ინფორმაცია

როგორ შეიძლება (ან გააგრძელა) Deinococcus radiodurans განვითარება მუტაციისადმი წინააღმდეგობის განვითარების შემდეგ?

როგორ შეიძლება (ან გააგრძელა) Deinococcus radiodurans განვითარება მუტაციისადმი წინააღმდეგობის განვითარების შემდეგ?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Deinococcus radiodurans-ს აქვს შესანიშნავი უნარი, წინააღმდეგობა გაუწიოს დნმ-ის დაზიანებას რადიაციის, დეჰიდრატაციის ან (ჩემი ინფორმაციით) ნებისმიერი სხვა წყაროს გამო. ის ინახავს თავისი გენომის მრავალ ასლს და აქვს აღდგენის მექანიზმიც.

ჩემი კითხვაა: როგორ შეიძლება ეს საგანი განვითარდეს ისე დახვეწილი, რათა თავიდან აიცილოს ევოლუციის უკან არსებული პროცესები? როგორც ჩანს, შეცდომების თავიდან აცილების მექანიზმი ასევე ხელს უშლის ცვლილებებს, ასე რომ, როგორც კი ორგანიზმი გამოსწორდება ცვლილებების თავიდან აცილებაში, ის ვერ შეძლებს განვითარებას, რათა უკეთესად განვითარდეს. იყო თუ არა ამ პროცესების გენები ნასესხები სხვა ექსტრემოფილებისგან? არის თუ არა ვარაუდი, რომ ასეთ ექსტრემალურ გარემოში მავნე ზემოქმედება შეესაბამებოდა სარემონტო მექანიზმებს? ეს ჩემი ვარაუდია, მაგრამ სიამოვნებით მოვისმენდი სხვებისგან, რომლებსაც მეტი ცოდნა აქვთ ევოლუციური პროცესების შესახებ.


ამ ვებგვერდის განყოფილების „ფუნქციური ადაპტაციის“ მიხედვით, Deinococcus radiodurans იყენებს აღდგენის პროტეინებს დნმ-ის დასაკერებლად რადიაციული დაზიანების შემდეგ. რაც იმას ნიშნავს, რომ რადიაციის აფეთქების შემდეგ, დნმ ნაწილებად დაიყოფა და აღმდგენი პროტეინები დააბრუნებს მას. როგორც ჩანს, ეს მექანიზმი არ იმოქმედებს დნმ-ის მუტაციის სხვა ფორმების დროს, რომლებიც ხდება რეპლიკაციის დროს, როგორიცაა წერტილოვანი მუტაციები ან ინვერსიები.


Deinococcus radiodurans-ს არ "განუვითარებია წინააღმდეგობა მუტაციების მიმართ".

მას შეუძლია შეაკეთოს თავისი ქრომოსომა, როდესაც ნაწილებად გაფანტულია რადიაციის ან გამოშრობის შედეგად, ხოლო სხვა ბაქტერიები იღუპებიან ასეთ პირობებში.

ასე რომ, ეს ადაპტირებადია ექსტრემალურ გარემოში, როგორიცაა უდაბნოები (სადაც ის განვითარდა) ან დაკონსერვებული სიმინდის ხორცი (სადაც აღმოაჩინეს).


რადიაციისადმი მდგრადი ორგანიზმი გამოავლენს თავის თავდაცვის სტრატეგიებს.

Rehovot, ისრაელი &mdash 2003 წლის 9 იანვარი &mdashWeizmann ინსტიტუტის მეცნიერებმა აღმოაჩინეს, თუ რა ხდის ბაქტერიას Deinococcus radiodurans ყველაზე რადიაციულ ორგანიზმად მსოფლიოში: მიკრობის დნმ მჭიდროდ არის შეფუთული რგოლში. აღმოჩენები, რომელიც გამოქვეყნდა Science-ის 10 იანვრის ნომერში, ხსნის საიდუმლოებას, რომელიც დიდი ხანია აწუხებს სამეცნიერო საზოგადოებას.

წითელ ბაქტერიას შეუძლია გაუძლოს 1,5 მილიონ რადას და ათასჯერ მეტს, ვიდრე ნებისმიერი სხვა სიცოცხლის ფორმა დედამიწაზე და სამი ათასი ადამიანი. მისმა ჯანსაღმა მადამ ის სანდო მუშად აქცია ბირთვული ნარჩენების ობიექტებზე, სადაც ის ჭამს ბირთვულ ნარჩენებს და გარდაქმნის მას უფრო ერთჯერად წარმოებულებად. უნარი გაუძლოს სხვა ექსტრემალურ სტრესებს, როგორიცაა დეჰიდრატაცია და დაბალი ტემპერატურა, აქცევს მიკრობს ჩრდილოეთ პოლუსზე აღმოჩენილ რამდენიმე სიცოცხლის ფორმას შორის. ამიტომ გასაკვირი არ არის, რომ ის მთელ მსოფლიოში დიდი ცნობისმოყვარეობის მიზეზი გახდა, რასაც ახლახან მოჰყვა დებატები NASA-სა და რუს მეცნიერებს შორის და ამ უკანასკნელმა თქვა, რომ ის წარმოიშვა მარსზე, სადაც რადიაციის დონე უფრო მაღალია.

ვინაიდან დნმ არის უჯრედის პირველი ნაწილი, რომელიც დაზიანებულია რადიაციის შედეგად და ყველაზე სასიკვდილო დაზიანება არის დნმ-ის ორივე ჯაჭვის გაწყვეტა, მეცნიერებმა ყურადღება გაამახვილეს დნმ-ის აღდგენის მექანიზმებზე, რათა იპოვონ პასუხი მიკრობის გამძლეობაზე. უჯრედებს, მათ შორის ადამიანის უჯრედებს, შეუძლიათ თავიანთი დნმ-ის ასეთი რღვევების გამოსწორება. მიკრობებს, მაგალითად, შეუძლიათ მხოლოდ სამიდან ხუთამდე შეკეთება. თუმცა D. radiodurans-ს შეუძლია 200-ზე მეტის გამოსწორება. ამრიგად, მეცნიერებს სჯეროდათ, რომ მიკრობს უნდა ჰქონდეს უნიკალური ეფექტური ფერმენტები, რომლებიც აღადგენს დნმ-ს. თუმცა, ექსპერიმენტების სერიამ აჩვენა, რომ მიკრობის აღმდგენი ფერმენტები ძალიან ჰგავდა ჩვეულებრივ ბაქტერიებში არსებულ ფერმენტებს.

ოპტიკური და ელექტრონული მიკროსკოპის მეთოდების ასორტიმენტის გამოყენებით, პროფესორმა ავი მინსკიმ ვეიზმანის მეცნიერებათა ინსტიტუტის ორგანული ქიმიის დეპარტამენტიდან აღმოაჩინა, რომ მიკრობის დნმ მოწყობილია უნიკალურ რგოლში, რომელიც ხელს უშლის რადიაციის შედეგად გატეხილი დნმ-ის ნაწილებს უჯრედის სითხეებში ცურვას. სხვა ორგანიზმებისგან განსხვავებით, რომლებშიც დნმ-ის ფრაგმენტები იკარგება რადიაციის გამო, ეს მიკრობი არ კარგავს გენეტიკურ ინფორმაციას, რადგან ის ინახავს მოწყვეტილ დნმ-ის ფრაგმენტებს რგოლში მჭიდროდ ჩაკეტილი და ასობით, საჭიროების შემთხვევაში. ფრაგმენტები, რომლებიც მჭიდროდ იკავებენ, საბოლოოდ უბრუნდებიან ერთმანეთს სწორი, ორიგინალური თანმიმდევრობით, აღადგენენ დნმ-ის ძაფებს.

რამდენადაც ამაღელვებელიც არ უნდა იყოს ეს აღმოჩენები, მოსალოდნელია, რომ ისინი არ გამოიწვევს ადამიანის დაცვას რადიაციისგან. &ldquoჩვენი დნმ სტრუქტურირებულია ფუნდამენტურად განსხვავებული გზით,&rdquo ამბობს მინსკი. თუმცა, შედეგებმა შეიძლება გამოიწვიოს სპერმის უჯრედებში დნმ-ის დაცვის უკეთ გაგება, სადაც ასევე შეინიშნება რგოლის მსგავსი დნმ-ის სტრუქტურა.

მინსკის გუნდმა ასევე დაადგინა, რომ მიკრობი გადის დნმ-ის შეკეთების ორ ფაზას. პირველ ფაზაში დნმ ფიქსირდება რგოლში, როგორც აღწერილია. შემდეგ ის ასრულებს კიდევ უფრო უჩვეულო ტრიუკს.

ბაქტერია შედგება ოთხი განყოფილებისგან, თითოეული შეიცავს დნმ-ის ერთ ასლს. მინსკის ჯგუფმა იპოვა ორი პატარა გასასვლელი კუპეებს შორის. დაახლოებით საათნახევარი შეკეთების შემდეგ რგოლში, დნმ იშლება და მიგრირებს მეზობელ განყოფილებაში, სადაც ის ერევა იქ მცხოვრებ დნმ-ის ასლს. შემდეგ თამაშში შედის "რეგულარული" სარემონტო აპარატურა, რომელიც გავრცელებულია როგორც ადამიანებში, ასევე ბაქტერიებში და ადარებს აღდგენითი ფერმენტები დნმ-ის ორ ეგზემპლარს შორის, თითოეულს იყენებს როგორც შაბლონს მეორის დასაფიქსირებლად. ვინაიდან დნმ-ს უკვე გავლილი აქვს შეკეთების ერთი ფაზა, რომელშიც ბევრი შეფერხება ფიქსირდება, ეს ფაზა შეიძლება შედარებით მარტივად დასრულდეს.

მჭიდროდ შეფუთული ბეჭდის აღმოჩენამ გუნდს დააფიქრა, თუ როგორ იცხოვრებდა და ფუნქციონირებდა ბაქტერია ნორმალურ პირობებში. დნმ-ის ძაფები უნდა გაიშალოს, რათა შეასრულონ თავიანთი სამუშაო ცილის წარმოება. როგორ ახერხებენ ამას, თუ ძლივს იძვრებიან? ამ კითხვამ გამოიწვია მიკრობის გადარჩენის კიდევ ერთი სტრატეგიის აღმოჩენა: დნმ-ის ოთხი ასლიდან, ყოველთვის არის ორი ან სამი მჭიდროდ შეფუთული რგოლში, ხოლო დანარჩენი ასლები თავისუფლად გადაადგილდებიან. ამგვარად, ნებისმიერ მომენტში არის დნმ-ის ასლები, რომლებიც განაპირობებენ ცილების წარმოებას და სხვა, რომლებიც არააქტიურია, მაგრამ მუდმივად დაცული.

მინსკი, სხვა მეცნიერებთან ერთად, თვლის, რომ ბაქტერია&rsquos პასუხი მწვავე სტრესებზე განვითარდა დედამიწაზე, როგორც პასუხი მკაცრი გარემოზე, საიდანაც ის შესაძლოა გამოსულიყო. ეს არის სიცოცხლის იმ რამდენიმე ფორმადან, რომელიც გვხვდება უკიდურესად მშრალ ადგილებში. უნიკალური თავდაცვითი მექანიზმი, რომელიც შეიქმნა დეჰიდრატაციის წინააღმდეგ საბრძოლველად, სასარგებლოა რადიაციისგან დასაცავად.

Deinococcus radiodurans აღმოაჩინეს ათწლეულების წინ დაკონსერვებულ საკვებში, რომელიც სტერილიზებული იყო რადიაციის გამოყენებით. წითელი ლაქები გამოჩნდა ბაქტერიის ქილებში და კოლონიებში და აჩენდა კითხვებს, თუ როგორ შეიძლებოდა მისი გადარჩენა. მიუხედავად იმისა, რომ ამ კითხვებზე პასუხი ახლა გაცემულია, სპეკულაციების ტალღა იმის შესახებ, თუ როგორ განვითარდა ეს თავდაცვის მექანიზმები და სად გაგრძელდება.

პროფესორ აბრაამ მინსკის კვლევას მხარს უჭერენ Verband der Chemischen Industrie, Teva Pharmaceuticals, ისრაელი და Helen & Milton A. Kimmelman Center for Biomolecular Structure & Assembly.

პროფესორი მინსკი არის პროფესორ ტ. რაიხშტეინის პროფესორის კათედრის მოქმედი.

ვეიზმანის მეცნიერების ინსტიტუტი რეჰოვოტში, ისრაელი, არის მსოფლიოში ერთ-ერთი ყველაზე მაღალი რანგის მულტიდისციპლინარული კვლევითი ინსტიტუტი. საბუნებისმეტყველო და ზუსტი მეცნიერებების ფართო კვლევით, ინსტიტუტში ცხოვრობს 2500 მეცნიერი, სტუდენტი, ტექნიკოსი და დამხმარე პერსონალი. ინსტიტუტის კვლევითი ძალისხმევა მოიცავს დაავადებისა და შიმშილის წინააღმდეგ ბრძოლის ახალი გზების ძიებას, მათემატიკასა და კომპიუტერულ მეცნიერებაში წამყვანი კითხვების შესწავლას, მატერიისა და სამყაროს ფიზიკის გამოკვლევას, ახალი მასალების შექმნას და გარემოს დაცვის ახალი სტრატეგიების შემუშავებას.

სიუჟეტის წყარო:

მასალები მოწოდებული ვაიზმანის ინსტიტუტი. შენიშვნა: კონტენტის რედაქტირება შესაძლებელია სტილისა და სიგრძის მიხედვით.


შეუსაბამობის შეკეთება უზრუნველყოფს რეპლიკაციისა და რეკომბინაციის ერთგულებას რადიორეზისტენტულ ორგანიზმში Deinococcus radiodurans

ჩვენ დავახასიათეთ უაღრესად რადიაციული რეზისტენტული ტიპის შტამის შეუსაბამობის შეკეთების სისტემა (MMR). Deinococcus radiodurans, ATCC 13939. ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ MMR სისტემა ფუნქციონირებს ამ ორგანიზმში, სადაც ის მონაწილეობს დნმ-ის რეპლიკაციისა და რეკომბინაციის ერთგულების უზრუნველყოფაში. სისტემა ეყრდნობა ორი ძირითადი ცილის, MutS1-ისა და MutL-ის აქტივობას, რომლებიც ქმნიან კონსერვაციულ ბირთვს, რომელიც მონაწილეობს შეუსაბამობის ამოცნობაში. MutS1-ის ან MutL-ის ინაქტივაციამ გამოიწვია სპონტანური Rif R მუტაგენეზის სიხშირის შვიდჯერ გაზრდა და ბაქტერიული ტრანსფორმაციის დროს დონორის წერტილი-მუტაციური მარკერის ინტეგრაციის ეფექტურობის ათჯერ გაზრდა. შეუსაბამობის აღდგენასთან ასოცირებული UvrD ჰელიკაზას ინაქტივაციამ გაზარდა სპონტანური მუტაგენეზის დონე, მაგრამ არავითარი გავლენა არ მოახდინა მარკერის ინტეგრაციაზე - ვარაუდობს, რომ MutS1 და MutL პროტეინების შეკავშირება შეუსაბამო ჰეტეროდუპლექსთან საკმარისია არაიდენტურ (ჰომეოლოგიურ) შორის რეკომბინაციის დასათრგუნად. ამის საპირისპიროდ, MutS2-ის ინაქტივაცია, რომელიც კოდირებულია მეორეზე mutS - დაკავშირებული გენი იმყოფება D. radiodurans, არ მოქმედებდა მუტაგენეზზე ან რეკომბინაციაზე. MutS1 ან MutL ცილების გარეშე უჯრედები ისეთივე მდგრადია γ-სხივების, მიტომიცინის C და ულტრაიისფერი გამოსხივების მიმართ, როგორც ველური ტიპის ბაქტერიები, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ შეუსაბამობის აღდგენის სისტემა არ არის აუცილებელი დნმ-ის დაზიანების შემდეგ ფუნქციური გენომის აღდგენისთვის.

ეს არის გამოწერის შინაარსის გადახედვა, წვდომა თქვენი დაწესებულების მეშვეობით.


მსოფლიოს უძლიერესი ბაქტერია გვპირდება სასიკვდილო დაავადებების საწინააღმდეგო ვაქცინის სწრაფ განვითარებას

Uniformed Services University of Health Sciences-ის (USU) მეცნიერებმა შეიმუშავეს მომზადების ახალი მეთოდი, რომელიც აქცევს ვირუსს ან ბაქტერიას არაინფექციურს და ინარჩუნებს მის იმუნიტეტის გამაძლიერებელ უნარს გამა გამოსხივების ზემოქმედების შემდეგ. ვაქცინა, რომელიც ექვემდებარება გამა გამოსხივების მეგადოზებს, წარმატებით გამოსცადეს თაგვებზე წამლისადმი რეზისტენტული სტაფილოკოკის ბაქტერია ბაქტერიები კოლეგების მიერ ჯანდაცვის ეროვნული ინსტიტუტის (NIH) და ჰპირდება სხვა ასეთ სასიკვდილო დაავადებებს.

გარღვევის კვლევის შედეგები გამოქვეყნდა ივლისის გამოცემაში უჯრედის მასპინძელი და მიკრობი.

რადიაციის მაღალი დოზები, როგორც წესი, ანადგურებს პათოგენის გენომს, რის გამოც მას არ შეუძლია გამოიწვიოს ინფექცია ვაქცინაში გამოყენებისას. თუმცა, რადიაცია ასევე აზიანებს მიკრობის ცილის ეპიტოპებს, რომლებიც იმუნურმა სისტემამ უნდა აღიაროს, რომ ვაქცინა იყოს დამცავი. რადიაციის შედეგად ინაქტივირებული ან მოკლული ორგანიზმები იწვევენ უკეთეს იმუნურ პასუხებს, ვიდრე ტრადიციული სითბოს ან ქიმიური მეთოდებით ინაქტივირებული ორგანიზმები. მიუხედავად იმისა, რომ ცოცხალმა ვაქცინებმა შეიძლება უზრუნველყოს უკეთესი იმუნური დაცვა, ვიდრე დასხივებული ვაქცინები, ცოცხალი ვაქცინები ხშირად არ არის ვარიანტი, რადგან მათ შეუძლიათ მიიღონ სხვაგვარად განუკურნებელი დაავადებით (მაგ., აივ) ინფექციის დაუშვებელი რისკი. ლეტალურად დასხივებული ვაქცინები ასევე შეიძლება დაეხმაროს განვითარებად სამყაროს, სადაც ცივ შენახვის საჭიროება ზღუდავს ცოცხალი ვაქცინების ხელმისაწვდომობას.

გენომის განადგურება ეპიტოპის გადარჩენისგან გამოსაყოფად, მკვლევარებმა ისესხეს რთული ქიმია მსოფლიოში ყველაზე მკაცრი ბაქტერიისგან. Deinococcus radiodurans, მეტსახელად "კონან ბაქტერია", რომელსაც შეუძლია გაუძლოს 3000-ჯერ მეტი რადიაციის დონეს, რომელიც მოკლავს ადამიანს. 2000 წელს, დეინოკოკი შექმნილია ატომური ბომბების წარმოებიდან დარჩენილი უაღრესად რადიოაქტიური ნარჩენების გასასუფთავებლად. ახლა ამ ექსტრემოფილში აღმოჩენილი უჩვეულო Mn(II)-ანტიოქსიდანტები წარმატებით იქნა გამოყენებული დასხივებული ვაქცინების მოსამზადებლად.

დეინოკოკი აგროვებს მანგანუმის და პეპტიდების მაღალ კონცენტრაციებს, რომლებიც მეცნიერებმა შეაერთეს ლაბორატორიაში - ქმნიან ძლიერ ანტიოქსიდანტურ კომპლექსს, რომელიც სპეციალურად იცავს ცილებს რადიაციისგან. მათ აღმოაჩინეს, რომ კომპლექსი ინარჩუნებს იმუნურ ეპიტოპებს, როდესაც გამოიყენება ვირუსებსა და ბაქტერიებზე გამა გამოსხივების ზემოქმედების დროს, მაგრამ არ იცავს მათ გენომებს.

მაიკლ ჯ. დალი, დოქტორი, პათოლოგიის პროფესორი USU-ში და მისი მკვლევარები მუშაობდნენ სამუშაოზე სანდიპ კ. დატასთან, M.D. და კოლეგებთან NIH-ის ალერგიისა და ინფექციური დაავადებების ეროვნულ ინსტიტუტში (NIAID). დალიმ სწავლას 20 წელი მიუძღვნა Deinococcus radiodurans, რამაც გამოიწვია მისი მუშაობის სამი პატენტი.

მეცნიერებმა გამოიყენეს Mn-პეპტიდის კომპლექსი ლაბორატორიულ პირობებში, რათა წარმატებით დაეცვათ ვენესუელური ცხენის ენცეფალიტის ვირუსის ცილის ეპიტოპები რადიაციული დაზიანებისგან, მიკრობი, რომელიც იწვევს ნერვული სისტემის კოღოებით გადამდები დაავადებას. მათ ასევე გამოიყენეს მომზადების მეთოდი თაგვებში მეთიცილინ-რეზისტენტული S. aureus (MRSA) ინფექციების წინააღმდეგ ეფექტური ვაქცინის შესაქმნელად.

ისწავლეთ ზრუნვა მათზე, ვინც საზიანოა

მკვლევარები თვლიან, რომ მთლიანი მიკრობული ვაქცინის მიდგომა შეიძლება გავრცელდეს ნებისმიერ ინფექციურ ორგანიზმზე, რომელიც შეიძლება გაშენდეს, იქნება ეს სოკოები, პარაზიტები, პროტოზოები, ვირუსები თუ ბაქტერიები - მათ შორის აგენტები, რომლებიც სწრაფად მუტაციას განიცდიან, როგორიცაა პანდემიური გრიპი და აივ. ჯგუფები მიზნად ისახავს დასხივების ამ მეთოდის დემონსტრირებას, როგორც ვაქცინის შემუშავების სწრაფ, ეკონომიურ მიდგომას.

პროექტი დააფინანსა საჰაერო ძალების სამეცნიერო კვლევების ოფისმა (AFOSR) და NIAID-ის შიდა კვლევითი პროგრამა.


საზოგადოების ეკოლოგია დეინოკოკი დასხივებულ ნიადაგში

დეინოკოკი არის ნიადაგის ბაქტერიების გვარი, რომელიც ცნობილია რადიაციული გამძლეობით. თუმცა, რადიაციის ზემოქმედების ზემოქმედება მისი საზოგადოების სტრუქტურაზე უცნობია. ჩვენ ვამჟღავნებდით ნიადაგს გამა გამოსხივების სამ დონეს, 0.1 კგ/სთ (დაბალი), 1 კგგ/სთ (საშუალო) და 3 კგგ/სთ (მაღალი), კვირაში ერთხელ 6 კვირის განმავლობაში და შემდეგ გამოვყავით ნიადაგის დნმ 16S rRNA ამპლიკონისთვის. თანმიმდევრობა. ჩვენ აღმოვაჩინეთ შემდეგი: (1) რადიაციის დოზის გაზრდამ განაპირობა რადიაციული სიმრავლის მნიშვნელოვანი ზრდა დეინოკოკი, მიაღწია

წაკითხვის 80% უმაღლესი დოზებით. სხვადასხვა სიმრავლე დეინოკოკი სახეობები ექსპოზიციის დონეებთან მიმართებაში მიუთითებს განსხვავებულ „რადიაციულ ნიშებზე“. 3 კგ/სთ სიჩქარით, ერთი OTU იდენტიფიცირებულია როგორც D. ficus აბსოლიტურად დომინირებდა მეზოკოსმებზე. (2) გენომის შესაბამისი გამოქვეყნებული მონაცემები აჩვენებს, რომ დომინანტური სახეობა 3 კგ/სთ სიჩქარით, D. ficus, აქვს უფრო დიდი და რთული გენომი, ვიდრე სხვა დეინოკოკი სახეობები გენების უფრო დიდი პროპორციით, რომლებიც დაკავშირებულია დნმ-თან და ნუკლეოტიდურ მეტაბოლიზმთან, უჯრედის კედელთან, მემბრანთან და კონვერტის ბიოგენეზთან, აგრეთვე უჯრედის ციკლის უფრო მეტ კონტროლთან, უჯრედების გაყოფასთან და ქრომოსომის დანაწილებასთან დაკავშირებულ გენებთან. დეინოკოკი ფიკუსი ასევე აქვს გუანინ-ციტოზინის უფრო მაღალი თანაფარდობა, ვიდრე სხვა უმეტესობას დეინოკოკი. ეს მახასიათებლები შეიძლება დაკავშირებული იყოს გენომის სტაბილურობასთან და შეიძლება აიხსნას მისი უფრო დიდი სიმრავლე ამ აშკარად კონკურენტულ სისტემაში, მაღალი რადიაციის ზემოქმედების ქვეშ. (3) გენომური ანალიზი ვარაუდობს, რომ დეინოკოკი, მათ შორის D. ficusმათ შეუძლიათ გამოიყენონ ნახშირბადის სხვადასხვა წყაროები, რომლებიც მიიღება გამოსხივების შედეგად მოკლული მიკრობული უჯრედებიდან (მათ შორის C5-C12 შემცველი ნაერთები, როგორიცაა არაბინოზა, ლაქტოზა, -აცეტილ-დ-გლუკოზამინი) და მცენარეული ორგანული ნივთიერებები ნიადაგში (მაგ. ცელულოზა და ჰემიცელულოზა). (4) მთლიანობაში, მეტაგენომიდან გამომდინარე, ყველაზე მეტად დასხივებული (3 კგ/სთ) ნიადაგიც კი ფლობს ნიადაგის ფუნქციონალური სისტემისთვის საჭირო აქტივობების ფართო სპექტრს. სამომავლო კვლევებმა შეიძლება განიხილოს ასეთი ნიადაგების გამძლეობა და მდგრადობა მაღალი რადიაციის პირობებში.

ეს არის გამოწერის შინაარსის გადახედვა, წვდომა თქვენი დაწესებულების მეშვეობით.


Მასალა და მეთოდები

ეთიკური განცხადება

კვლევა შეესაბამებოდა უკრაინასა და დანიაში ფრინველებზე კვლევის მოთხოვნებს და ნებართვა გაცემული იყო ჩერნობილის გამორიცხვის ზონის ადმინისტრაციის მიერ. ყველა ნიმუში დამტკიცებული იქნა სამხრეთ კაროლინის უნივერსიტეტის ინსტიტუციური ცხოველთა მოვლისა და გამოყენების კომიტეტის ეთიკური მიმოხილვით. მეთოდები განხორციელდა დამტკიცებული გაიდლაინების შესაბამისად. ყველა ფრინველს მოკლე დროში მოექცნენ და არც ერთი არ მოკვდა და არც ტანჯვის ნიშნები აჩვენა სინჯების მოკლე პერიოდში. ყველა ადამიანი გაფრინდა გათავისუფლებისთანავე. საველე კვლევები არ მოიცავდა გადაშენების პირას მყოფ ან დაცულ სახეობებს.

ბაქტერიული შტამების იზოლაცია

2007 და 2008 წლებში სტერილური ხელთათმანების ტარებით ჩვენ შევაგროვეთ რვა ბუმბული ბეღლის მერცხლების სხეულიდან, რომლებიც შემთხვევით იქნა დაჭერილი უკრაინასა და ბელორუსში ფრინველების მოშენების გრძელვადიანი პროექტის ფარგლებში 42 . შეგროვება გაკეთდა კოლექტიურ მეურნეობებში რადიაციის მაღალი დონის მქონე რაიონებში ჩერნობილის მახლობლად სამხრეთ გამორიცხული ზონის გარეთ და ცირჟაკის მიერ აღწერილი პროცედურის შემდეგ. და სხვ. 30 . ყველა ბუმბული მოთავსებულია დალუქულ პლასტმასის ჩანთაში და ინახება -20 °C-ზე სიბნელეში მიკრობიოლოგიურ ანალიზამდე. მასპინძლის სქესის თანაფარდობა დაბალანსებული იყო (N2007 = 31 ქალი, 29 მამაკაცი ნ2008 = 58 ქალი, 56 მამაკაცი). ყველა ფერმას წარმოადგენდა მსგავსი კლიმატის და ჰაბიტატის ტიპები, გარშემორტყმული პლანტაციებით, მიმოფანტული ხეებითა და ღია სასოფლო-სამეურნეო მიწებით, მაგრამ ექვემდებარებოდა სხვადასხვა გარემოს რადიაციის დონეს 44 . α, β და γ გამოსხივება მიწის დონეზე ადრე იყო გაზომილი თითოეულ ფერმაში და ჯვარედინი დამოწმებული გაზომვებით უკრაინის საგანგებო სიტუაციების სამინისტროს მიერ 45 . გაზომვების ორი სერია იყო ძლიერი დადებითად კორელაცია 30,44. ჩვენ შევარჩიეთ ფრინველის ნიმუშები ადგილებიდან ოთხი განსხვავებული ფონური გამოსხივების ინტენსივობით: მაღალი, 2,9 μGy/სთ (ვესნიანის ფერმა, უკრაინა) შუალედური, 0,45 μGy/სთ (ფერმა 49, ვეტკა, ბელარუსია) დაბალი, 0,1 μGy/სთ (ფერმა 43, ვეტკა). , ბელარუსი) და კონტროლი, 0,03 - 0,05 μGy/სთ (კრაგედე, დანია).

როგორც თავისუფლად ცოცხალი, ასევე მიმაგრებული მიკროორგანიზმების მისაღებად, ხუთ ბუმბულს მაღალი სიხშირით 15 წუთის განმავლობაში 3 გამეორებით (თითოეული 5 წუთი 5 წუთიანი პაუზით გამეორებებს შორის) 0.8 მლ სტერილურ ფიზიოლოგიურში (0.90% w/v). ) მარილიანი ხსნარი ბაქტერიების დაშლისთვის. ეს პროცესი არ მოქმედებს ბაქტერიების სიცოცხლისუნარიანობაზე 46 . სონიკაციის შემდეგ ნიმუშები 20 წამის განმავლობაში ტრიალებდნენ და ბაქტერიული სუსპენზია გადაიტანეს სტერილურ 1,5 მლ ეპენდორფის ტუბში. შემდეგ, ბუმბული ხელახლა შეაჩერეს 0,5 მლ სტერილურ ფიზიოლოგიურ ხსნარში და კვლავ მორევა 20 წამის განმავლობაში. სუპერნატანტი გადაიტანეს მეორე სტერილურ ეპენდორფში, მიღებული საერთო მოცულობა

1.3 მლ ხსნარი. მეთოდი სრულად არის აღწერილი ცირჟაკის მიერ და სხვ. 30 . ყველა ნიმუში დამუშავდა ერთნაირად და, ამრიგად, ნებისმიერი პოტენციური მიკერძოება თანაბრად იმოქმედებდა ბაქტერიულ თემებზე.

დუბლიკატში, თითოეულ მიკრობული ხსნარი გავავრცელეთ ტრიპტიური სოიოს აგარს (TSA, #22091, Fluka), მდიდარ ზრდის საშუალებაზე და ფირფიტები ინკუბირებული იყო 25 °C-ზე, 3 დღის განმავლობაში. სოკოს ზრდის შესაჩერებლად ჩვენ დავამატეთ 100 მგ მლ −1 ციკლოჰექსიმიდი (#01810, Fluka) გარემოს. შემდეგ, ჩვენ შევარჩიეთ ყველა ბაქტერიული კოლონია, რომლებიც აჩვენებს მორფოლოგიურ განსხვავებებს ფერის, ფორმისა და ზომის მიხედვით, თექვსმეტივე ფირფიტისთვის თითო ადგილზე და ვავანოკულირეთ მილები, რომლებიც შეიცავდა 15 მლ ტრიპტური სოიოს ბულიონს (TSB, #22092, Fluka) ერთ კოლონიებთან ერთად კულტურებამდე. მიაღწია 0,6 ოპტიკურ სიმკვრივეს 600 ნმ ტალღის სიგრძეზე. მილები ცენტრიფუგირებული იყო და მარცვლები ხელახლა შეჩერდა 10 მლ TSB-ში.

დასხივება

ზემოთ იზოლირებული ბაქტერიული მორფოტიპები შემთხვევით გადანაწილდა 96 ჭაბურღილიანი მიკროტიტრიანი ბრტყელი ფირფიტის ჭაბურღილებში (84 იზოლატი და სამი ასლი ეშერიხია კოლი K-12 W3110 ლაბორატორიული შტამი, როგორც კონტროლი). ჩვენ გამოვიყენეთ თითოეული კულტურის 15 μl 135 μl TSB თითო ჭაბურღილში დასანერგად. იგივე ინოკულაციის თანმიმდევრობა შენახული იყო 16 მიკროტიტრული ფირფიტის კულტივირებისთვის, რომლებიც გამოყოფილი იყო რადიაციაზე და არ იყო რადიაციული დამუშავება თითო განმეორებით. ამრიგად, თითოეულ ბაქტერიულ იზოლატს ჰქონდა ორი გამეორება და კონტროლი E. coli ექვსი გამეორება თითოეული მკურნალობისთვის. სამი ნიმუში არ გაიზარდა კარგად TSB გარემოში ექსპერიმენტის დროს და ისინი ამოღებულ იქნა ექსპერიმენტებიდან (ორი მაღალი და ერთი დაბალი ფონური რადიაციის შესაბამისად).

ნიმუშები ექვემდებარებოდა რადიაციის ოთხ სხვადასხვა დოზას BIOBEAM 8000 γ დასხივებით (IFR 31, Service de Medicine Nucléaire de Rangueil, Hôpital de Rangueil, ტულუზა, საფრანგეთი), რომელიც აღჭურვილი იყო 137 Cs წყაროთი, რათა გადასცეს რადიაცია 3,82– დოზის სიჩქარით. 4.4 Gy/წთ: ექსპოზიცია 2 საათის განმავლობაში, 0.458–0.528 kGy 4 საათი, 0.917–1.056 kGy 8 საათი, 1.833–2.112 kGy და 15 საათი, 3.438–3.960 kGy. საკონტროლო ფირფიტები (გამოსხივების გარეშე) არ იყო გაჟღენთილი, მაგრამ მოთავსებული იყო გამოსხივების მახლობლად იმავე ოთახში იმავე პერიოდის განმავლობაში, როგორც რადიაციული დამუშავების ფირფიტები მსგავსი გარემო პირობების უზრუნველსაყოფად.

დამუშავების შემდეგ დაუყოვნებლივ, შესაბამისი ფირფიტები ინახება 4 °C-ზე. თითოეული ცალკეული კულტურის ხუთი μL სერიულად განზავებული იყო ახალ მიკროტიტრულ ფირფიტაში, რომელიც შეიცავდა 195 μL TSB-ს. თითოეული ნიმუშისთვის, თითოეული განზავების ხუთი μL დაფიქსირდა LB აგარის ფირფიტებზე, რათა გამოეთვალათ C.F.U.-ების რაოდენობა მლ-ზე 24 საათის შემდეგ ინკუბაციიდან 37 °C-ზე. ბაქტერიების საერთო პოპულაციები გამოითვალა CFU-ების რაოდენობის გამრავლებით შესაბამისი განზავების ფაქტორისთვის. ხუთი ნიმუში ამოღებულ იქნა ყველა ანალიზიდან და კიდევ სამი გამოირიცხა არაპარამეტრული წყვილის შედარებიდან (დამატებითი ცხრილი S3).

მიკრობული სახეობების იდენტიფიკაცია

16 S rDNA გაძლიერდა უნივერსალური პრაიმერებით fD1 და rP2 47. PCR პროდუქტების თანმიმდევრობა 2012 წელს მოხდა მიკრობული სახეობების იდენტიფიცირებისთვის, როდესაც ეს შესაძლებელია და თანმიმდევრობები დეპონირებულია GenBank-ში (დამატებითი ცხრილი S1).

სტატისტიკური ანალიზები

ჩვენ გამოვთვალეთ როგორც გეომეტრიული, ასევე არითმეტიკული საშუალებები CFU-ების რაოდენობის ორი რაოდენობის თითოეული ბაქტერიის მორფოტიპისთვის, პირველი განსხვავებული მნიშვნელობების ზემოქმედების შესამცირებლად მნიშვნელოვან სტატისტიკურ ანალიზებზე, ხოლო მეორე იმიტომ, რომ რადიაციის ქვეშ ერთ-ერთი CFU-ის რაოდენობა იყო ნული. რამდენიმე შემთხვევა. ტექსტში ნაჩვენები ყველა ანალიზი გაკეთდა საშუალო არითმეტიკის გამოყენებით, გარდა სხვა ნახსენებისა. საშუალებები გარდაიქმნა ჟურნალის გამოყენებით ( + 1) ნორმალური განაწილების მიახლოებით. ჩვენ შემდგომში ჩავწერეთ შტამების სიკვდილიანობა და გამოვიყენეთ χ 2 -ტესტი განსხვავებების შესამოწმებლად. ჩვენ გამოვიყენეთ სამმხრივი ANOVA თითოეული ბაქტერიული მორფოტიპის მიერ წარმოქმნილი CFU-ების რაოდენობაში საერთო განსხვავებების შესამოწმებლად რადიაციის ექსპერიმენტული ზემოქმედებით (დასხივებული და არა დასხივებული), ექსპოზიციის დრო (2, 4, 8 და 15 საათი) და ფონური გამოსხივება. (მაღალი, შუალედური, დაბალი და კონტროლი), როგორც ფაქტორები. ANOVA შესრულდა R პროგრამული უზრუნველყოფით 48.

თუმცა, დაკვირვების ბუნებიდან გამომდინარე, ჩვენი ტრანსფორმირებული მონაცემები ბევრ ანალიზში არ აკმაყოფილებდა ჰომოსკედასტურობის ვარაუდს. ამიტომ, ჩვენ ჩავატარეთ Kruskall-Wallis-ის ტესტები, რათა გამოგვემოწმებინა ბაქტერიების გადარჩენის საერთო განსხვავებები ექსპერიმენტული ზემოქმედებით რადიაციაზე, ექსპოზიციის დრო და ფონური გამოსხივების ინტენსივობა და პოსტ-ჰოკ Mann-Whitney წყვილი შედარება თითოეულ ფაქტორში, შესწორებული ბონფერონი. შემდეგ, ჩვენ გამოვთვალეთ 1-მხრივი ANOSIM 49, ბრეი-კერტისის მანძილის გამოყენებით, რათა შევამოწმოთ ურთიერთქმედება ფონური გამოსხივების ინტენსივობასა და მკურნალობას, მკურნალობასა და ექსპოზიციის დროს და ფონური გამოსხივების ინტენსივობასა და ექსპოზიციის დროს შორის. ჩვენ შევაფასეთ როგორც თანმიმდევრული ბონფერონის მნიშვნელობა, ასევე გავასწორეთ ბონფერონი - ღირებულებები. ჩვენ გამოვიყენეთ უფასო პროგრამული უზრუნველყოფა PAST 50.

ექსპერიმენტული დასხივების ზემოქმედების ფარგლებში გამოყოფილი ბაქტერიების თითოეული საზოგადოების მოქმედებაში განსხვავებების შესასწავლად, გამოვიყენეთ ორმხრივი ANOVA ექსპოზიციის დროით (2, 4, 8 და 15 საათი), როგორც და ფონური გამოსხივება (მაღალი, საშუალო, დაბალი და კონტროლი), როგორც ფაქტორები.

და ბოლოს, ჩვენ გამოვიკვლიეთ აქვს თუ არა გავლენა კოლონიის ფერს ბაქტერიების სიკვდილიანობაზე დასხივების პირობებში. ამისათვის, პირველ რიგში, ჩვენ ვიზუალურად გავანაწილეთ ბაქტერიული მორფოტიპები რვა განსხვავებულ კატეგორიად, რომლებიც წინასწარ იქნა დადგენილი ავტორების მიერ, რომლებიც ეფუძნება კოლონიის ფერს ან მორფოლოგიას ხედვით: კრემისფერი (ყველა ის კრემისფერი, ღია ყვითელი ან ოდნავ ვარდისფერი და კრემისებრი კოლონიები), ნარინჯისფერი. (ყველა ფორთოხლის, ატმის ან ღია ფორთოხლის ან ატმის კოლონიები), პაენიბაცილი sp1 (დიდი ფერმკრთალი ქირალური ნიმუშის ფორმირების ბაქტერია), პაენიბაცილი sp2 (გამჭვირვალე ბაქტერიები), ვარდისფერი (ვარდისფერი კოლონიები), მბზინავი (თეთრი და ძალიან ბრწყინვალე კოლონიები), თეთრი (თეთრი კოლონიები) და ყვითელი (ყვითელი კოლონიები). შემდეგ, ჩვენ რაოდენობრივად გავზომეთ საერთო სიკვდილიანობა მკურნალობისა და ადგილის მიხედვით თითოეული ბაქტერიული მორფოტიპისთვის. ჩვენ გამოვიყენეთ χ 2 -ტესტი, რათა გამოგვეკვლია განსხვავებები ფონური გამოსხივების ინტენსივობის, რადიაციის ექსპერიმენტული ზემოქმედების და ცალკეული ბაქტერიების მორფოტიპების მიხედვით მკურნალობაში, როდესაც მორფოტიპი წარმოდგენილი იყო მინიმუმ 10 კოლონიით.


მადლიერებები

ჩვენ ვაღიარებთ სასარგებლო დისკუსიებს ჯონ რ. ბატისტასთან, რამაც ხელი შეუწყო ამ ნაშრომის შედეგების ინტერპრეტაციას. ჩვენ ასევე მადლიერებით ვაღიარებთ D. B. Knowles-ისა და M. Thomas Record-ის დახმარებას pH-ს სიხშირის პროფილის მონაცემების ანალიზსა და ინტერპრეტაციაში ნახ. 6 A.

* ამ სამუშაოს, მთლიანად ან ნაწილობრივ, მხარი დაუჭირა ჯანდაცვის ეროვნული ინსტიტუტის გრანტი GM32335 NIGMS-ისგან (M. M. C.-ს). ამ ნაშრომს ასევე დაუჭირა მხარი ვისკონსინის უნივერსიტეტის სოფლის მეურნეობისა და ცხოვრების მეცნიერებათა კოლეჯის Advanced Opportunity Fellowship-მა და Genentech-ის პრედოქტორანტმა (ორივე K. V. N.). მაიკლ კოქსი არის Recombitech, Inc.-ის გამგეობის წევრი და აქციონერი, რომელიც იყენებს რეკომბინაციულ დნმ-ის შეკეთებას სამედიცინო დიაგნოსტიკის პრობლემებზე. მის ურთიერთობას კომპანიასთან მართავს ვისკონსინ-მედისონის უნივერსიტეტი ინტერესთა კონფლიქტის პოლიტიკის შესაბამისად.


ბიოინფორმატიკის ისტორია

ტერმინი ბიოინფორმატიკა გამოიგონეს პაულიენ ჰოგევეგმა და ბენ ჰესპერმა 1970 წელს. თუმცა, ბიოინფორმატიკის გაჩენა შეიძლება 1960-იან წლებში. ამ ველის გაჩენის მიზეზი ცილების თანმიმდევრობის მეთოდების შემუშავებაა.

ფრედრიკ სენგერმა გამოთვალა ინსულინის თანმიმდევრობა 1950-იანი წლების დასაწყისში. ასე რომ, როგორც ცილების თანმიმდევრობა განვითარდა, საჭირო იყო ინსტრუმენტი, რომელიც გააანალიზებდა და შეადარებდა ცილოვანი თანმიმდევრობის უზარმაზარ რაოდენობას ერთმანეთთან. ხელით შეუძლებელი იყო ამ თანმიმდევრობების წაკითხვა და ანალიზი. წარმოდგენა რომ მოგცეთ, ადამიანის გენომი შედგება 3 მილიარდი წყვილი დნმ-ის ჯაჭვებისგან. და ამ დნმ-ის ჯაჭვების ზუსტი თანმიმდევრობის გარკვევა თითქმის შეუძლებელია გამოთვლითი ძალების გარეშე.

ასე რომ, რადგან ცილების თანმიმდევრობის ანალიზი და შედარება შეუძლებელი ჩანდა, მკვლევარები მუშაობდნენ კომპიუტერული მეთოდების შემუშავებაზე, რომლებიც მათ დაეხმარება. სწორედ მაშინ შეიქმნა პირველი "პროტეინის საინფორმაციო რესურსები" (PIR) მარგარეტ ოკლი დეიჰოფისა და მისი თანამშრომლების მიერ ბიოსამედიცინო კვლევის ეროვნულ ფონდში.

PIR (პროტეინის საინფორმაციო რესურსები) ცილების თანმიმდევრობების ატლასს (რუქას) ჰგავდა. ეს პროტეინის თანმიმდევრობები კლასიფიცირებული იყო სხვადასხვა ჯგუფად და ქვეჯგუფად მათი თანმიმდევრობის მსგავსებისა და პროცენტული მუტაციის (PAM) მატრიცების მიხედვით. მას შემდეგ ეს ატლასი ფართოდ გამოიყენება ბიოინფორმატიკის სფეროში.

1970-იან წლებში ელვინ ა. კაბატმა შემდგომში განაპირობა ველის განვითარება ანტისხეულების პროტეინის თანმიმდევრობის გაფართოებული ანალიზის ჩატარებით. ის თანამშრომლობდა Tai Te Wu-სთან ამ პროექტზე და გამოუშვა ანტისხეულების თანმიმდევრობა b/w 1980 და 1991 წლებში.

გარდა ამისა, სფერო გამდიდრდა შემდეგი მოვლენებით:

· დნმ-ის თანმიმდევრობების შეგროვება GenBank*-ში 1982-1992 წლებში. GenBank მოამზადა Walter Goad-ის ჯგუფმა.

*GenBank არის ყოვლისმომცველი მონაცემთა ბაზა, რომელიც შეიცავს საჯაროდ ხელმისაწვდომ ნუკლეოტიდურ თანმიმდევრობებს 300000-ზე მეტი ორგანიზმისთვის.

· დნმ-ის თანმიმდევრობის მონაცემთა ბაზა უფრო სასარგებლო გახდა, როდესაც მკვლევარებმა შეიმუშავეს ვებ-ზე დაფუძნებული ძიების ალგორითმები. ეს დაეხმარა მკვლევარებს ეპოვათ და შეედარებინათ იმ მომენტში საჭირო მონაცემები. და გადაარჩინა ისინი მთელი თანმიმდევრობის გასავლელად, როცა მხოლოდ მისი მხოლოდ ნაწილი სჭირდებოდათ.

· შემდგომში შეიქმნა პროგრამული უზრუნველყოფა სახელწოდებით GENEINFO, რომლითაც მკვლევარებს შეეძლოთ სწრაფად მოძებნონ თანმიმდევრობები და დაემთხვათ ისინი სხვა თანმიმდევრობებთან.

· ამის შემდეგ ბიოტექნოლოგიური ინფორმაციის ეროვნული ცენტრის (NCBI) მიერ შემუშავებული სხვა პროგრამული უზრუნველყოფა დაეხმარა მოლეკულური თანმიმდევრობის ანალიზს, შედარებასა და ვიზუალიზაციას.

· FASTA და BLAST*-ის განვითარებამ მნიშვნელოვნად გააუმჯობესა ბიოლოგიური მონაცემების ანალიზი

* FASTA და BLAST არის ორი მსგავსების საძიებო პროგრამა, რომლებიც იდენტიფიცირებენ ჰომოლოგიურ დნმ-ის თანმიმდევრობებს და ცილებს. ისინი უზრუნველყოფენ დნმ-ისა და ცილების თანმიმდევრობების შედარების საშუალებას არსებულ დნმ-სა და ცილების მონაცემთა ბაზებთან.

· გარდა ამისა, შეიქმნა ინსტრუმენტები სავარაუდო ცილის თანმიმდევრობების, მათი სტრუქტურისა და ცილების ფუნქციების პროგნოზირებისთვის დნმ-ის თანმიმდევრობებზე დაყრდნობით. ამ ინსტრუმენტებით დასრულდა გენომის სრული თანმიმდევრობა და შეიქმნა სხვადასხვა ორგანიზმების გენომის საბაზისო მონაცემთა ბაზა.

და ბოლოს, ბიოლოგიური მონაცემთა ნაკრების დიდი მოცულობის იდენტიფიკაციის, მონაცემთა შენახვის, მოპოვებისა და მოთხოვნის შესაძლებლობამ გამოიწვია ბიოინფორმატიკის უპრეცედენტო პოპულარობა და გამოყენება.

შემდგომში გასარკვევად ბიოინფორმატიკის ისტორია , მოვლენების ვადების დაცვა სასარგებლო იქნება.

ალფრედ დეი ჰერშიმ და მართა ჩეიზმა დაამტკიცეს, რომ დნმ შეიცავს გენეტიკურ ინფორმაციას

სიდნი ბრენერმა, ფრანსუა იაკობმა, მეთიუ მესელსონმა დაადგინეს რნმ

პაულინგმა წარმოადგინა მოლეკულური ევოლუციის თეორია

მარგარეტ დეიჰოფმა შეიმუშავა პროტეინის თანმიმდევრობის ატლასი

შემუშავებულია Needleman-Wunsch ალგორითმი

შემუშავებულია დნმ-ის თანმიმდევრობის ანალიზის პროგრამა

შემუშავებულია სმიტ-უოტერმანის ალგორითმი

თანმიმდევრობით მონაცემთა ბაზის ძიების ალგორითმი

ბიოტექნოლოგიური ინფორმაციის ეროვნული ცენტრის (NCBI) შექმნა.

EMBnet ქსელი შექმნილია მონაცემთა ბაზის განაწილებისთვის

BLAST, პროგრამული უზრუნველყოფა მიმდევრობის სწრაფი ძიებისთვის

პირველი ბაქტერიული გენომები მთლიანად დაიცვეს თანმიმდევრობით

ქვეყნდება ადამიანის გენომი


2 პროტეინის სინთეზის ინჰიბიტორები

ბაქტერიული ცილის სინთეზის მექანიზმი არის ანტიბიოტიკების მთავარი სამიზნე და იგი გამოიყენება ეფექტური სტრუქტურული ინტერვენციებისთვის ანტიბიოტიკების წინააღმდეგობის წინააღმდეგ. 17, 18 ცილის სინთეზი, რომელსაც ატარებენ რიბოსომები, გარდაქმნის mRNA შესაბამის პოლიპეპტიდურ ჯაჭვად. 19 ეს პროცესი შეიძლება დაიყოს ოთხ ეტაპად: დაწყება, გახანგრძლივება, დასრულება და გადამუშავება. პირველი ორი გამოსახულია ნახაზ 2-ზე და მოკლედ იქნება აღწერილი აქ, რადგან ისინი უზრუნველყოფენ ანტიბიოტიკების ჩარევის რამდენიმე სამიზნეს.

ბაქტერიების გადაცემის მექანიზმი. ხაზგასმულია ანტიბაქტერიული სამიზნეები.

ბაქტერიებს აქვთ 70S რიბოზომები, რომლებიც შედგება ორი ქვედანაყოფისგან. 19-22 დიდი 50S ქვედანაყოფი, რომელიც მოიცავს 23S და 5S rRNA-ებს, აკავშირებს ამინოაცილ tRNA-ს (aa-tRNA), ახდენს პეპტიდილის გადაცემას და აკონტროლებს დრეკადობის პროცესს, ხოლო უფრო პატარა 30S ქვედანაყოფი, რომელიც მოიცავს 16S rRNA-ს, აკავშირებს mRNA და იწყებს ცილის სინთეზს. დაწყების საფეხური მოიცავს ამ ორი ქვედანაყოფის აწყობას mRNA და ინიციატორი fMet-tRNA-ს გარშემო. ეს პროცესი კატალიზებულია სამი პროკარიოტული ინიცირების ფაქტორით: IF1, IF2 და IF3. მიღებულ 70S დაწყების კომპლექსს აქვს სამი ძირითადი tRNA დამაკავშირებელი ადგილი, A, P და E ადგილები. A ადგილი არის ადგილი, სადაც დამუხტული ამინოაცილ-tRNA, რომელიც შეესაბამება mRNA კოდონს, შედის რიბოსომაში. P საიტი ატარებს პეპტიდილ-tRNA-ს, tRNA მზარდი პეპტიდური ჯაჭვის მატარებელი. E საიტი ინახავს დეაცილირებულ ან დაუმუხტველ ტრნმ-ს, სანამ ის რიბოსომიდან გამოვა. დრეკადობის საფეხური არის ციკლი, რომელიც ამატებს ამინომჟავებს მზარდ პეპტიდურ ჯაჭვს ეტაპობრივად და შეიძლება ჩაითვალოს ცილის სინთეზის გულად. პირველ ეტაპზე, სამი კომპლექსი, რომელიც შედგება aa-tRNA, დრეკადობის ფაქტორის Tu და გუანოზინტრიფოსფატისგან (aa-tRNAEF-TuGTP) აკავშირებს A ადგილზე. წარმატებული დეკოდირების შემდეგ, კომპლექსი ჰიდროლიზდება, რის შედეგადაც EF-Tu გადის.მშპ (მშპ: გუანოზინის დიფოსფატი) და არაორგანული ფოსფატი (Pi), რომელიც საშუალებას აძლევს aa-tRNA შევიდეს A ადგილზე და დაუკავშირდეს. შემდეგ პეპტიდური ბმის ფორმირება ხდება მთელი პეპტიდური ჯაჭვის გადატანის გზით პეპტიდილ-tRNA-დან P ადგილზე aa-tRNA-მდე A ადგილზე. ამ რიბოსომულ მდგომარეობამდე ტრანსლოკაციას (PRE მდგომარეობა) ხშირად მოიხსენიებენ, როგორც ჰიბრიდულ მდგომარეობას, რადგან tRNA-ები მოძრაობენ წინ და უკან A/A, P/P, A/P და P/E უბნებს შორის. შემდეგ ეტაპზე, დრეკადობის ფაქტორი G (EF-G) ახდენს tRNA-ს ტრანსლოკაციას2mRNA complex by a distance of one codon (POST state). This results in the deacylated tRNA being moved to the E site, the peptidyl-tRNA being moved to the P site, and the A site becoming free to bind the next aa-tRNA. Until a stop codon enters the A site, this cycle continues, gradually building the full peptide chain. As seen in Figure 2, protein synthesis is targeted by a number of different classes of antibiotics at essentially every step of the process. While some classes of antibiotics such as macrolides, oxazolidinones, and pleuromutilins bind the large 50S subunit, others such as aminoglycosides and tetracyclines interfere with the smaller 30S subunit.

2.1 Oxazolidinones

Structures of the first two oxazolidinones synthesized by Upjohn.

These two molecules were the results of a wide structure–activity relationship (SAR) study that revealed the required substitution on the central oxazolidinone core. 27 Essential factors for antibacterial activity were the -aryl substituent, the 5 configuration, and the C5 acylaminomethyl group. The meta-fluoro substitution of the phenyl ring was not essential, but usually helped to increase activity, and the para-substitution could be varied to expand the antibacterial spectrum.

While oxazolidinones are protein synthesis inhibitors that bind to the ribosome, it has taken a number of years to identify the binding site and most likely mode of action. 28 In 2008, two reported X-ray co-crystal structures of linezolid bound to 50S ribosomal subunits confirmed the previously established site of action and suggested a mode of action (Figure 4). 29, 30

A) Co-crystal structure of linezolid (1 C green, F purple) in the 50S ribosomal subunit from Haloarcula marismortui (PDB ID: 3CPW). B) A model of linezolid (1) in the 50S ribosomal subunit from H. marismortui that has been methylated by Cfr at A2503Ec. The surface clash is highlighted in red. ეშერიხია კოლი numbering in parentheses. Model was generated with Chimera 1.10.1 according to K. J. Shaw et al. 14, 35

Linezolid binds to the A-site pocket of the 50S subunit at the peptidyl transferase center (PTC) in actively translating bacterial ribosomes and interferes with binding of the charged aminoacyl tRNA. Specifically, linezolid binds to a pocket formed by eight RNA residues, one of which, U2585Ec, is stabilized in a distinct conformation. By stabilizing U2585Ec in a nonproductive conformation, linezolid affects the binding and/or positioning of the initiator-tRNA and prevents the binding of tRNA at the A site, thereby halting the translation sequence (Figure 4 A). 29

Resistance to oxazolidinones is still relatively rare. So far, three classes of oxazolidinone resistance mechanisms have been characterized. 31 The first involves mutations in the 23S rRNA central loop of domain V, the peptidyl transferase center. While some of the mutated residues interact directly with the oxazolidinone, many do not but are instead used to stabilize the region surrounding the oxazolidinone. 28 Mutations in these residues lead to small conformational changes of the linezolid binding pocket, which adversely affects drug binding. The second mechanism, which is less common, involves mutations in the genes rplC და rplD, which encode ribosomal proteins L3 and L4, respectively. 31

Beyond these chromosomally encoded point mutations, the last mechanism involves acquisition of the ribosomal methyltransferase gene cfr (chloramphenicol-florfenicol resistance). This resistance is more worrisome than the mutation-based mechanism since it is horizontally transferable and carries a low fitness cost. 32, 33 Mechanistically, the methyltransferase Cfr, through C8 methylation of the key residue A2503Ec in the 23S rRNA, greatly reduces susceptibility to a wide range of ribosome-targeting antibiotics, including amphenicols, lincosamides, pleuromutilins, streptogramin A, 16-membered macrolides, and linezolid. 34 As seen in Figure 4 B, the addition of a methyl group on A2503Ec leads to a steric clash with the acetamide group of linezolid, thereby causing a two- to eight-fold increase in the minimum inhibitory concentration (MIC). 36 Since the discovery of linezolid, over 30 companies have advanced more than a dozen candidates in clinical development. Unfortunately most of these have failed owing to issues related to pharmacokinetic (PK) properties, safety profile, solubility, or lack of improvement of antimicrobial activity over linezolid. Therefore the two main challenges for successful second-generation oxazolidinones are minimizing the myelosuppression safety signal and achieving adequate activity against linezolid-resistant strains of bacteria. 31 Two second-generation oxazolidinones that attempt to solve these problems in a rational way will be presented herein.

2.1.1 Tedizolid

Tedizolid phosphate (3 previously torezolid phosphate, TR-701, DA-7218) is the inactive prodrug of tedizolid (4 previously torezolid, TR-700, DA-7157, which was discovered by Dong-A Pharmaceuticals, and developed by Trius Therapeutics and Cubist Pharmaceuticals). 37, 38 After two successful phase III trials, tedizolid was approved by the Food and Drug Administration (FDA) in June 2014 under the trade name Sivextro for the treatment of MRSA skin infections (Figure 5).

Structures of tedizolid phosphate, tedizolid, and radezolid compared to linezolid.

Structurally, tedizolid presents two main differences compared to linezolid: substitution of the acylaminomethyl group at C5 by a hydroxymethyl moiety and introduction of the C/D ring system, here a 6-(2-methyl-2-tetrazol-5-yl)pyridine (Figure 5). The increase in lipophilicity brought by the addition of the C and D rings obliged the medicinal chemists to find an adequate prodrug that would solve the low aqueous solubility and oral bioavailability problems. 37 A series of formulations was evaluated and the monophosphate ester was found to have the best properties (high water solubility and improved bioavailability) while also masking the primary alcohol, which provided a greatly improved monoamine oxidase inhibition profile. 31

The effect that these structural modifications bring to tedizolid can be clearly seen in Figure 6. At the bottom end of the binding site, the methylated A2503Ec is able to accommodate the sterically compact hydroxymethyl group while still maintaining the hydrogen bonding with G2505Ec. Additionally, the proposed binding model predicts two new stabilizing hydrogen bonds between the C/D ring system and the backbone ribose sugars of A2451Ec and U2584Ec.

Models of tedizolid (4) (C green, F purple) in A) the 50S ribosomal subunit from H. marismortui (PDB ID: 3CPW) and B) the 50S ribosomal subunit from H. marismortui that has been methylated by Cfr. Even with methylation at A2503Ec, tedizolid (4), unlike linezolid, is able to bind to the ribosomal RNA. E. coli numbering in parentheses. Models generated with Chimera 1.10.1 and AutoDock Vina 1.1.2 according to K. J. Shaw et al. 14, 16, 35

In a study of its activity against linezolid-resistant staphylococci, tedizolid showed a more than 16-fold improvement compared to linezolid. 39 It also maintained activity against most of the tested isolates, including multidrug-resistant ones, thus clearly demonstrating the benefit of the structure-based approach.

2.1.2 Radezolid

Radezolid (5 previously RX-1741 and Rx-01_667 Figure 5) is a fully synthetic oxazolidinone (developed by Melinta Therapeutics, formerly Rib-X) that has completed two phase II clinical studies. 40 Radezolid is the result of a program developed to expand the spectrum of oxazolidinones to Gram-negative bacteria and optimize drug-like properties. 41 The program started with the observation that linezolid and sparsomycin (6, a non-selective antibiotic) had overlapping binding sites within the peptidyl transferase center of the 50S ribosomal unit (Figure 7). 42, 43

Overlay of sparsomycin (6) (C orange) and linezolid (1 C green, F purple) in the 50S ribosomal subunit of H. marismortui (PDB IDs: 1M90, 3CPW).

The strategy was therefore to link the two molecules together via an adequate bridging element and make the required structural modifications on the sparsomycin side to increase potency and selectivity. 41, 44 Figure 8 shows two (7 და 8) of the numerous bridged antibiotics that were synthesized on the road to radezolid and clearly shows the evolution of the western half and the bridging unit.

Structures of sparsomycin, linezolid, and molecules developed on the way to radezolid.

Once the optimal structural elements were determined, the activity of radezolid was assessed and it was found to bind with higher affinity to the ribosome than linezolid, which gave it enhanced antibacterial activity (2–8-fold improvement over linezolid) against various Gram-positive pathogens. 45 Structure–activity studies of diverse oxazolidinones revealed that despite the presence of a C5 acylaminomethyl group in radezolid, it retains activity against the clinical cfr-positive CM05 strain of S. aureus with a minimal inhibitory concentration (MIC) value of 2 μg mL −1 , which is between those of tedizolid (0.5 μg mL −1 ) and linezolid (8 μg mL −1 ). This is most likely due to additional binding interactions of the C/D ring system with the PTC, far from the ribosomal modifications that lead to resistance to linezolid, including the cfr-mediated methylation of A2503Ec. 36, 40, 46 Most noteworthy is the fact that the spectrum could be expanded to Gram-negative organisms such as ჰემოფილუს გრიპი და Moraxella catarrhalis. Additional features of radezolid, besides overcoming the ribosomal mutation resistance, include a 100-fold decreased activity in inhibiting translation in rabbit reticulocytes than in S. aureus ribosomes and interaction with U2585Ec, as verified by biochemical assay. 40

2.2 Macrolides

Macrolides are a family of 14-, 15-, and 16-membered polyketide lactone rings with one or more neutral or amino sugar substituents at various positions (Figure 9). 47 Erythromycin (9), the first and prototypical macrolide, was isolated from actinomycete bacteria in 1949. 48 It was first used clinically in the early 1950s, but owing to its acid instability, second-generation semisynthetic macrolides such as clarithromycin (10) 49 or azithromycin (11) 50 were developed (Figure 9). Subsequently, owing to the emergence of resistance to first- and second-generation macrolides, a third generation, coined the ketolides, was developed. In these 14-membered lactone rings, the cladinose sugar at C3 is replaced by a ketone moiety, C11 and C12 are now part of an oxazolidinone ring, and an alkyl-aryl side chain is appended to the macrolactone core. Telithromycin (12) is the only registered ketolide to date (Figure 9).

Structures of the three macrolides erythromycin, clarithromycin, and azithromycin, as well as the ketolide telithromycin.

Like many other antibiotic classes, macrolides are bacteriostatic. They bind to the 50S ribosomal subunit in the vicinity of the peptidyl transferase center just above the constriction formed by the extended loops of ribosomal proteins L4 and L22 and were originally thought to inhibit protein synthesis by completely obstructing the ribosomal tunnel. 51 In fact, modeling studies have shown that even with a bound macrolide, the tunnel can still accommodate a nascent peptide chain. The macrolide nevertheless greatly hinders the progression of the peptide, which is usually dissociated by the peptidyl-tRNA drop-off mechanism before reaching its full size. 51, 52 Macrolides have also been shown to block the formation of the large 50S ribosomal subunit by binding to its precursors. 53

A number of co-crystal structures of macrolides bound to the ribosome have been published and they show that the main component in the binding pocket is A2058Ec. 54-56 Key interactions include polar contacts between the functional groups of the C5 desosamine sugar and residues A2058Ec and A2059Ec, as well as hydrogen bonds between the three lactone hydroxy groups and the 50S ribosomal subunit (Figure 10).

Overview of the binding mode of erythromycin (9 C green) to the 50S ribosomal subunit (PDB ID: 1JZY) from Deinococcus radiodurans. The nucleotides are labeled according to D. radiodurans (E. coli in parentheses).

Bacteria have developed a number of mechanisms of resistance to macrolides. 57 Even though the majority of them involve alterations at the ribosomal target site, substrate inactivating enzymes (mainly esterases) and efflux mechanisms have also been reported. Alteration of ribosomal binding sites usually leads to failure of the antibiotic to bind, which in turn disrupts its ability to inhibit protein synthesis. In the case of macrolide resistance, these alterations mainly take place in one of two ways. The first, which has the smallest effect, is modification of the ribosomal proteins L4 and L22 at the end of their hairpin structures, close to the binding site. 58 Interestingly, mutations at L4 lead to large reductions in the binding affinity while the L22 mutants show no change in the binding constant but still confer resistance. This is explained by a widening of the tunnel, which allows passage of the peptide without affecting the binding. 59 The second and most common resistance mechanism is modification of the rRNA. This takes place, unsurprisingly, on A2058Ec, the key component of the binding pocket. Mono and dimethylation of A2058Ec are carried out by erythromycin ribosome methylation (Erm) methyltransferases. 60 While monomethylation confers only moderate resistance to macrolides and none to ketolides, dimethylation leads to complete blocking of the binding site and high resistance to both macrolides and ketolides. 18, 61 Mutation of A2058Ec into G2058Ec also induces resistance owing to the similar increase in steric bulk. Notably, in archaea and eukaryotes, position 2058Ec is naturally a guanine, which explains the selectivity for bacteria. 62

As mentioned earlier, ketolides were developed in an effort to counter resistance to macrolides. Their key features include a 14-membered macrolactone, the replacement of the C3 cladinose sugar by a keto group, a cyclic carbamate and an extended alkyl-aryl side chain (Figure 11). The C3 keto group gives rise to potent activity against strains with Erm-mediated inducible resistance and surmounts resistance through efflux. 63 It also removes some of the steric hindrance around the desosamine sugar, which allows it to reposition itself when binding to monomethylated ribosomes. 64 The cyclic carbamate introduces additional interactions with the ribosome, which stabilize the conformation of the core macrolide and lead to potent antibacterial activity. 65 Crystal structures of ketolides in both D. radiodurans და ში H. marismortui have been published and show notable differences in their binding modes. 51, 56, 66, 67 Indeed, when complexed to the ribosome of H. marismortui, the side chain of telithromycin resides over the plane of the macrolactone ring (PDB ID: 1YIJ) 56 whereas with the ribosome of D. radiodurans, the side chain points away from the macrolactone core (PDB ID: 1P9X). 66 This clearly highlights the importance of crystallographic data and is a good reminder to exercise caution when using models. Nevertheless, the common feature is that the ketolides not only bind to domain V in a similar fashion as macrolides, but their elongated side chains engage in additional interactions in domain II. This results in tighter binding and allows them to compensate for modifications in domain V resulting from mutation or methylation.

Structures of the ketolides telithromycin and solithromycin.

Telithromycin (12) is currently the only ketolide on the market, but following safety controversies, it has been partially withdrawn. 68 Its use has been associated with severe hepatotoxicity along with blurred vision and serious cases of liver failure. 69 These are believed to result from inhibition of the nicotinic acetylcholine receptors. The pyridine ring in the extended side chain of telithromycin has been suggested to be the culprit. 70 New ketolides lacking this problematic pyridine ring are currently being investigated.

2.2.1 Solithromycin

Solithromycin (13 previously CEM-101, developed by Cempra) is a 2-fluoroketolide currently undergoing phase III clinical trials. As seen in Figure 11, solithromycin is very similar to telithromycin, with only two minor modifications. The first is replacement of the aforementioned problematic imidazolyl pyridine with a triazolyl aniline, and the second is the introduction of a fluorine atom at the C2 position. Removal of the imidazolyl pyridine resulted in a 30-fold reduction in the inhibition of nicotinic acetylcholine receptors compared to telithromycin. 70 As mentioned earlier, previous X-ray structures of ribosome-bound ketolides showed very different orientations of their alkyl-aryl side chains depending on the bacterial species. Therefore, questions remained as to the actual binding mode of solithromycin and telithromycin in pathogenic bacteria. In 2010, Cate, Mankin, and co-workers crystallized solithromycin as well as telithromycin in complex with the E. coli ribosome and were able to indicate that the placement of these ketolides most likely reflects the binding in S. aureus ribosomes given the sequence conservation of the A752:U2609 base pair among many eubacteria. 71, 72

These crystal structures delivered revealing insight into various aspects of the interaction (Figure 12). A stacking interaction can be seen with the A752:U2609 base pair, which is present in the ribosome of E. coli and many other pathogenic bacteria. The aniline moiety, which replaces the detrimental pyridine is shown to form additional hydrogen bonds, notably to A752 and G748, and results in tighter binding. Finally the fluorine atom at the C2 position was shown to contribute to drug binding as well as chemical properties such as solubility and cellular uptake. 73 Indeed, in comparison to non-fluorinated analogues, the fluorinated versions showed stronger inhibition of the growth of streptococci carrying the ემ გენი. Interestingly, for solithromycin, weak binding to ribosomes dimethylated at A2058Ec could be detected by chemical probing. 71 Key structural features of the ketolides are summarized in Figure 13 (for an example of a ketolide with a 6--attached side chain, see cethromycin). 74, 75

Overlay of telithromycin (12 C green, PDB ID: 4V7S) and solithromycin (13 C yellow, F purple) in the 50S ribosomal subunit (PDB ID: 4WWW) from E. coli. Nucleotides are labeled using the E. coli numbering system.

Structure–activity relationships of ketolides.

2.3 Thiopeptides

The thiopeptides are a family of highly modified sulfur-rich macrocyclic peptides (Figure 14, numbering according to thiomuracin A), 76 which have been isolated from diverse sources such as soil bacteria and marine samples. 77 While there are now over 100 known thiopeptides, the first member, micrococcin P1 (14), was isolated in 1948. 78 These molecules are of ribosomal origin, are highly posttranslationally processed, and feature a characteristic macrocyclic core consisting of multiple thiazoles and a 6-membered nitrogen-containing heterocycle, which can be found in different oxidation states. While thiopeptides are a new class of antibiotics with a novel mechanism of action, their use as an antibiotic treatment option has been hampered by their very large molecular size and poor aqueous solubility. Thiopeptides are inhibitors of protein synthesis, but their mode of action differs depending on the size of the macrocycle. Thiostrepton A (15), 79 the archetypal thiopeptide, and micrococcin P1 possess 26-membered macrocyclic cores and are known to bind to the GTPase-associated region of the ribosome/L11 protein complex. 80 Thiopeptides with 29-membered macrocyclic cores such as GE2270 A (16), on the other hand, interact with GTP-bound bacterial EF-Tu, preventing the formation of the ternary complex with aa-tRNA. 81

Structures of thiopeptides.

GE2270 A was isolated in 1991 by scientists at Lepetit Research Institute. 82 Although the in vitro activity of this compound was shown to be excellent against MRSA, VRE, and streptococci, poor aqueous solubility prevented further development. 83 Two derivatives are currently being investigated.

2.3.1 LFF571

In order to increase the water solubility of GE2270 A, the unstable oxazoline side chain was replaced with solubilizing functional groups (Novartis). The 4-aminothiazolyl moiety was chosen as a starting point and a wide variety of amines and acids linked via different spacers were synthesized. 83-85 Guided by co-crystal structures with EF-Tu, this search led to the discovery of two potent analogues with cyclohexylcarboxylic acid side chains residing in proximity to the Arg223 residue of EF-Tu.

These compounds were then improved by the addition of a second solubilizing group. 86 Taking into account the position of Arg262, a large variety of differently linked acids were synthesized. It was found that a pentanoic acid residue appended onto the aminothiazole was the best since it placed the acid in proximity to this residue (Figure 15). The resulting compound, named LFF571 (17), also showed very high aqueous solubility (>10 mg mL −1 ). Triacid-containing analogues were also synthesized but these both failed to yield additional benefits and greatly increased the synthetic complexity, and they were therefore not pursued. LFF571 is currently undergoing phase II clinical trials against C. difficile ინფექციები.

Co-crystal structure of LFF571 (17 C green) and EF-Tu (PDB ID: 3U2Q) from E. coli. The carboxylic acid groups of LFF571 are in proximity to Arg223 and Arg262.

2.3.2 NVP-LDU796

In 2009, the isolation of thiomuracins, a novel class of antibiotic thiopeptides, was reported (Novartis). 76 These secondary metabolites, which are produced by a strain of Nonomuraea, are structurally related to GE2270 A and share the same mechanism of action, namely binding to EF-Tu. The thiomuracins show potent antibiotic activity against MRSA and VRE, with minimum inhibitory concentrations below 1 μg mL −1 . Unfortunately, as with GE2270 A, these novel molecules are plagued by solubility and stability problems. In 2012, the same group reported the synthesis of a novel derivative of thiomuracin A (18), termed NVP-LDU796 (19), which retains antibacterial activity and shows improved chemical stability and physiochemical properties (Figure 14). 87 Key modifications include removal of the C2–C10 side chain and conversion of the C84 epoxide into an N70–C84 pyrrolidine ring. In co-crystal structures of NVP-LDU796 (19) with EF-Tu, the conformation adopted is very similar to the those of GE2270 A and LFF571, with key interactions still present (PDB ID: 4G5G). 87

2.4 Tetracyclines

Tetracyclines are broad-spectrum antibiotics with activity against both Gram-positive and Gram-negative bacteria. 88 Chlortetracycline (20), the oldest member of this class, was discovered in 1945 and first used clinically in 1948 (Figure 16). 89 Since then, only three other naturally occurring tetracyclines have been discovered (tetracycline (21), 90 oxytetracycline (22) 91 and demethylchlortetracycline (23) 92 ), while countless others have been derived semisynthetically, including doxycycline (24) 93 and minocycline (25). 94 Tetracyclines are easily recognizable by their four highly oxygenated fused rings and they show favorable antimicrobial properties along with an absence of major side effects, which has led to their extensive use in both human and animal infections. The third generation of tetracyclines, the glycylcyclines (Figure 17), were introduced 10 years ago, with the first and so far only clinically used member being tigecycline (26, previously GAR-936, discovered at Wyeth-Ayerst Research). 95

Structures of representative tetracycline antibiotics.

Structures of representative glycylcycline and aminomethylcycline antibiotics.

Glycylcyclines can be recognized by the glycylamido substituent on the C9 carbon. The tert-butylglycylamido moiety of tigecycline engages in stacking interactions with C1054 of the 16S rRNA, which leads to increased potency of tigecycline compared to tetracycline (Figure 18). 96

Overlay of tetracycline (21 C yellow PDB ID: 4V9A) and tigecycline (26 C green, Mg 2+ ions light brown PDB ID: 4V9B) bound to the 30S ribosomal subunit (PDB ID: 4V9B) from თერმუს თერმოფილუსი. Tigecycline makes additional stacking interaction with C1054 compared to tetracycline. T. thermophilus numbering is used for the nucleotides.

Tetracyclines are primarily bacteriostatic. They penetrate the outer membrane of Gram-negative bacteria by passive diffusion through the OmpF and OmpC porin channels as divalent metal-ion chelates. 88 Once inside the periplasm, the liberated neutral tetracycline diffuses through the inner membrane in the same way that it penetrates Gram-positive bacteria and other organisms, namely by energy-dependent active transport. Once inside the cytoplasm, the higher pH and metal-ion concentration lead to the regeneration of a metal-ion/tetracycline complex that is postulated to be the active species. This complex then binds reversibly to the A site on the head of the 30S subunit (Figure 18). 96, 97 This binding site has a slight overlap with the anticodon stem-loop, which correlates well with previous observations that tetracycline prevents binding of the aforementioned aa-tRNAEF-TuGTP ternary complex to the A site. 98

Resistance to tetracyclines can occur through four different mechanisms. 88 The proteins responsible for three of these mechanisms are encoded by the tet (tetracycline) and otr (oxytetracycline) genes, over 40 of which have been characterized. Of these, only three, namely tet(X), tet(34), and tet(37), lead to an enzymatic-alteration resistance mechanism where the encoded proteins chemically modify tetracycline. 88 Of the remaining genes, approximately two thirds encode efflux proteins and the others encode ribosomal protection proteins (RPPs). The efflux proteins occur in both Gram-positive and Gram-negative bacteria, but are more prominent in the latter. They are membrane-associated proteins and export tetracyclines from the cell, which effectively protects the ribosome by reducing the intracellular concentration of the antibiotic. Ribosomal protection proteins are cytoplasmic proteins that protect the ribosome from the action of tetracyclines by reducing their susceptibility. They are also found in both Gram-positive and Gram-negative bacteria, but they are usually more common in Gram-positive organisms, and tet(M) and tet(O) are the two most common genotypes. Mechanistically, these proteins cause allosteric disruption of the primary tetracycline binding site, which leads to the release of bound tetracycline molecules. 99 The ribosome is then able to return to its productive conformation and resume protein synthesis. The last and most recent mechanism of resistance involves mutations in the vicinity of the tetracycline binding site. 100

The presence of the tert-butylglycylamido moiety in tigecycline (26) interferes with the binding of TetM to the ribosome and thereby enables the drug to overcome TetM-mediated resistance. As shown in Figure 19, tigecycline and TetM overlap in the ribosome owing to the bulky tert-butylglycylamido substitution of the drug molecule. 96

Overlay of TetM (blue ribbon PDB ID: 3J25) and tigecycline (26 C green, Mg 2+ ions light brown PDB ID: 4V9B) bound to the 30S ribosomal subunit (PDB ID: 4V9B) from T. thermophilus. The superimposition was generated by means of the cryo-electron microscopy density map EMD-2183 of the TetM-70S complex from E. coli according to Jenner et al. and Dönhöfer et al. 96, 99

2.4.1 Omadacycline

Omadacycline (27 previously PTK-0796, Paratek Pharmaceuticals, Figure 17) is a semisynthetic tetracycline derivative and the first member of the novel aminomethylcycline class. It is currently undergoing phase III clinical trials for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections (ABSSSI), community-acquired bacterial pneumonia (CABP), and complicated urinary tract infection (cUTI). Omadacycline has been shown to be active against strains that express either efflux proteins (tet(K)) or ribosome protection (tet(M)), while also exhibiting moderate inhibition of peptidoglycan synthesis. 101, 102 The exact mechanisms by which omadacycline evades both efflux and ribosome protection are not fully known, but it is believed that omadacycline is a poor substrate for efflux transporters and that it binds in a unique way that circumvents the action of ribosome protection proteins. 101 Both of these factors almost certainly arise from the structural modification at C9 of the tetracycline core.

2.5 Aminoglycosides

Aminoglycosides are hydrophilic molecules comprised of a central aminocyclitol core linked to one or more amino sugars. In most cases, the aminocyclitol is streptamine or 2-deoxystreptamine (28 და 29, Figure 20). Depending on the substitution pattern, aminoglycosides can be grouped into four different subfamilies: monosubstituted (such as neamine (30)), 103 atypical, 4,5-disubstituted, and 4,6-disubstituted (Figure 20). 104 The aminoglycoside family of antibiotics is one of the oldest, with its first member, streptomycin (31), being discovered more than 70 years ago in 1944. 105 Despite their long history, widespread resistance, and possible safety issues such as nephrotoxicity and ototoxicity, aminoglycosides are still widely used. 106

Structures of typical and atypical aminoglycosides. The aminocyclitol core is highlighted in blue.

The aminoglycosides have two distinct main mechanisms of action. They are not only potent inhibitors of translocation but are also able to induce misreading by stabilizing the binding of near-cognate tRNAs and promoting their incorporation into peptide chains. 104 The high fidelity of translation (error frequencies ranging from 10 −3 to 10 −4 per codon) 107 is achieved by the ability of the ribosome to select the proper (cognate) tRNA over a wrong (non-cognate) one at the A site.

The structure of the 30S ribosome shows a “decoding” site within helix 44 (h44) of the 16S rRNA. In this asymmetric internal loop, two universally conserved adenine residues, A1492 and A1493, are directly involved in the decoding process, during which they flip out of the helix to analyze the codon–anticodon complex. 108 The energy needed for this flip is thought to be compensated by stabilizing interactions between the nucleotides and the codon–anticodon complex, but only in the case of a cognate tRNA. When a non- or near-cognate tRNA binds, the energy compensation is insufficient and the tRNA dissociates. Upon binding within the internal loop of h44, aminoglycosides induce a local rearrangement that flips A1492 and A1493 out of the helix and stabilizes them in this open conformation (Figure 21). 109 This results in near-cognate tRNA being fully accommodated in the A site, with the consequence that incorrect amino acids are incorporated into the peptide chain.

Kanamycin A (37 C green) in complex with a decoding A-site oligonucleotide (PDB ID: 2ESI). A1492 and A1493 are kept in the flipped-out position by kanamycin A. E. coli numbering is used for the nucleotides.

When the altered proteins are inserted into the cell membrane, the permeability is modified, which in turn leads to an increase in aminoglycoside uptake (hence their high bactericidal and concentration-dependent activity). Co-crystal structures of a variety of bound aminoglycosides have been published, including with streptomycin (31, PDB ID: 1FJG), 110 spectinomycin (32, PDB ID: 1FJG), 110 hygromycin B (33, PDB ID: 1HNZ), 97 neomycin B (34, PDB ID: 4V52), 111 paromomycin (35, PDB ID: 1FJG, 1IBK), 110, 112 tobramycin (36, PDB ID: 1LC4), 113 and kanamycin A (37, PDB ID: 2ESI). 109

Bacteria have developed three different mechanisms of resistance to aminoglycosides: uptake inhibition or efflux, ribosome modification, and aminoglycoside modification. 114 The first two mechanisms are relatively rare and have not been targeted yet. Aminoglycoside-modifying enzymes (AMEs), on the other hand, are widespread and the most common mechanism of resistance. These enzymes are described according to the modification they promote, along with the carbon atom at which the modification takes place. 115 The three known types of enzymes are aminoglycoside N-acetyltransferases (AACs), aminoglycoside O-nucleotidyltransferases (ANTs), and aminoglycoside O-phosphotransferases (APHs). Figure 22 shows the co-crystal structure of kanamycin A (37, Figure 20) with the aminoglycoside-modifying enzyme ANT(2′′)-Ia. 116 The 2′′ hydroxy group is complexed to the magnesium ion, ready to be modified by the enzyme.

Co-crystal structure of kanamycin A (37 C green) and adenylyltransferase ANT(2“)-Ia (Mg 2+ ions light brown PDB ID: 4WQL) from Klebsiella pneumoniae. Kanamycin A is kept in place by a hydrogen-bonding network.

A second generation of aminoglycosides called neoglycosides, 117 which maintain the potency of first-generation aminoglycosides while evading modification enzymes, is currently being researched.

2.5.1 Plazomicin

Two aminoglycosides, sisomicin 118 and amikacin 119 (38 და 39 Figure 23), were used as inspiration for the development of the semisynthetic plazomicin (40, formerly ACHN-490, developed by Achaogen), which is the first molecule of this new family (Figure 24). 117

Structures of sisomicin and amikacin.

Structure of plazomicin and AME modification sites. The HABA chain (blue) blocks modifications at the 3- and 2′′- positions, the hydroxyethyl chain (red) blocks modifications at the 6′- position, and the absence of hydroxy groups at C3′ and C4′ prevents modification at these positions. Only the 2′- position remains unblocked to AACs.

The difference between sisomicin and plazomicin is the presence of two side chains on the nitrogen atoms at C1 and C6′ in plazomicin. As highlighted in Figure 24, the hydroxyethyl chain shown in red blocks AAC(6′), while the amikacin-derived hydroxyaminobutyric acid (HABA) chain shown in blue blocks AAC(3) along with ANT(2′′) and APH(2′′). 120, 121 Compared to kanamycin A, plazomicin is also protected from APH(3′) and ANT(4′) by the absence of hydroxy groups at positions C3′ and C4′. The only aminoglycoside-modifying enzymes that plazomicin is still vulnerable to are AAC(2′) enzymes, but so far the expression of these enzymes has been detected only in Providencia stuartii. In MDR Enterobacteriaceae, including carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE), plazomicin remains active where most other antibiotics, including the commercially available aminoglycosides, show limited potency owing to resistance.


მეთოდები

Database implementation

DRAGdb comprises of a single table where each mutation entry is uniquely identified with DRAGDB_ID as the primary key. The NUCLEOTIDE_POSITION, NUCLEOTIDE_CHANGE, AMINOACID_POSITION, AMINOACID_CHANGE define the mutation point at both levels. The PUBMED_ID provides PubMed identifier, hyperlink to PubMed database and ENSEMBL_BACTERIA_ID provides the gene identifier.

DRAGdb was developed using the Apache HTTP 2.2.15 web server and MySQL 5.1.69. The PHP 5.3.3, HTML, JavaScript and CSS were used to build the web interfaces of the database. The PHP-based web interfaces execute the SQL queries dynamically. It is freely accessible at http://bicresources.jcbose.ac.in/ssaha4/drag.

Data curation

The PubMed database (till March 2018) was searched for studies that reported at least one mutation in rpoB, pncA, inhA, katG, embA, embB, embC, gidB, rpsL, rrs, gyrA და gyrB associated with resistance to rifampicin, pyrazinamide, isoniazid, ethambutol, streptomycin and fluoroquinolones respectively in MTB, ESKAPE and other bacterial species. The literature was searched using advance search option of PubMed with the terms: “Gene name (Abstract/title) AND Resistance (Abstract/title) AND mutation (Abstract/title) AND/ NOT tuberculosis (Abstract/title)”. The combination of search terms helped to obtain instances with cross resistance and multiple resistances. In total, 2548 unique publications were obtained from this search. The publications that were missing full English text in public domain, or lacked relevant data or had ambiguous data were filtered out. Around 604 publications were systematically reviewed to obtain mutational information. All the mutations described in drug resistant bacterial strains in the literature were manually read, further curated and compiled in the database. The devised methodology is given as workflow in Supplementary File 1: Figure S3.

Mutation data analysis with reference to MTB H37Rv

All the gene mutations reported in the literature across bacterial species have different numbering systems (NS) thus leading to genetic location inconsistency and conflict. One of the examples of NS discrepancy is of gyrA in MTB, for which 4 different NS were found in the literature 54 . For better understanding and comparison across species of a single gene, ტუბერკულოზის მიკობაქტერია H37Rv was selected as reference organism, further multiple sequence alignment (MSA) was performed at amino acid codon level for each drug resistance gene to have single numbering system across all organisms. MSA was performed on on-line Clustal Omega platform using default iterated mBed-like Clustering Guide-tree 55,56 . The rational for choosing MTB as reference genome was due to the fact that exposure of 3–6 antibiotics including broad spectrum antibiotics during TB treatment for 6 months results in known multiple drug resistance phenotypes. The MSA of the regions of interest for genes such as gyrA, gyrB, rpoB, და rpsL were shown in Supplementary File 1: Figures S1(A–D). The common reference number at the amino acid codons level of drug resistance genes across bacterial species helped in calculating frequency of mutated codon positions in DRAGdb. The frequency percentage was calculated using the following formulae –

where (_) is the frequency percentage of (^) codon or nucleotide position in a gene of (^) group, (x) can be all organisms, Mycobacterium, ESKAPE pathogens or other bacteria. (_) is the number of mutation entries of (^) codon or nucleotide position in the gene of (^) group in DRAGdb. (mathoplimits_^_) is the total number of mutation entries in the drug resistance determining region (DRDR) of the gene, (j) is the starting codon or nucleotide position and (t) is the end codon or nucleotide position of DRDR. The number of mutation entries was calculated based on report of a single mutation across various PubMed literature. We assume that the higher the number of publications reporting a particular drug resistance determining gene mutation, the higher is the confidence of that mutation entry.

Functional effects of the mutations

The functional effects of the unique SNPs in drug-resistance genes in different bacteria were predicted using PROVEAN webserver with Score thresholds for prediction as of −2.5. The variants with score equal to or below of −2.5 were considered “deleterious”, and the variants with score of above −2.5 were considered “neutral” 57 .

Blast search

A customized BLAST database was created with wild type and mutated small nucleotide stretches of drug resistance determining regions of associated genes. The mutated sequences were modified wild type sequences with incorporation of single mutations enlisted in DRAGdb. blastall, a package for BLAST search was used 58 . formatdb utility from that package was used for converting nucleotide FASTA sequences to BLAST database. blastn program was used to find similar sequences to query sequences in the BLAST database.

DRAGdb user interface

The ‘HOME’ page of DRAGdb web interface provides two different search options: 1) keyword search: a single keyword can be searched specific to bacteria, resistant drugs, genes, geographical location or ‘ALL’ option to search in any category. 2) Advance search: three fields are present where bacteria and gene name are mandatory and drug name is optional. Both the search options will generate a table giving details of the mutations related to the search and also provide the number of specific entries. The DRAGdb result pages also contain hyperlinked Ensembl Bacteria IDs, PROVEAN score and PubMed IDs. To keep with the open access policy, the result table can be downloaded by the users. The ‘BROWSE’ page allows users to browse DRAGdb data in three categories: 6 drugs, 12 genes, and 126 bacterial species. It shows the comparison of DRAGdb data with other tuberculosis databases namely, TBDReaMDB and MUBII-TB-DB. The ‘Organisms’ section is further divided into 3 parts: ‘Mycobacterium tuberculosis’, ‘ESKAPE’ and ‘others’ which includes other bacterial species. The entries within the three categories are linked to DRAGdb table and provide specific results with details of the gene mutations. The nucleotide BLAST search with customized BLAST database is incorporated in the ‘TOOL’ page to determine whether the users input bacterial gene sequence is drug resistant. Users can define the ‘E-value’ for BLAST operation. The output page shows the user input sequence, the DRAGDB_ID of the best hit, the BLAST score and E-value of the hit. ‘OTHER LINKS’ page is also included to help users find popular TB and antibiotic resistance related databases and webservers. To guide users through DRAGdb, a ‘HELP’ page is also presented in the online web server.

Data visualization

The bar plots for representation of frequency % of various codon level mutations of drug resistance genes across bacterial species were drawn using Microsoft office excel. The circular plots for representations of homoplasy and pleiotropy were drawn using ‘circlize’ R package 59 .


Უყურე ვიდეოს: Can You Become Immune To Radiation? (აგვისტო 2022).