმ-ის სტრუქტურული ფორმები შეიძლება განსხვავდებოდეს ოთხ ასპექტში: „კვოტობა“ (მარჯვნივ ან მარცხნივ), სპირალის შემობრუნების სიგრძე, ფუძის წყვილების რაოდენობა თითო შემობრუნებაზე და ზომებში განსხვავება დიდ და მცირე ღარებს შორის. დნმ-ის ყველაზე გავრცელებული სტრუქტურული ფორმა არის B- ფორმა.

რნმ-ის მეორადი სტრუქტურა შედგება ერთი პოლინუკლეოტიდისგან. რნმ შეიძლება დაიკეცოს ისე, რომ ბაზის დაწყვილება მოხდეს კომპლემენტარულ რეგიონებს შორის. რნმ-ის მოლეკულები ხშირად შეიცავს როგორც ერთჯაჭვიან, ისე ორჯაჭვიან რეგიონებს. ძაფები ანტიპარალელურია და ხვდება სპირალურ ფორმას. ხვეულები A- ფორმისაა (იხ. ზემოთ).

t (ტრანსფერული) და r (რიბოსომური) რნმ-ის სტრუქტურა შედგება მრავალი, ერთჯაჭვიანი, ღეროვანი მარყუჟის სტრუქტურებისგან. ღეროები შედგება სპირალებისგან, რომლებიც წარმოიქმნება რნმ-ის შიგნით დამატებითი რეგიონების ბაზის დაწყვილებით. tRNA და rRNA-ს მეორადი სტრუქტურა მნიშვნელოვანია მათი ბიოლოგიური ფუნქციებისთვის, mRNA ასევე იღებს მეორადი სტრუქტურის გარკვეულ ხარისხს, მაგრამ არა იმავე ზომით, როგორც tRNA და rRNA.

ქიმიური მოდიფიკაცია:

დნმ-ისა და რნმ-ის ზოგიერთი ფუძე შეიძლება ქიმიურად შეიცვალოს მეთილაციის გზით. პროტეაზების მსგავს ფერმენტებს, რომლებსაც ეგზო- და ენდო-ნუკლეაზებს უწოდებენ, შეუძლიათ რნმ-ისა და დნმ-ის დაშლა. ეგზონუკლეაზები წყვეტენ ნუკლეინის მჟავებს ბოლოებიდან. ენდონუკლეაზები ამოიცნობს დუპლექსის დნმ-ის სპეციფიკურ თანმიმდევრობას და იშლება კონკრეტულ ადგილას აღიარებული თანმიმდევრობის შიგნით ან მის მახლობლად. მიმდევრობები, რომლებიც აღიარებულია, მერყეობს ოთხიდან რვა ბაზის წყვილამდე. შედეგად მიღებული ფრაგმენტები შეიძლება შეუერთდეს სხვა ფრაგმენტებს დნმ-ის თანმიმდევრობების ახალი კომბინაციების შესაქმნელად.

დნმ შეიძლება დენატურირებული იყოს ცალკეულ ძაფებად და ხელახლა დაბრუნდეს ორმაგ სპირალში. შექცევადი დენატურაცია აუცილებელია რეპლიკაციისა და ტრანსკრიფციის ბიოლოგიური პროცესებისთვის და მოლეკულური ბიოლოგიური ტექნიკისთვის, როგორიცაა სამხრეთის ბლოტი და პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციები (PCR's). დნმ-ის დენატურაციის სამი გზა არსებობს: ფერმენტულად, ქიმიურად ან სითბოთი. დნმ-ის დენატურაცია სითბოს საშუალებით შეიძლება განხორციელდეს 260 ნმ ტალღის სიგრძეზე დაყენებული სპექტროფოტომეტრით. შთანთქმა იზრდება სითბოს მატებასთან ერთად, არღვევს წყალბადის ობლიგაციებს, რომლებიც ატარებენ ძაფებს, იშლება და ავლენს ბაზებს. ამ ეფექტს ჰიპერქრომული ეფექტი ეწოდება. ტემპერატურას, რომლის დროსაც დნმ-ის 50% დენატურირებულია, ეწოდება დნობის ტემპერატურა ან T. იმის გამო, რომ GC ბაზის წყვილები შენარჩუნებულია სამ წყალბადურ ბმასთან (AT აქვს მხოლოდ ორი), რაც უფრო მაღალია GC ბაზის წყვილების პროცენტი, მით უფრო მაღალია T. საჭიროა დნმ-ის დნობისთვის.

იმისათვის, რომ მოხდეს რენატურაცია, დნმ-ის ორი ჯაჭვი უნდა დაუკავშირდეს ერთმანეთს ბაზის დაწყვილების დასაწყებად. როგორც კი ეს მოხდება, ორი ძაფი სწრაფად უერთდება მთელ სიგრძეს. რამდენიმე რამ გავლენას ახდენს რენატურაციაზე: სირთულე, დნმ-ის კონცენტრაცია, კათიონის კონცენტრაცია და ტემპერატურა. კათიონები, როგორიცაა ნატრიუმი, კალიუმი და მაგნიუმი, ამცირებს დნმ-ის ორი ჯაჭვის უარყოფითად დამუხტული ფოსფატის ხერხემლის ინტერმოლეკულურ მოგერიებას. რენატურაცია მოხდება მხოლოდ იმ შემთხვევაში, თუ ტემპერატურა Tm-ზე დაბალია, თუმცა თუ ტემპერატურა ძალიან დაბალია, რენატურაციის სიჩქარე შემცირდება. კვლევებმა აჩვენა, რომ ძუძუმწოვრების რენატურების დნმ-ის უმეტესობა შედგება განმეორებადი თანმიმდევრობებისაგან და მხოლოდ დაახლოებით 5% არის უნიკალური თანმიმდევრობა, რომელიც აკოდირებს ცილებს და ფერმენტებს.

ჰიბრიდიზაცია შეიძლება მოხდეს სხვადასხვა წყაროდან მიღებული ნუკლეინის მჟავების დამატებით ძაფებს შორის. ორჯაჭვიანი ნუკლეინის მჟავა, რომელიც წარმოიქმნება, არის ჰეტეროდუპლექსი და ჰეტეროდუპლექსების მოცულობა მიუთითებს ჰომოლოგიას ნუკლეინის მჟავას ორ წყაროს შორის. მაგალითად, ადამიანები და თაგვები ერწყმის დნმ-ის რენატურაციის ძალიან მცირე ნაწილს, მაგრამ ადამიანები და შიმპანზეები აძლევენ 98%-ზე მეტ ჰომოლოგიას. დნმ-ს და რნმ-ს ასევე შეუძლიათ ერთმანეთთან ჰიბრიდიზაცია ჰეტეროდუპლექსების წარმოქმნით.


რნმ-ის სტრუქტურა

ყველა უჯრედში არის მეორე ნუკლეინის მჟავა, რომელსაც ეწოდება რიბონუკლეინის მჟავა ან რნმ. დნმ-ის მსგავსად, რნმ არის ნუკლეოტიდების პოლიმერი. რნმ-ში თითოეული ნუკლეოტიდი შედგება აზოტოვანი ფუძისგან, ხუთნახშირბადოვანი შაქრისგან და ფოსფატის ჯგუფისგან. რნმ-ის შემთხვევაში, ხუთნახშირბადიანი შაქარი არის რიბოზა და არა დეზოქსირიბოზა. რიბოზას აქვს ჰიდროქსილის ჯგუფი 2' ნახშირბადზე, განსხვავებით დეზოქსირიბოზასგან, რომელსაც აქვს მხოლოდ წყალბადის ატომი (სურათი 9.1.4).

სურათი 9.1.4: განსხვავება რნმ-ში ნაპოვნი რიბოზასა და დნმ-ში ნაპოვნი დეზოქსირიბოზას შორის არის ის, რომ რიბოზას აქვს ჰიდროქსილის ჯგუფი 2' ნახშირბადზე.

რნმ ნუკლეოტიდები შეიცავს აზოტულ ფუძეებს ადენინს, ციტოზინს და გუანინს. თუმცა, ისინი არ შეიცავს თიმინს, რომელიც ჩანაცვლებულია ურაცილით, სიმბოლურად &ldquoU.&rdquo რნმ არსებობს როგორც ერთჯაჭვიანი მოლეკულა და არა ორჯაჭვიანი სპირალი. მოლეკულურმა ბიოლოგებმა დაასახელეს რნმ-ის რამდენიმე სახეობა მათი ფუნქციის მიხედვით. მათ შორისაა მესინჯერი რნმ (მრნმ), გადამტანი რნმ (tRNA) და რიბოსომური რნმ (rRNA) და მდაშმოლეკულები, რომლებიც მონაწილეობენ დნმ-ის კოდიდან ცილების წარმოებაში.


არავირუსული გენური თერაპია: არაორგანული ნანოპლექსების დიზაინი და გამოყენება

მარიო ვინამბრეს პანიზო,. მარზია მარსიელო, ნუკლეინის მჟავის ნანოთერანოსტიკაში, 2019 წ.

2 არაორგანული ნანოპლექსის დიზაინი: ზოგადი მოსაზრებები

არაორგანული NP-ების გამოყენება გენის მიწოდებაში განვითარებადი სფეროა, რადგან ეს არის ნანოსტრუქტურები, რომლებიც ადვილად შეიძლება მომზადდეს სხვადასხვა ზომისა და ფორმის მიხედვით. გარდა ამისა, მათი ფუნქციონირება შესაძლებელია სხვადასხვა გზით, რათა თავიდან აიცილონ რეტიკულოენდოთელური სისტემა, გაახანგრძლივონ სისხლის მიმოქცევის ნახევარგამოყოფის პერიოდი და დაიცვან გადატანილი ნუკლეინის მჟავები და/ან კონიუგირებული ლიგანდები სამიზნე უჯრედებამდე მისასვლელად. 9,11–14 Au NPs, SPIONs, QDs და CNTs არის ყველაზე შესწავლილი არაორგანული NPs. ეს ნაწილაკები აჩვენებენ რამდენიმე მნიშვნელოვან უპირატესობას ორგანულ ნანოსისტემებთან მიმართებაში, როგორიცაა ტრანსფექციის უკეთესი ეფექტურობა, 12,15 მიკრობული თავდასხმის არარსებობა, 10,14 უფრო დიდი შენახვის სტაბილურობა, წარმოების დაბალი ღირებულება და უფრო ხანგრძლივი შენახვის ვადა. 14,16,17 გარდა ამისა, ისინი აჩვენებენ უნიკალურ ელექტრულ, მექანიკურ, ოპტიკურ და მაგნიტურ თვისებებს, რომლებიც ნაკლებად გავრცელებულია პოლიმერულ ნაწილაკებში. 18,19 ზოგიერთი მნიშვნელოვანი წინსვლა მეტალის NP-ების და ნახშირბადზე დაფუძნებული ნანომასალების გამოყენებაში მოხსენებულია, შესაბამისად, ცხრილებში 1 და 2.

ცხრილი 1. ზოგიერთი მიღწევების შეჯამება Au NP-ების, QD-ების და SPION-ების გამოყენებაში არავირუსული გენური თერაპიისთვის

მასალაშემადგენლობა და ფუნქციონალიზაციაშემოთავაზებული გამოყენებული/ძირითადი დასკვნებიტესტირების მოდელიმითითება
Au NPPEI-თ დაფარული ოქროს ნანონაწილაკები, კონიუგირებული siRNA-სთან, რომლებიც მიზნად ისახავს უჯრედის ციკლის ენდოგენურ კინაზებსონკოგენის პოლოს მსგავსი კინაზა 1-ის დაქვეითების მიზნით. ნანონაწილაკების კომპლექსმა მისცა 60% ნოკდაუნი და უმნიშვნელო უჯრედული ტოქსიკურობა, როდესაც გამოიყენებოდა 40 ნმ siRNA.MDA-MB-435s უჯრედებისიმღერა 2010 43
Au NPთიოლ-ტერმინირებული დნმ მიმაგრებულია AuNP-ზე და შემდეგ ჰიბრიდირებულია ფუნქციურ დისტროფინ-დონორ დნმ-თან. Cas9 ცილა ადსორბირებული იყო აფინურობითCRISPR/Cas9 გენის რედაქტირების ხელსაწყოს ტრანსფექციის გასაუმჯობესებლად და მუტაციური დისტროფინის გენის მოდიფიცირებისთვის. გამოკეთდა მიობლასტების 3.3%.mdx თაგვის მოდელილი 2017 155
QDCdSe/ZnS core–shell QDs. პოლი(ეთილენგლიკოლი), პოლი-ე-კაპროლაქტონი და პოლიეთილენ იმინის საფარი. ფლუორესცენციით კონიუგირებული siRNA GAPDH-ის წინააღმდეგთვალყური ადევნოთ და დაამტკიცოთ დნმ-ის გამოყოფა QD-ნანომატარებლების კომპლექსებიდან FRET-ზე დაფუძნებული გამოსახულების ტექნიკითSKOV3 უჯრედებიEndres 2014 60
QDMn: ZnSe ბირთვი. პოლი(ალილამინის ჰიდროქლორიდი) საფარი და ფოლიუმის მჟავა რეცეპტორების შუამავლობით ტრანსფექციისთვის. siRNA მუტაციური K-Ras დუმილის წინააღმდეგK-Ras გენი დადუმდა 60%-ში. ციტოტოქსიკურობა არ შეინიშნება 160 მკგ მლ - 1-მდე პანკ-1 უჯრედებიWang 2015 61
SPIONCommercial nanoparticles Polymag complexed with plasmid (pCIKLux) carrying a luciferase reporter geneTo apply an oscillating magnet to improve the magnetofection technique up to 6 times compared with original magnetofection protocolNCI-H292 cellsMcBain 2008 80
SPIONNanocluster containing SPIONs of 5 nm, fluorescent Rhodamine B in a matrix polymer of poly(lactide-co-glycolide) and PEI coating, and conjugated with pDNA containing the GFP reporterTo track the complex by both fluorescence imaging and MRI. 39% of GFP expression and nontoxic effects for 96 hours at a concentration of 200 μg mL -1 Human mesenchymal stem cells (hMSCs)Park 2017 83

AuNP, gold nanoparticle FRET, fluorescence resonance energy transfer GAPDHგლიცერალდეჰიდ-3-ფოსფატდეჰიდროგენაზა GFP, green fluorescent protein MRI, molecular resonance imaging PEI, polyethylenimine pDNA, plasmid DNA QD, quantum dot siRNA, short interfering RNA SPION, superparamagnetic iron oxide nanoparticle.

ცხრილი 2 . Summary of Some Outstanding Progress in the Application of Graphene and GO Nanomaterials for Nonviral Gene Therapy

მასალაფორმაFunctionalizationProposed Use/Major FindingsTesting Modelმითითება
Graphene/GONanosheetsPAMAM + OA13-Fold increase in transfection efficiency with respect to grapheneHeLa cells and MG-63 cellsLiu 2014 124
GONanosheetsPEICodelivery of siRNA and doxorrubicine for anticancer therapyB-cell lymphoma 2 cellsZhang 2011 137
GONanosheetsPEG + PEINanocarriers with photothermally enhanced intracellular trafficking via NIR for light-controllable gene deliveryHeLa cells and MDA-MB-435s cellsFeng 2013 134
GONanosheetsPEIDelivery of VEGF-165 gene for acute myocardial infarctionIntramyocardial injection in ratPaul 2014 138
GOQDsPLL + PEGMicroRNAs imaging analysis and gene deliveryHeLa cellsDong 2015 132
GONanosheetsPL-PEG + CPPsImproved hydrocolloidal stability and siRNA transfection efficiencyMCF-7 cellsImani 2016 136
GOQDsCodelivery of MPG-2H1 chimeric peptide and plasmid DNA for simultaneous gene delivery and trackingHEK 293T cellsGhafary 2017 133

CPP, cell penetrating peptide DNA, deoxyribonucleic acid GO, graphene oxide NIR, near-infrared light OA, oleic acid PAMAM, polyamidoamine PEG, poly(ethylene glycol) PEI, polyethylenimine PLL, poly( l -lactide) PL-PEG, phospholipid-based poly(ethylene glycol) QDs, quantum dots რნმ, ribonucleic acid siRNA, short interfering RNA VEGF, vascular endothelial growth factor.

With the aim of forming a stable complex with the carried therapeutic nucleic acid, the surface of the inorganic NPs needs to be chemically modified. Specifically, surface modifications are performed for different objectives: (1) to allow a stable conjugation of the carried nucleic acid (2) to protect the NPs from opsonization (3) to increase the selective cellular binding and (4) to allow internalization through receptor-mediated endocytosis. 3

After modification of the NP surface, the therapeutic gene is carried using different strategies. Depending on the type of chemical NP-nucleic acid association, inorganic vectors can be differently categorized as: (1) vectors that form a condensed complex with the nucleic acid, protecting it from nucleases and other blood components (2) nanocarriers that expose specific ligands for target cells (3) nanovectors able to improve the release of the genetic material into the cytosol or nucleus and (4) nanosystems that prolong the release of the therapeutic gene in tissues. 1

Typical chemical modifications /conjugations can be obtained by establishing three main kinds of bonds:

Weak bindings—These are generally represented by electrostatic interactions that lead to the formation of reversible bonds. Normally, they are based on the attraction between positively and negatively charged species and can easily be broken under high salt concentrations. Some examples are ionic bindings, hydrogen bonds, and Van der Waals forces. 20

Weak interactions are preferred for the complexation of the nucleic acid with the NPs because the therapeutic can be easily released into the cell, while also avoiding chemical modifications of it. An interesting example is represented by multiple electrostatic layers on the surface of NPs that can be deposited using a layer-by-layer (LbL) approach. 21

Strong bonds—They are usually characterized by irreversible conjugations. They are resistant to high-force ionic conditions differently from electrostatic interactions. Generally, they are formed between different functional groups (e.g., carboxylic acids, amines, thiols), forming very strong bonds, such as amide, ester, or disulfide bridges. 20

The metal-ligand interaction between Au and thiolated molecules, 22 as well as the binding affinity of protein-ligand (including lock-and-key, induced fit, and conformational selection models) 23,24 are also included in this category of conjugation.

Versatile and quick click chemistry reactions can be used to obtain some reactions that lead to the formation of resistant bonds. These include, for example, cycloadditions (e.g., 1,3-dipolar cycloadditions of alkynes to azides, hetero-Diels-Alder cycloadditions), nucleophilic ring openings consisting of opened strained heterocyclic electrophiles (e.g., aziridines, epoxides, cyclic sulfates), and additions to carbon-carbon multiple bonds (e.g., epoxidations, aziridinations, dihydroxylations, sulfenyl halide additions, nitrosyl halide additions, and certain Michael additions). 25,26

Encapsulation—It leads to the formation of hybrid nanomaterials based on the entrapment of inorganic particles with the therapeutic into a polymer. 27 This polymer can be stimuli-sensitive, so able to release its contents in the presence of specific conditions (typically temperature and pH). 28,29


Nucleotides and Bases

Nucleotide Structure
Courtesy of the National Human Genome Research Institute

ნუკლეოტიდები

A nucleotide is the basic structural unit and building block for DNA. These building blocks are hooked together to form a chain of DNA. A nucleotide is composed of 3 parts:

* five-sided sugar
* phosphate group
* nitrogenous base (nitrogen containing)

Image courtesy of the National Human Genome Research Institution

The sugar and phosphate group make up the backbone of the DNA double helix, while the bases are located in the middle. A chemical bond between the phosphate group of one nucleotide and the sugar of a neighboring nucleotide holds the backbone together. Chemical bonds (hydrogen bonds) between the bases that are across from one another hold the two strands of the double helix together.

There are four types of bases in DNA. They are called:

* Adenine (A)
* Cytosine (C)
* Guanine (G)
* Thymine (T)

Courtesy of the National Human Genome Research Institution

Bases are the part of DNA that stores information and gives DNA the ability to encode ფენოტიპი, a person’s visible traits. Adenine and guanine are purine bases. These are structures composed of a 5-sided and 6-sided ring. Cytosine and thymine are pyrimidines which are structures composed of a single six-sided ring. Adenine always binds to thymine, while cytosine and guanine always bind to one another. This relationship is called complementary base paring. These complementary bases are bonded together via hydrogen bonds, which can be easily broken apart when the DNA needs to unzip and duplicate itself.

ᲓᲐᲐᲙᲚᲘᲙᲔ ᲐᲥto learn about DNA
ᲓᲐᲐᲙᲚᲘᲙᲔ ᲐᲥ
to learn about single nucleotide polymorphisms
ᲓᲐᲐᲙᲚᲘᲙᲔ ᲐᲥ to learn about DNA mutations