ინფორმაცია

2.5: დნმ-ის რეპლიკაცია – ბიოლოგია

2.5: დნმ-ის რეპლიკაცია – ბიოლოგია



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

პრობლემის ფარგლები

ამ მოდულში განვიხილავთ დნმ-ის რეპლიკაციას - ერთ-ერთი მთავარი მოთხოვნა ცოცხალი სისტემის რეგენერაციისა და მომავალი თაობის შესაქმნელად. ჯერ მოკლედ განვიხილოთ პრობლემის ფარგლები ლიტერატურული ანალოგიით.

ადამიანის გენომი შედგება დაახლოებით 6,5 მილიარდი ბაზის წყვილი დნმ-ისგან, თუ გავითვალისწინებთ სრულ დიპლოიდურ გენომს (ანუ, თუ ჩავთვლით ორივე მშობლის მემკვიდრეობით დნმ-ს). ექვსი წერტილი ხუთი მილიარდი ასე გამოიყურება: 6,500,000,000. ეს დიდი რიცხვია. უკეთ რომ წარმოიდგინოთ, რას ნიშნავს ეს რიცხვი, წარმოიდგინეთ, რომ ჩვენი დნმ არის წერილობითი ინსტრუქციების ერთობლიობა ერთი ჩვენგანის ასაგებად. ანალოგიით ჩვენ შეგვიძლია შევადაროთ ის სხვა წერილობით დოკუმენტს. ამ მაგალითისთვის ჩვენ ვიწყებთ ტოლსტოის "ომი და მშვიდობის" განხილვით, რომანი, რომელსაც ბევრი ადამიანი იცნობს თავისი მოცულობითი ბუნებით. ვიკიპედიის მონაცემებით, "ომი და მშვიდობა" შეიცავს დაახლოებით 560 000 სიტყვას. მეორე წერილობითი ნაშრომი, რომელსაც ბევრი იცნობს, არის ჯ.კ. როულინგის "ჰარი პოტერი". ეს ნამუშევარი შემოწმებულია ~1,080,000 სიტყვაზე (მინიშნებული სტატისტიკა ვიკიპედიაზე). თუ დავუშვებთ, რომ საშუალო ინგლისური სიტყვის სიგრძე 5 ასოა, ორი ლიტერატურული ნაწარმოები 2,8 მილიონი და 5,4 მილიონი ასოა, შესაბამისად. მაშასადამე, „ჰარი პოტერის“ შვიდივე ტომსაც კი 1000-ჯერ ნაკლები ასო აქვს, ვიდრე ჩვენს გენომს. თუმცა ამ 7 რომანში ასოების რაოდენობა ბევრად უფრო ახლოსაა ტიპიური ბაქტერიული გენომის ნუკლეოტიდების რაოდენობასთან.

ახლა წარმოიდგინეთ, როგორ აკოპირებთ ამ ტექსტებს. რამდენად სწრაფად შეგეძლო ამის გაკეთება? რამდენი შეცდომის დაშვების ალბათობა გაქვთ? ელით თუ არა, რომ იქნება კომპრომისი სიჩქარეს, რომლითაც შეგიძლიათ კოპირება და სიზუსტეს შორის? რა ტიპის რესურსები სჭირდება ამ პროცესს? რამდენი ენერგიაა საჭირო? ახლა წარმოიდგინეთ რაიმეს 1000-ჯერ დიდი კოპირება!

ამის გათვალისწინებით, აღსანიშნავია, რომ ადამიანის უჯრედს შეიძლება დაახლოებით 24 საათი დასჭირდეს გაყოფა (აქედან გამომდინარე, დნმ-ის რეპლიკაცია ცოტა უფრო სწრაფი უნდა იყოს). ჯანსაღი E. coli უჯრედის გაყოფას შეიძლება დასჭირდეს მხოლოდ 20 წუთი (მათ შორის, მისი ~4,5 მილიონი ბაზის წყვილი გენომის გამრავლება). როგორც ადამიანი, ასევე ბაქტერია ამას აკეთებენ მაშინ, როდესაც ჩვეულებრივ უშვებენ საკმარის შეცდომებს, რომ შემდგომი თაობა სიცოცხლისუნარიანი და ცნობადი იყოს. ეს საკმაოდ საოცარი!

დიზაინის გამოწვევა

თუ უჯრედი უნდა გამრავლდეს - მისი საბოლოო მიზანი - უნდა შეიქმნას დნმ-ის ასლი. ასე რომ, ერთი ნათელი პრობლემა/განცხადება/კითხვა არის "როგორ შეუძლია უჯრედმა ეფექტურად დააკოპიროს თავისი დნმ?" ზემოაღნიშნული ანალოგიის გათვალისწინებით, ზოგიერთი შესაბამისი ქვეკითხვა შეიძლება იყოს: რა არის ქიმიური და ფიზიკური თვისებები, რომლებიც ჩართვა დასაკოპირებელი დნმ (ჩვენ უბრალოდ არ ვაშენებთ მეტ დნმ-ს - ჩვენ ვაშენებთ მისი თანმიმდევრობის ზუსტ ასლს)? რა ერთგულებით უნდა მოხდეს დნმ-ის კოპირება? რა სიჩქარით უნდა მოხდეს მისი კოპირება? საიდან მოდის ენერგია ამ ამოცანისთვის და რამდენია საჭირო? საიდან მოდის "ნედლეული"? როგორ აკავშირებს ამ პროცესში ჩართული მოლეკულური მანქანები ნედლეულის შეკრებას და ენერგიას, რომელიც საჭიროა ახალი დნმ-ის მოლეკულის ერთად შესაქმნელად? სია, რა თქმა უნდა, შეიძლება გაგრძელდეს.

შემდეგში და ლექციაში განვიხილავთ, თუ როგორ ხდება დნმ-ის რეპლიკაცია და გავითვალისწინებთ ამ მამოძრავებელ კითხვებს. კითხვისა და სალექციო მასალების გავლისას შეეცადეთ მუდმივად იცოდეთ ამ და ამ პროცესთან დაკავშირებული სხვა კითხვები. გამოიყენეთ ეს კითხვები, როგორც სახელმძღვანელო თქვენი აზრების ორგანიზებისთვის და შეეცადეთ იპოვოთ შესატყვისი „ფაქტებს“ შორის, რომლებიც, თქვენი აზრით, შეიძლება იცოდეთ და მამოძრავებელ კითხვებს შორის.

დნმ ორმაგი სპირალი

დამატებითი კონტექსტის ასაშენებლად ჩვენ ასევე გვჭირდება ცოტაოდენი ემპირიულად განსაზღვრული ცოდნა. ალბათ, დნმ-ის მოლეკულის მემკვიდრეობითი ფორმის ერთ-ერთი ყველაზე ცნობილი და პოპულარული მახასიათებელია ის, რომ მას აქვს ორმაგი ხვეული მესამეული სტრუქტურა. ამის დაფასება თარიღდება 1950-იანი წლებით. ამ აღმოჩენის ამბავი ფართოდ იყო მოთხრობილი - და დეტალები ამ ტექსტის ფარგლებს სცილდება. მოკლედ, ფრენსის კრიკსა და ჯეიმს უოტსონს მიეკუთვნება დნმ-ის სტრუქტურის განსაზღვრა. როზალინდ ფრანკლინს ახლა ასევე მიეკუთვნება კრიტიკული რენტგენის დიფრაქციის მონაცემების გენერირება, რამაც საშუალება მისცა უოტსონსა და კრიკს შეექმნათ დნმ-ის მოლეკულის თავსატეხი.

დნმ-ის სტრუქტურის მოდელებმა აჩვენა, რომ მოლეკულა შედგება კოვალენტურად დაკავშირებული ნუკლეოტიდების ორი ჯაჭვისგან, რომლებიც ერთმანეთის ირგვლივ ტრიალებენ მარჯვენა სპირალის წარმოქმნით. თითოეულ ჯაჭვში ნუკლეოტიდები კოვალენტურად უერთდებიან ორ სხვა ნუკლეოტიდს (გარდა წრფივი ჯაჭვის ბოლოების გარდა) ფოსფოდიესტერული ბმების მეშვეობით, რომლებიც აკავშირებენ შაქარს 5' და 3' ჰიდროქსილის ჯგუფების მეშვეობით (იხ. პანელი b ქვემოთ სურათზე) - გავიხსენოთ რომ ეტიკეტები 5' და 3' ეხება შაქრის მოლეკულაზე არსებულ ნახშირბადს. ეს შაქრისა და ფოსფატის ჯაჭვები ქმნიან კოვალენტური ბმულების მიმდებარე კრებულს, რომლებსაც ხშირად უწოდებენ სტრუქტურის "ხერხემლს". ხაზოვან მოლეკულაში, თითოეულ ძაფს აქვს ორი თავისუფალი ბოლო. ერთს უწოდებენ 5'-ბოლოს, რადგან დაუკავშირებელი ფუნქციური ჯგუფი, რომელიც ჩვეულებრივ მონაწილეობს ნუკლეოტიდების შეერთებაში, არის ფოსფატი, რომელიც დაკავშირებულია 5' ნახშირბადთან. ჯაჭვის მეორე ბოლოს ეწოდება 3'-ბოლო, რადგან უკავშირო ფუნქციური ჯგუფი, რომელიც მონაწილეობს ნუკლეოტიდების შეერთებაში, არის ჰიდროქსილის ჯგუფი, რომელიც დაკავშირებულია შაქრის 3' ნახშირბადთან. ვინაიდან ძაფების ორი ბოლო არ არის სიმეტრიული, ეს აადვილებს ძაფზე მიმართულების დანიშვნას ან აღწერას - მაგალითად, შეიძლება ითქვას, რომ ისინი კითხულობენ 5'-ბოლოდან 3'-ბოლომდე, რათა მიუთითოთ, რომ ისინი ისინი "სეირნობენ" ძაფების გასწვრივ დაწყებული 5'-ბოლოდან და მიდიან 3'-ბოლომდე. სხვათა შორის, ეს მიმართულება (5'-დან 3'-მდე) არის კონვენცია, რომელსაც ბიოლოგები იყენებენ თანმიმდევრობის დასაწერად. აღმოჩენილია კოვალენტურად დაკავშირებული ნუკლეოტიდების ორი ჯაჭვი ანტიპარალელური ერთმანეთს ორმაგი სპირალში; ანუ, ერთი ჯაჭვის ორიენტაცია/მიმართულება საპირისპიროა მეორე ჯაჭვის მიმართ (იხ. პანელი b ქვემოთ სურათზე). შაქრის-ფოსფატის ხერხემალი ორმაგი სპირალის გარეთაა, რომელიც ზედაპირზე უარყოფით მუხტების ზოლს ქმნის. ამის საპირისპიროდ, თითოეული ანტიპარალელური ძაფების აზოტოვანი ფუძეები დგანან სტრუქტურის შიგნით და ეწინააღმდეგებიან ერთმანეთს ისე, რომ წყალბადის ბმები წარმოიქმნება უნიკალურ პურინის/პირიმიდინის წყვილებს შორის (A დაწყვილება T და G დაწყვილება C-თან). „დაწყობა“ გულისხმობს იმ ფაქტს, რომ დნმ-ის იმავე ჯაჭვზე ფუძეების ბრტყელი სიბრტყეები ბლინების დასტას ჰგავს. ეს სპეციფიური წყვილები (A T-თან, C-თან G) არის ნათქვამი შემავსებელი მეორეზე და, შესაბამისად, ორმაგი სპირალის საპირისპირო ძაფებს ხშირად უწოდებენ ერთმანეთს დამატებითი ძაფები.

დამატებითი სტრიქონები ატარებენ ზედმეტ ინფორმაციას. მკაცრი ქიმიური დაწყვილების გამო, თუ იცით ერთი ჯაჭვის თანმიმდევრობა, თქვენ ასევე იცით მისი კომპლემენტის ჯაჭვი. მაგალითად აიღეთ თანმიმდევრობა 5′- C A T A T G G G A T G - 3′. ყურადღება მიაქციეთ, თუ როგორ არის მიმდევრობის ანოტაცია ორიენტირებით (მითითებულია 5' და 3' ეტიკეტებით). ამ მიმდევრობის დანამატი - დაწერილი 5'-დან 3'-მდე კონვენციის მიხედვით არის: 5'- C A T C C C A T A T G - 3'. თუ არ ხართ დარწმუნებული, დაწერეთ ეს ორი თანმიმდევრობა ერთმანეთის მოპირდაპირე მხარეს, დარწმუნდით, რომ დაწერეთ ისინი როგორც ანტიპარალელური ძაფები. გაითვალისწინეთ, რომ ორი დამატებითი ჯაჭვის ერთმანეთის ირგვლივ ტრიალი იწვევს სტრუქტურული მახასიათებლების ფორმირებას, რომელსაც ეწოდება ძირითადი და მცირე ღარები, უფრო მნიშვნელოვანი გახდება, როდესაც განვიხილავთ ცილების დნმ-თან შეკავშირებას (იხ. პანელი c ქვემოთ სურათზე).

Bis2a-ს ინსტრუქტორების უმეტესობა მოელის, რომ ამოიცნოთ ქვემოთ მოცემულ ფიგურაში გამოსახული ძირითადი სტრუქტურული მახასიათებლები და თქვენ თავად შეძლებთ შექმნათ დნმ-ის სტრუქტურის ძირითადი ფიგურა.

დნმ-ს აქვს (ა) ორმაგი სპირალის სტრუქტურა და (ბ) ფოსფოდიესტერის ბმები. (c) ძირითადი და მცირე ღარები არის დამაკავშირებელი ადგილები რიგითობის სპეციფიკური დნმ-ის დამაკავშირებელი პროტეინებისთვის ისეთი პროცესების დროს, როგორიცაა ტრანსკრიფცია (რნმ-ის შექმნა დნმ-ის შაბლონიდან), ტრანსკრიფციის რეგულირება და რეპლიკაციის წარმოშობის იდენტიფიკაცია სპეციფიური ცილების მიერ. გაითვალისწინეთ, რომ დნმ პოლიმერაზა მათ შორის არ არის!). ამის საპირისპიროდ, ნუკლეოსომების ირგვლივ დნმ-ის დახვევა არ არის თანმიმდევრობით სპეციფიკური და უბრალოდ გულისხმობს ელექტროსტატიკურ ურთიერთქმედებას უარყოფითად დამუხტულ ხერხემალსა და ნუკლეოსომის დადებითად დამუხტულ გარე ზედაპირს შორის. ანალოგიურად, დნმ პოლიმერაზა დააკოპირებს ნებისმიერ თანმიმდევრობას და დაუკავშირდება ნებისმიერი ლეგიტიმურად დაწყვილებული პრაიმერის 3' ბოლოს.

დნმ-ის სტრუქტურამ მაშინვე მიუთითა, თუ როგორ შეიძლება დნმ-ის რეპლიკაცია. თეორიულად, ორი ჯაჭვი შეიძლება განცალკევდეს, ახალი ნუკლეოტიდები შეიძლება განლაგდეს კონკრეტული თანმიმდევრობით, რომელიც ავსებს შაბლონის ჯაჭვს, და ეს ახალი ნუკლეოტიდები შეიძლება გაერთიანდეს. შემოთავაზებული იყო რეპლიკაციისთვის სამი კონკურენტი მოდელი: კონსერვატიული მოდელი, ნახევრად კონსერვატიული მოდელი და დისპერსიული მოდელი.

  1. კონსერვატიულირეპლიკაციის კონსერვატიული მოდელი ამტკიცებდა, რომ ყოველი მთლიანი ორჯაჭვიანი მოლეკულა შეიძლება მოქმედებდეს როგორც შაბლონი სრულიად ახალი ორჯაჭვიანი მოლეკულის სინთეზისთვის. ანუ, თუ ვინმე დნმ-ის შაბლონის მოლეკულას რეპლიკაციის შემდეგ ქიმიურ ნიშანს დააყენებს, ახალ ასლზე არცერთი მათგანი არ მოიძებნება. ეს მოდელი ცოტა სულელურად გამოიყურება, რადგან ძაფები უნდა განცალკევდეს, გაორმაგდეს და შემდეგ კვლავ განცალკევდეს, რათა იპოვონ და ხელახლა დაუკავშირდნენ თავიანთ თავდაპირველ პარტნიორს. ან ახალი ძაფები უნდა ჩამოყალიბდეს ხელუხლებელი ორმაგი სპირალის გვერდით, გარკვეული შაბლონის შემდეგ, რომელიც არ მოიცავს უოტსონ-კრიკის ბაზის დაწყვილებას.
  2. ნახევრად კონსერვატიული: ეს ჰიპოთეზა ადგენდა, რომ დნმ-ის მოლეკულის თითოეული ცალკეული ჯაჭვი შეიძლება ყოფილიყო ახალი ჯაჭვის შაბლონი, რომელსაც ახლა წყალბადის ბმული იქნებოდა. ამ შემთხვევაში, თუ ქიმიური ეტიკეტი განთავსდება ორჯაჭვიანი შაბლონის დნმ-ის მოლეკულაზე, თითოეულ ეგზემპლარზე თითო ჯაჭვი ინარჩუნებს ეტიკეტს.
  3. დისპერსიული: ამ მოდელმა შესთავაზა, რომ კოპირებული ორმაგი სპირალი იქნებოდა "ძველი" და "ახალი" ძაფების უწყვეტი სეგმენტების ცალმხრივი კომბინაცია. დნმ-ის მოლეკულაზე ქიმიური ეტიკეტის დაყენების შემთხვევაში, რომელიც დაკოპირებულია დისპერსიული მექანიზმის გამოყენებით, აღმოჩნდება მიღებული ასლის დისკრეტული სეგმენტები, რომლებიც იარლიყი იყო ორივე ჯაჭვზე, გამოყოფილი სრულიად არა მარკირებული ნაწილებით. ეს მოდელი ისევ უსასყიდლოდ გართულებულია, რაც მოითხოვს შაბლონის ძაფების განმეორებით გატეხვას და ახალ მოლეკულებთან შეერთებას.

მესელსონმა და სტალმა გადაჭრეს ეს საკითხი 1958 წელს, როდესაც მათ განაცხადეს ახლა უკვე ცნობილი ექსპერიმენტის შედეგები, რომელმაც აჩვენა, რომ დნმ-ის რეპლიკაცია ნახევრად კონსერვატიულია (იხ. სურათი ქვემოთ), და რომ თითოეული ჯაჭვი გამოიყენება როგორც შაბლონი ახალი ჯაჭვის შესაქმნელად. ისინი უდავოდ მოელოდნენ. ამ ექსპერიმენტის შესახებ მეტი ინფორმაციისთვის უყურეთ მესელსონ-სტალის ექსპერიმენტს.

დნმ-ს აქვს ანტიპარალელური ორმაგი სპირალის სტრუქტურა, ნუკლეოტიდური ფუძეები წყალბადით არის შეკრული და თითოეული ჯაჭვი ავსებს მეორეს. დნმ-ის რეპლიკაცია ხდება ნახევრად კონსერვატიული წესით, თითოეული ჯაჭვი გამოიყენება როგორც ახლად შექმნილი ჯაჭვის შაბლონი.

დნმ-ის რეპლიკაცია

რამდენიმე ძირითადი სტრუქტურული თავისებურებებისა და ნახევრად კონსერვატიული მექანიზმის საჭიროების დადგენის შემდეგ, მნიშვნელოვანია გვესმოდეს, რა არის ცნობილი პროცესის შესახებ და ვიფიქროთ იმაზე, თუ რა კითხვებზე შეიძლება სურდეს პასუხის გაცემა.

ვინაიდან დნმ-ის რეპლიკაცია არის პროცესი, ჩვენ შეგვიძლია გამოვიყენოთ „ენერგეტიკული ამბავი“ და ვიფიქროთ მასზე. გავიხსენოთ, რომ ენერგეტიკული ამბავი არსებობს, რათა დაგვეხმაროს სისტემატიურად ვიფიქროთ პროცესებზე (როგორ მიდის მოვლენები A-დან B-მდე). ამ შემთხვევაში პროცესი არის აქტი, რომელიც იწყება ერთი ორჯაჭვიანი დნმ-ის მოლეკულით და დამთავრდება ორი ორჯაჭვიანი დნმ-ის მოლეკულით. ასე რომ, ჩვენ დავსვათ ისეთ რაღაცეებს, როგორიცაა: როგორ გამოიყურება სისტემა რეპლიკაციის დასაწყისში (მატერია და ენერგია)? როგორ გადადის მატერია და ენერგია სისტემაში და რა ახდენს ტრანსფერების კატალიზებას? როგორ გამოიყურება სისტემა პროცესის ბოლოს? ჩვენ ასევე შეგვიძლია დავსვათ კითხვები კონკრეტულ მოვლენებთან დაკავშირებით, რომლებიც აუცილებლად უნდა მოხდეს პროცესის განმავლობაში. მაგალითად, ვინაიდან დნმ გრძელი მოლეკულაა და ზოგჯერ წრიულია, შეგვიძლია დავსვათ ძირითადი კითხვები, როგორიცაა: სადაც იწყება რეპლიკაციის პროცესი? სად მთავრდება? ჩვენ ასევე შეგვიძლია დავსვათ პრაქტიკული კითხვები პროცესის შესახებ, როგორიც არის, რა ხდება, როდესაც ორჯაჭვიანი სტრუქტურა იხსნება?

ჩვენ განვიხილავთ ამ საკვანძო კითხვებს ამ ტექსტში და კლასში და მოგიწოდებთ თქვენც იგივე გააკეთოთ.

მოთხოვნები დნმ-ის რეპლიკაციისთვის

დავიწყოთ დნმ-ის რეპლიკაციისთვის რამდენიმე ძირითადი ფუნქციური მოთხოვნის ჩამოთვლით, რომელთა დასკვნა შეგვიძლია მხოლოდ იმ პროცესზე ფიქრით, რომელიც უნდა მოხდეს და/ან საჭიროა რეპლიკაციისთვის. მაშ, რა გვჭირდება?

• ვიცით, რომ დნმ ნუკლეოტიდებისგან შედგება. თუ ჩვენ ვაპირებთ ახალი ჯაჭვის შექმნას, დაგვჭირდება ნუკლეოტიდების წყარო.
• შეგვიძლია დავასკვნათ, რომ დნმ-ის ახალი ჯაჭვის აშენებას ენერგიის წყარო დასჭირდება - ჩვენ უნდა ვეცადოთ ამის პოვნა.
• შეგვიძლია დავასკვნათ, რომ უნდა არსებობდეს პროცესი რეპლიკაციის დასაწყებად ადგილის მოსაძებნად.
• შეგვიძლია დავასკვნათ, რომ იქნება ერთი ან მეტი ფერმენტი, რომელიც ხელს უწყობს რეპლიკაციის პროცესის კატალიზებას.
• ასევე შეგვიძლია დავასკვნათ, რომ გადასაწერი ბაზების უზარმაზარი რაოდენობის გათვალისწინებით, დაშვებული იქნება გარკვეული შეცდომები.

ჩვენ აღმოვაჩენთ, რომ როგორც კი გავიგებთ იმის საფუძვლებს, თუ როგორ ხდება რეპლიკაცია, წამოიჭრება დამატებითი კითხვები/საკითხები!

ნუკლეოტიდის სტრუქტურა

დნმ-ის სამშენებლო ბლოკები არის ნუკლეოტიდები. ნუკლეოტიდები შედგება აზოტოვანი ფუძისგან, დეზოქსირიბოზასგან (5 ნახშირბადოვანი შაქარი) და ფოსფატის ჯგუფისგან. ნუკლეოტიდი დასახელებულია მისი აზოტოვანი ფუძის მიხედვით, პურინები, როგორიცაა ადენინი (A) და გუანინი (G), ან პირამიდინები, როგორიცაა ციტოზინი (C) და თიმინი (T). გაიხსენეთ ქვემოთ მოცემული სტრუქტურები. გაითვალისწინეთ, რომ ნუკლეოტიდი ადენოზინტრიფოსფატი (ATP) არის დეზოქსირიბონუკლეოტიდის (dATP) წინამორბედი, რომელიც შედის დნმ-ში. დნმ-ის სინთეზის დროს გამოყენებული სხვა ნუკლეოტიდები ასევე არის ნუკლეოზიდის ტრიფოსფატები. ვიმედოვნებთ, რომ ეს ფაქტი გარკვეულ მინიშნებებს მოგცემთ იმის შესახებ, თუ საიდან შეიძლება მომდინარეობდეს ენერგია დნმ-ის სინთეზისთვის.

თითოეული ნუკლეოტიდი შედგება შაქრისგან (რიბოზა ან დეზოქსირიბოზა, იმისდა მიხედვით, რნმ-ს ან დნმ-ს აყალიბებს, შესაბამისად), ფოსფატის ჯგუფისა და აზოტოვანი ფუძისგან. პურინებს აქვთ ორმაგი რგოლის სტრუქტურა ექვსწევრიანი რგოლით შერწყმული ხუთწევრიან რგოლთან. პირიმიდინები უფრო მცირე ზომისაა; მათ აქვთ ერთი ექვსწევრიანი რგოლის სტრუქტურა. ხუთნახშირბადიანი შაქრის ნახშირბადის ატომები დანომრილია 1', 2', 3', 4' და 5' (1' იკითხება როგორც "ერთი მარტივი"). ფოსფატის ნარჩენი ერთვის ერთი ნუკლეოტიდის ერთი შაქრის 5' ნახშირბადის ჰიდროქსილის ჯგუფს და შემდეგი ნუკლეოტიდის შაქრის 3' ნახშირბადის ჰიდროქსილის ჯგუფს, რითაც წარმოქმნის 5'-3' ფოსფოდიესტერულ კავშირს.

რეპლიკაციის დაწყება

მილიონობით, თუ არა მილიარდობით ნუკლეოტიდის კოპირებით, როგორ იცის დნმ პოლიმერაზამ საიდან დაიწყოს? შესაძლოა ის სადმე დაიწყოს, ან, უფრო გონივრულად, დაიწყოს ქრომოსომის ერთი ბოლოდან და გაგრძელდეს საპირისპირო ბოლოს? არცერთი ეს ჰიპოთეზა არ არის სწორი. მტკიცებულებები მიუთითებს, რომ არსებობს სპეციფიკური ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობები, რომლებსაც ე.წ რეპლიკაციის წარმოშობა დნმ-ის სიგრძეზე, საიდანაც იწყება რეპლიკაცია. წრიული E. coli ქრომოსომას აქვს მხოლოდ ერთი ასეთი ადგილი; ხაზოვან ევკარიოტულ ქრომოსომებს, პირიქით, აქვთ მრავალი ადგილი თითოეულ ქრომოსომაზე. თუმცა, ამ საიტის იდენტიფიცირების შემდეგ, პრობლემა წარმოიქმნება. დნმ-ის ორმაგი სპირალი ერთმანეთთან იმართება წყალბადის ბმებით. თუ თითოეული სტრიქონი ინდივიდუალურად უნდა წაიკითხოთ და დააკოპიროთ, უნდა არსებობდეს მექანიზმი, რომელიც პასუხისმგებელია ამ ორი სტრიქონის გამიჯვნაზე. ამ წყალბადის ობლიგაციების გაწყვეტა ენდრგონიული პროცესია. საიდან მოდის ენერგია და როგორ ხდება ეს რეაქციის კატალიზება? ძირითადი მსჯელობა ამ ეტაპზე უნდა მიგვიყვანოს ჰიპოთეზამდე, რომ ჩართულია ცილის კატალიზატორი და რომ ეს ფერმენტი აკავშირებს ძაფების ენდრგონიულ განცალკევებას ზოგიერთ ეგზერგონიულ პროცესთან.

ირკვევა, რომ ამ პროცესის დეტალები და ჩართული პროტეინები განსხვავდება კონკრეტული ორგანიზმის მიხედვით და მოლეკულური დონის ბევრი დეტალი ჯერ კიდევ ბოლომდე არ არის გასაგები. თუმცა, არსებობს რამდენიმე საერთო მახასიათებელი ევკარიოტებში, ბაქტერიებსა და არქეებში რეპლიკაციის წარმოშობის დადგენისას. პირველი, პროტეინებს, რომლებსაც ზოგადად „ინიციატორებს“ უწოდებენ, აქვთ უნარი შეაერთონ დნმ-ის დნმ-ის თანმიმდევრობებთან ან ძალიან ახლოს, რომლებიც აღნიშნავენ რეპლიკაციის საწყისს. ინიციატორი ცილების დნმ-თან ურთიერთქმედება ხელს უწყობს ორმაგი სპირალის დესტაბილიზაციას და ასევე სხვა ცილების რეკრუტირებას, მათ შორის ფერმენტს ე.წ.ჰელიკაზა. ამ შემთხვევაში დნმ-ის ორმაგი სპირალის დესტაბილიზაციისთვის საჭირო ენერგია, როგორც ჩანს, მოდის დნმ-სა და ინიციატორი ცილებს შორის ახალი ასოციაციების წარმოქმნიდან. ამის საპირისპიროდ, დნმ-ის ჰელიკაზა, როგორც კი ჩაიტვირთება საწყისზე, აწყვილებს ATP-ის ექსერგონიულ ჰიდროლიზს დნმ-ის ორმაგი სპირალის გახსნასთან. დამატებითი პროტეინები უნდა იყოს დაკომპლექტებული ნაწილობრივ ამოუწურავი დაწყების კომპლექსში. ეს მოიცავს, მაგრამ არ შემოიფარგლება, ფერმენტებს ე.წ პრიმაზადა დნმ პოლიმერაზა. მიუხედავად იმისა, რომ ინიციატორები იკარგება რეპლიკაციის დაწყებიდან მალევე, დანარჩენი ცილები მუშაობენ ერთობლივად, რათა განახორციელონ დნმ-ის რეპლიკაციის პროცესი. ფერმენტების ეს კომპლექსი ფუნქციონირებს დნმ-ის Y- ფორმის სტრუქტურებში ე.წ რეპლიკაციის ჩანგლები (იხ. სურათი ქვემოთ). რეპლიკაციის ნებისმიერი მოვლენისთვის, რეპლიკაციის თითოეულ საწყისთან შეიძლება ჩამოყალიბდეს ორი რეპლიკაციის ჩანგალი, რომელიც ვრცელდება ორივე მიმართულებით.

შემოთავაზებული დისკუსია

რატომ აქვს სხვადასხვა ორგანიზმს რეპლიკაციის წარმოშობის განსხვავებული რაოდენობა? რა სარგებელი შეიძლება ჰქონდეს ერთზე მეტს? არის თუ არა ნაკლი ერთზე მეტის არსებობას?

შემოთავაზებული დისკუსია

იმის გათვალისწინებით, თუ რა უნდა მოხდეს რეპლიკაციის წარმოშობის დროს, შეგიძლიათ გამოიყენოთ ლოგიკა, რათა დაასკვნათ და შემოგთავაზოთ განხილვისთვის ზოგიერთი პოტენციური მახასიათებელი, რომელიც განასხვავებს რეპლიკაციის საწყისებს დნმ-ის სხვა სეგმენტებისგან?

რეპლიკაციის დასაწყისში წარმოიქმნება რეპლიკაციის ბუშტი. რეპლიკაციის ბუშტი შედგება ორი რეპლიკაციის ჩანგალისაგან, რომელთაგან თითოეული მოძრაობს საპირისპირო მიმართულებით დნმ-ის გასწვრივ. რეპლიკაციის ჩანგლები მოიცავს ყველა ფერმენტს, რომელიც საჭიროა რეპლიკაციისთვის - ისინი უბრალოდ არ არის დახატული ნახატზე ისე, რომ უზრუნველყოს ადგილი შაბლონსა და დნმ-ის ახალ ძაფებს შორის ურთიერთობის საილუსტრაციოდ. რა ფერმენტებია საჭირო და სად განთავსდება ისინი ამ ნახატზე?
ატრიბუცია: Bis2A გუნდის ორიგინალური სურათი

რეპლიკაციის გახანგრძლივება

დნმ-ის ორმაგი სპირალის დნობა და დნმ-ის რეპლიკაციის კომპლექსის შეკრება მხოლოდ პირველი ნაბიჯია რეპლიკაციის პროცესში. ახლა რეალურად უნდა დაიწყოს ახალი სტრიქონის შექმნის პროცესი. აქ დამატებითი გამოწვევები ჩნდება. პირველი აშკარა საკითხია იმის დადგენა, თუ რომელი ჯაჭვი უნდა იყოს კოპირებული ნებისმიერ რეპლიკაციის ჩანგალზე (ანუ რომელი ძაფები იქნება ნახევრად კონსერვატიული სინთეზის შაბლონი)? ორივე მიმართულება თანაბრად სიცოცხლისუნარიანი ალტერნატივაა? ასევე არსებობს ახალი ძაფების სინთეზის პროცესის რეალურად დაწყების პრობლემა.შეუძლია თუ არა დნმ პოლიმერაზას ახალი ჯაჭვის ინიცირება დამოუკიდებლად? ექსპერიმენტულად დადგინდა, რომ დნმ პოლიმერაზას არ შეუძლია ჯაჭვის სინთეზის დაწყება. პირიქით, დნმ პოლიმერაზას სჭირდება ორჯაჭვიანი ნუკლეინის მჟავების მოკლე მონაკვეთი, რასაც მოჰყვება ერთჯაჭვიანი შაბლონი. დნმ პოლიმერაზას შეუძლია მხოლოდ ბაზის დამატება სათანადოდ დაწყვილებულ ფუძემდე არსებულ 3' ბოლოში. ეს აჩენს ცოტა პრობლემას დნმ-ის სინთეზის დასაწყებად, არა?

საბედნიეროდ, დნმ პოლიმერაზა შეუძლია დაამატეთ dNTP რნმ-ის მოლეკულას, რომელიც ჰიბრიდირებულია დნმ-ის შაბლონში და რნმ პოლიმერაზები

არ

მოითხოვს წინასწარ არსებულ ფუძე-დაწყვილებულ 3' ბოლო tp სინთეზის დაწყებას. ამრიგად, დნმ-ის სინთეზის ყველა მოლეკულა რეალურად იწყება მოკლე (E. coli-ში, ათზე ნაკლები ფუძეზე) რნმ-დან. პრაიმერი (ეს არის გამოსახული როგორც მოკლე მწვანე ხაზები ზემოთ და ქვემოთ ფიგურებში). მოკლე პრაიმერის შექმნას ფერმენტი ახორციელებს პრიმაზა. Primase არის ძალიან ნელი (კარგად, შედარებით ნელი - პრაიმერის შესაქმნელად საჭიროა ერთი წამი) და შეცდომებისადმი მიდრეკილი პოლიმერაზა. მისი აქტივობის შეცდომისადმი მიდრეკილი ბუნება პრობლემას არ წარმოადგენს, რადგან უჯრედი დნმ-ის სინთეზის პროცესში მოგვიანებით ამოიღებს ყველა პრაიმერს - და ჩვენ ამას მოგვიანებით განვიხილავთ ამ კითხვაში.

ძაფების გახანგრძლივების პროცესში, დნმ პოლიმერაზა პოლიმერიზებს დნმ-ის ნუკლეოტიდების ახალ კოვალენტურად დაკავშირებულ ჯაჭვს (E. coli-ში ამ რეპლიკაციურ პოლიმერაზას დნმ პოლიმერაზა III ეწოდება; ევკარიოტებში პოლიმერაზას ნომენკლატურა უფრო რთულია და რამდენიმე რეპლიკაციური პოლიმერაზას როლი ბოლომდე გასაგები არ არის). დნმ პოლიმერაზა ივლის გასწვრივ

შაბლონი

ძაფები ამ ღეროს 3'-დან 5'-მდე მიმართულებით, ახალი ძაფის სინთეზირება ახალშობილ (ახალშობილი) ღეროს 3' ბოლოზე ბაზების დამატებით. (მე გთავაზობთ, რომ შეადგინოთ თქვენი დიაგრამა ამ მიმართულების გასარკვევად - გახსოვდეთ, რომ ორი ღერი ანტიპარალელულია - შაბლონზე 3'-დან 5'-მდე მიმართულება არის 5'-დან 3'-მდე მიმართულება ახალ ზოლზე! თუ ეს დამაბნეველად ჟღერს, მაშინ მიიღეთ იმ დიაგრამაზე რაც შეიძლება მალე ვიმუშაოთ).

მოდით მოკლედ განვიხილოთ რეაქცია, რომელიც მოიცავს ერთი ნუკლეოტიდის დამატებას. პრაიმერი უზრუნველყოფს მნიშვნელოვან 3' ჰიდროქსილს, რომელზედაც იწყება სინთეზი. შემდეგი დეზოქსირიბონუკლეოტიდი ტრიფოსფატი შედის დნმ პოლიმერაზას შემაკავშირებელ ადგილზე და ორიენტირებულია პოლიმერაზაზე ისე, რომ შეიძლება მოხდეს შემომავალი 5' ტრიფოსფატის ჰიდროლიზი, ათავისუფლებს პიროფოსფატს და აკავშირებს ამ ექსერგონიულ რეაქციას ბონდფოსფოდიებს შორის ენდერგონულ სინთეზთან. შემომავალი ნუკლეოტიდის ფოსფატი და პრაიმერის 3' ჰიდროქსილის ჯგუფი. პიროფოსფატის დეგრადაცია დამატებით ენერგიულ დარტყმას შემატებს ამ რეაქციას. შემდეგ ეს პროცესი განმეორდება. არ არსებობს დნმ-ის სინთეზის რეალური "ტერმინალური ადგილი", სინთეზი ნებისმიერი ინდივიდუალური პოლიმერაზას მიერ გაგრძელდება მანამ, სანამ რეპლიკაციის კომპლექსი არ დაშორდება დნმ-ს; კომპლექსი შესაძლოა „ჩამოვარდეს“ გატეხილი შაბლონის ძაფისგან, შეიძლება ჩამოვარდეს წრფივი ქრომოსომის ბოლოდან, ან შეიძლება მიემართოს ადრე სინთეზირებული პრაიმერის 5' ბოლოზე (დაწვრილებით ამის შესახებ მოგვიანებით). ეს ტექსტში ბევრად უფრო რთულად ჟღერს, ვიდრე სინამდვილეშია: იხილეთ დიაგრამა „წამყვანი და ჩამორჩენილი ძაფების სინთეზი“ ქვემოთ (და აუცილებლად დახაზეთ თქვენი საკუთარი ვერსია).

სწორი ბაზის დაწყვილება, ან სწორი ნუკლეოტიდის შერჩევა ყოველ საფეხურზე დასამატებლად, მიიღწევა სტრუქტურული შეზღუდვებით, რომლებიც იგრძნობა დნმ პოლიმერაზასა და კომპლემენტარულ ნუკლეოტიდებს შორის წარმოქმნილი ენერგიულად ხელსაყრელი წყალბადის ბმებით. პროცესი ენერგიულად განპირობებულია შემომავალი 5' ტრიფოსფატის ჰიდროლიზით და ენერგიულად ხელსაყრელი ურთიერთქმედებით, რომლებიც წარმოიქმნება ნუკლეოტიდთაშორისი ურთიერთქმედებით მზარდ ორმაგ სპირალში (ბაზის დაწყობა და დამატებითი ბაზის დაწყვილება წყალბადის ბმები).

ნებისმიერი კონკრეტული ახალი მოლეკულის გახანგრძლივების დასრულების შემდეგ, სხვადასხვა დნმ პოლიმერაზა (ბაქტერიებში ამას ჩვეულებრივ დნმ პოლიმერაზა I-ს უწოდებენ) შემოდის რნმ პრაიმერის მოსაშორებლად და დაკარგული დნმ-ის დარჩენილი ნაწილის სინთეზირებისთვის. ის გამოიყენებს დნმ პოლიმერაზა III-ის მიერ ახლახანს შექმნილი ახალი ჯაჭვის 3' ბოლოს მის პრაიმერად.

რეპლიკაციის ჩანგლის მოძრაობა და ძაფების განცალკევება დნმ-ის ჰელიკაზას საშუალებით იწვევს დნმ-ის ზედმეტ შემოხვევას ჩანგლის წინ (წარმოიდგინეთ, აიღოთ ორი სტრიქონი ერთმანეთზე შემობრუნებული და ცდილობთ მათ დაშორებას - თქვენ დასრულდით. ახლით ახლებით განუყოფელ ნაწილში). სხვა ATP მომხმარებელ ფერმენტს ე.წ. გირაზა, ეხმარება ამ სტრესის მოხსნაში. ეს ფერმენტი განლაგებულია რეპლიკაციის ჩანგლის წინ და არაერთხელ იჭრება და უერთდება დნმ-ს, რაც საშუალებას აძლევს სუპერკოჭებს მოდუნდნენ.

დნმ პოლიმერაზა კატალიზებს 5' ფოსფატის ჯგუფის დამატებას შემომავალი ნუკლეოტიდიდან წინა ნუკლეოტიდის 3' ჰიდროქსილის ჯგუფში. ეს პროცესი ქმნის ფოსფოდიესტერულ კავშირს ნუკლეოტიდებს შორის ნუკლეოტიდში ფოსფოანჰიდრიდის ბმის ჰიდროლიზის დროს.
წყარო: http://bio1151.nicerweb.com/Locked/m...h16/elong.html

შემოთავაზებული დისკუსია

შექმენით ენერგეტიკული ისტორია პოლიმერზე ნუკლეოტიდის დასამატებლად, როგორც ეს ნაჩვენებია ზემოთ სურათზე. ეს იქნება ცალსახა სასწავლო მიზანი თქვენი ზოგიერთი Bis2A ინსტრუქტორისგან.

წამყვანი და ჩამორჩენილი Strand

ზემოაღნიშნული დისკუსია ჯაჭვის გახანგრძლივების შესახებ აღწერს ახალი ჯაჭვის სინთეზის პროცესს, თუ ეს ჯაჭვი სინთეზირდება იმავე მიმართულებით, სადაც რეპლიკაციის ჩანგალი მოძრაობს ან მოძრაობს დნმ-ის გასწვრივ. ეს ძაფი შეიძლება სინთეზირებული იყოს მუდმივად და ეწოდება წამყვანი ძაფი (და ის მოძრაობს "წამყვანი თარგის შაბლონის" გასწვრივ). თუმცა, ორიგინალური დნმ-ის ორმაგი სპირალის ორივე ჯაჭვი უნდა იყოს კოპირებული და იმისათვის, რომ მინიმუმამდე დაიყვანოთ ერთჯაჭვიანი დნმ-ის დაგროვება (რომელიც დაზიანებულია და რთულია შეკეთება), ორივე ჯაჭვი მრავლდება ერთდროულად. ვინაიდან დნმ პოლიმერაზას შეუძლია დნმ-ის სინთეზირება მხოლოდ 5'-დან 3'-მდე მიმართულებით, წამყვანი ჯაჭვის საპირისპირო ჯაჭვის პოლიმერიზაცია უნდა მოხდეს რეპლიკაციის ჩანგლის საპირისპირო მიმართულებით (ეს კარგი დრო იქნება ხატვის მცდელობისთვის. ეს ყველაფერი საკუთარი თავის ორიენტირებისთვის). ამ ძაფს უწოდებენ ჩამორჩენილი სტრიქონი და გეომეტრიული შეზღუდვების გამო უნდა იყოს სინთეზირებული რნმ-ის პრაიმინგისა და დნმ-ის სინთეზის მოვლენების განმეორებითი სერიის მეშვეობით, რაც ქმნის ახალი დნმ-ის მოკლე სეგმენტებს ე.წ. ოკაზაკის ფრაგმენტები. როგორც აღინიშნა, ოკაზაკის თითოეული ფრაგმენტის სინთეზის დასაწყებად საჭიროა პრიმაზა რნმ პრაიმერის სინთეზისთვის და თითოეული ეს რნმ პრაიმერი საბოლოოდ უნდა მოიხსნას და შეიცვალოს დნმ ნუკლეოტიდებით განსხვავებული დნმ პოლიმერაზათი. დნმ პოლიმერაზა I ასრულებს ამ სამუშაოს; ის აკავშირებს არსებული ოკაზაკის ფრაგმენტის 3' ბოლოს, იყენებს ამ (დნმ) 3'-ს რეპლიკაციის დასაწყებად. დნმ პოლიმერაზას გააჩნია 5'-დან 3'-მდე ეგზონუკლეაზური აქტივობა და ანადგურებს რნმ-ის ნუკლეოტიდებს (ყოფილ პრაიმერებს) მის წინ და ანაცვლებს მათ dNTP-ებით. ეს ორივე გამორიცხავს რნმ-ს ახალი ძაფებიდან. ეს კარგია მრავალი მიზეზის გამო: ვინაიდან რნმ შედარებით არასტაბილურია, პრიმაზა ძალიან მიდრეკილია შეცდომისკენ და დნმ პოლიმერაზა ვერ გამოიყენებს რნმ-ს, როგორც შაბლონს რეპლიკაციის შემდეგი რაუნდისთვის). კოვალენტური ბმები ოკაზაკის თითოეულ ფრაგმენტს შორის უნდა ჩამოყალიბდეს კიდევ ერთი ფერმენტის მიერ ე.წ. დნმლიგაზა, რომელიც იყენებს ატფ-ს ფრაგმენტის 3' ბოლოში მის წინ მდებარე ოკაზაკის ფრაგმენტის (ახლა რნმ-ისგან თავისუფალი) 5' ბოლოზე.

Სწრაფი შეკითხვა- რატომ არის საჭირო ATP დნმ ლიგაზას ოკაზაკის ორი ფრაგმენტის ერთმანეთთან შეერთებისთვის? ATP არ არის საჭირო დნმ პოლიმერაზას ნუკლეოტიდის დასამატებლად...

ჩამორჩენილი ძაფების სინთეზის გეომეტრია ძნელია ვიზუალურად და განიხილება კლასში. თუმცა, ეს შეიძლება საუკეთესოდ იყოს წარმოდგენილი ვიდეოთი (რომელიც ნელა მოძრაობს!). წამყვანი და ჩამორჩენილი ძაფების ერთდროული სინთეზის რეალისტური წარმოდგენა შეგიძლიათ ნახოთ დრიუ ბარის ვიდეოებს შორის, აქ. თუმცა, ეს ანიმაცია სწრაფად მოძრაობს (რეალური სიჩქარით). რეპლიკაციის ჩანგლის პროგრესირების მართლაც მომხიბლავი ასპექტია ის ფაქტი, რომ ორი პოლიმერაზა, წინა და ჩამორჩენილ ძაფზე, ერთმანეთთან არის მიბმული. ორივე მოძრაობს იმავე მიმართულებით, როგორც რეპლიკაციის ჩანგალი, და ჩამორჩენილი ძაფის შაბლონი არაერთხელ უნდა გადატრიალდეს და დაიბრუნოს ამ მიმართულების დასაკმაყოფილებლად. თქვენ ასევე იხილავთ ამ ვიდეოში, თუ როგორ უნდა მოხდეს დნმ პოლიმერაზას არაერთხელ გადატვირთვა და შემდეგ დაშორება ჩამორჩენილი ჯაჭვის შაბლონიდან. ორივე პოლიმერაზა სტაბილიზირებულია მათი შაბლონის ძაფებზე დამჭერით, რომელიც გარშემორტყმულია ამ ძაფზე. ვიდეოში იხილავთ „დამტვირთველს“ როგორც დიდ კომპლექსს, რომელიც არაერთხელ იჭერს და იტვირთება მწვანე დამჭერები ნუკლეოპლაზმიდან.

წამყვანი და ჩამორჩენილი ძაფების სინთეზი. ჩამორჩენილი ძაფები იქმნება მრავალ სეგმენტად. რეპლიკაციის ჩანგალი, რომელიც აჩვენებს წამყვან და ჩამორჩენილ ძაფს. რეპლიკაციის ბუშტი, რომელიც აჩვენებს წამყვან და ჩამორჩენილ ძაფებს.
Bis2A გუნდის ორიგინალური სურათი

მზარდი რეპლიკაციის ჩანგალი. ყველა ფერმენტი, რომელიც საჭიროა დნმ-ის რეპლიკაციისთვის (E. coli-ში) - დაწყების გარდა - ილუსტრირებულია აქ, თუმცა ძალიან სტილიზებული (მაგრამ ძალიან ნათელი) ფორმით. რომელი კომპონენტები მონაწილეობენ წამყვანი და ჩამორჩენილი ძაფების პრაიმინგის დროს? Strand გაფართოება? რნმ ნუკლეოტიდების მოცილება (ყოფილი პრაიმერები). ოკაზაკის ცალკეული ფრაგმენტების შეერთება? უმკლავდებით სუპერკოჭების დაგროვებას? გაითვალისწინეთ, რომ წამყვანი და ჩამორჩენილი ძაფების პოლიმერაზა ორივე მიბმულია სამაგრის ჩამტვირთველზე. როგორ შეიძლება მოხდეს დნმ-ის ერთდროული სინთეზი როგორც წინა, ასევე ჩამორჩენილ სადგამზე, თუ პოლიმერაზები ერთმანეთთან არის დაკავშირებული?

რეპლიკაციის შეწყვეტა

ხაზოვანი ქრომოსომების სპეციფიკური საკითხი: ტელომერები და ტელომერაზა

წრიულ ბაქტერიულ ქრომოსომებში რეპლიკაციის შეწყვეტა რამდენიმე პრაქტიკულ პრობლემას უქმნის. თუმცა, ხაზოვანი ევკარიოტული ქრომოსომების ბოლოები დნმ-ის რეპლიკაციის სპეციფიკურ პრობლემას წარმოადგენს. იმის გამო, რომ დნმ პოლიმერაზას შეუძლია ნუკლეოტიდების დამატება მხოლოდ ერთი მიმართულებით (5'-დან 3'-მდე), წამყვანი ჯაჭვი იძლევა უწყვეტი სინთეზის საშუალებას ქრომოსომის ბოლომდე მიღწევამდე; თუმცა, როგორც კი რეპლიკაციის კომპლექსი ჩამოდის ჩამორჩენილი ჯაჭვის ბოლოს, არ რჩება ადგილი პრიმაზასთვის, რომ "დაჯდეს" და მოახდინოს რნმ პრაიმერის სინთეზი, რათა დაიწყოს ქრომოსომის ბოლოში დაკარგული ჯაჭვის დნმ-ის ფრაგმენტის სინთეზი. დნმ პოლიმერაზას მიერ. რაიმე მექანიზმის გარეშე, რომელიც დაეხმარება ამ ხარვეზის შევსებას, ეს ქრომოსომული ბოლო დარჩება დაუწყვილებელი და ქრომოსომა თანდათან უფრო მოკლე გახდება რეპლიკაციის ყოველ რაუნდში, რაც საბოლოოდ არღვევს ორგანიზმის გადარჩენის უნარს. ხაზოვანი ქრომოსომების ეს ბოლოები ცნობილია როგორც ტელომერები და შეიცავს უაღრესად განმეორებად, ძალიან მოკლე თანმიმდევრობებს, რომლებიც არ კოდირებენ ცილებს. შედეგად, ეს „არაკოდირების“ ტელომერები მოქმედებენ როგორც რეპლიკაციის ბუფერები და სომატურ უჯრედებში მართლაც მცირდებიან დნმ-ის რეპლიკაციის ყოველ რაუნდში. მაგალითად, ადამიანებში ექვსი ბაზის-წყვილი თანმიმდევრობა, TTAGGG, მეორდება 100-დან 1000-ჯერ ქრომოსომების უმეტესობის ბოლოს. ცხადია, ეს არის გაჩერების გამოსავალი! ფერმენტის აღმოჩენა ტელომერაზა დაეხმარა იმის გაგებაში, თუ როგორ ინახება ქრომოსომის ბოლოები. ტელომერაზა არის ფერმენტი, რომელიც შედგება ცილისგან (საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა, რაც ნიშნავს, ფერმენტი, რომელიც კოპირებს რნმ-ის შაბლონს დნმ-ის შესაქმნელად) და მოკლე რნმ შაბლონისგან. ტელომერაზა მიმაგრებულია ქრომოსომის ბოლოს ტელომერაზას რნმ კომპონენტსა და დნმ-ის ტელომერულ თანმიმდევრობას შორის ბაზის დამატებითი დაწყვილებით. შემდეგ რნმ გამოიყენება როგორც შაბლონი ქრომოსომის ბოლოების გახანგრძლივებისთვის. ეს პროცესი შეიძლება ბევრჯერ განმეორდეს. მას შემდეგ, რაც ჩამორჩენილი ჯაჭვის შაბლონი საკმარისად გაგრძელდება ტელომერაზას მიერ, პრიმაზა შექმნის პრაიმერს, რასაც მოჰყვება დნმ პოლიმერაზა, რომელსაც ახლა შეუძლია დაამატოს ნუკლეოტიდები, რომლებიც ავსებენ ქრომოსომების ბოლოებს. ამრიგად, ქრომოსომის ბოლოები მეორდება.

ხაზოვანი ქრომოსომების ბოლოები შენარჩუნებულია ტელომერაზას ფერმენტის მოქმედებით.

ტელომერაზა არ არის აქტიური სომატურ უჯრედებში. ზრდასრული სომატური უჯრედები, რომლებიც განიცდიან უჯრედების დაყოფას, აგრძელებენ ტელომერების შემცირებას. თუმცა, ტელომერაზა გამოხატულია ჩანასახოვან უჯრედებში - უჯრედებში, რომლებიც საბოლოოდ გამოიმუშავებენ გამეტებს. ამრიგად, თითოეული ზიგოტა მემკვიდრეობით იღებს ქრომოსომებს გრძელი ტელომერებით. ტელომერაზას ფუნქციით სრულიად დეფექტურ მუტანტებს ხშირად არ აქვთ ფენოტიპი, მაგრამ თაობების პროგრესირებასთან ერთად მათი შთამომავლები სულ უფრო დეფექტური ხდება. ეს განპირობებულია ტელომერული თანმიმდევრობების თანდათანობითი დაკარგვით უჯრედის თითოეული გაყოფით; როგორც კი ეს თანმიმდევრობა დაიკარგება, ქრომოსომა ხდება უკიდურესად არასტაბილური და ავლენს ხშირ მსხვრევას. ამრიგად, ტელომერული თანმიმდევრობა არა მხოლოდ დიდხანს ინარჩუნებს ქრომოსომებს, არამედ ხელს უშლის ქრომოსომის ბოლოების შეცდომით აღიარებას, როგორც "ქრომოსომის რღვევას". ტელომერული ქრომოსომების არასტაბილურობა განპირობებულია უჯრედის არასწორი მცდელობით, „აღადგინოს“ ეს რღვევები.

დნმ-ის რეპლიკაციის სიჩქარის განსხვავებები ბაქტერიებსა და ევკარიოტებს შორის

დნმ-ის რეპლიკაცია ძალიან კარგად იქნა შესწავლილი ბაქტერიებში, უპირველეს ყოვლისა, გენომის მცირე ზომისა და ხელმისაწვდომი ვარიანტების დიდი რაოდენობის გამო. ეშერიხია კოლი აქვს 4,6 მილიონი ბაზის წყვილი ერთ წრიულ ქრომოსომაში და ყველა მათგანი მრავლდება დაახლოებით 42 წუთში, დაწყებული რეპლიკაციის ერთი საწყისიდან და ქრომოსომის გარშემო ორივე მიმართულებით. ეს ნიშნავს, რომ წამში ემატება დაახლოებით 1000 ნუკლეოტიდი. პროცესი ბევრად უფრო სწრაფია, ვიდრე ევკარიოტებში.

ცხრილი 1: ბაქტერიულ და ევკარიოტურ რეპლიკაციებს შორის განსხვავებების შეჯამება.
საკუთრებაპროკარიოტებიევკარიოტები
რეპლიკაციის წარმოშობაᲛარტოხელამრავალჯერადი
პოლიმერიზაციის სიჩქარე პოლიმერაზაზე500 ნუკლეოტიდი/წმ50-დან 100-მდე ნუკლეოტიდი/წმ
ქრომოსომის სტრუქტურაწრიულიხაზოვანი
ტელომერაზაარ იმყოფებააწმყო

რეპლიკაციის დიზაინის გამოწვევა: კორექტირება

როდესაც უჯრედი იწყებს დნმ-ის რეპლიკაციის დავალებას, ის ამას აკეთებს გარემო სიგნალების საპასუხოდ, რომლებიც უჯრედს ეუბნებიან, რომ გაყოფის დროა. დნმ-ის რეპლიკაციის მიზანია ორჯაჭვიანი დნმ-ის შაბლონის ორი იდენტური ასლის შექმნა და ამის გაკეთება იმ დროში, რომელიც არ წარმოადგენს ზედმეტად მაღალ ევოლუციურად შერჩევით ხარჯებს. ეს რთული ამოცანაა, თუ გავითვალისწინებთ, რომ ადამიანის გენომში არის ~6,500,000,000 ბაზის წყვილი და ტიპიური გენომში ~4,500,000 ბაზის წყვილი. E. coli შტამი და რომ ბუნებამ დაადგინა, რომ უჯრედებმა უნდა გააკეთონ საკუთარი ასლები, შესაბამისად, 24 საათისა და 20 წუთის განმავლობაში. ორივე შემთხვევაში საჭიროა მრავალი ინდივიდუალური ბიოქიმიური რეაქცია მოხდეს.

მიუხედავად იმისა, რომ იდეალურად რეპლიკაცია მოხდება სრულყოფილი ერთგულებით, დნმ-ის რეპლიკაცია, ისევე როგორც ყველა სხვა ბიოქიმიური პროცესი, არასრულყოფილია - ბაზები შეიძლება დატოვონ, დამატებითი ბაზები დაემატოს, ან ბაზები, რომლებიც სათანადოდ არ წყვილდება. სინამდვილეში, პოტენციური ენერგიის სხვაობა ზოგიერთ სწორად დაწყვილებულ და არასწორ ფუძე დაწყვილებულ ნუკლეოტიდს შორის უბრალოდ არასაკმარისია დნმ პოლიმერაზას (რომელიც შეცდომით შეჰყავს ნუკლეოტიდებს 1/10-ზე ნაკლები სიჩქარით) გასაოცარი ერთგულებისთვის.6). ბევრი შეცდომა, რომელიც ხდება დნმ-ის რეპლიკაციის დროს, სწრაფად სწორდება თავად დნმ პოლიმერაზას მიერ, მექანიზმის მეშვეობით, რომელიც ცნობილია როგორც კორექტურა. In კორექტურადნმ პოლიმერაზა „კითხულობს“ თითოეულ ახლად დამატებულ ფუძეს მცირე სტრუქტურული ანომალიების არსებობის ან არარსებობის შესწავლის გზით, სანამ მომდევნო ფუძეს დაამატებს მზარდ ძაფს. ამით შესაძლებელია შესწორება.

თუ პოლიმერაზა აღმოაჩენს, რომ ახლად დამატებული ბაზა სწორად არის დაწყვილებული შაბლონის ბაზისთან, ემატება შემდეგი ნუკლეოტიდი. თუმცა, თუ არასწორი ნუკლეოტიდი დაემატება მზარდ პოლიმერს, არასწორი ფორმის ორმაგი სპირალი გამოიწვევს დნმ პოლიმერაზას შეჩერებას და ახლად წარმოებული ჯაჭვი გამოიდევნება პოლიმერაზას პოლიმერიზაციის ადგილიდან და გადავა ეგზონუკლეაზაში. ამ ადგილას, დნმ პოლიმერაზას შეუძლია გაანადგუროს ბოლო რამდენიმე ნუკლეოტიდი, რომლებიც დაემატა პოლიმერს. რამდენიმე ნუკლეოტიდის ამოღების შემდეგ, კვლავ დაემატება ახალი. კორექტირების ამ შესაძლებლობას გააჩნია გარკვეული კომპრომისები: შეცდომის გამოსწორების/უფრო ზუსტი პოლიმერაზის გამოყენებას დრო სჭირდება. რაც უფრო ნელა მიდიხართ, მით უფრო ზუსტი იქნებით. თუმცა, ძალიან ნელა სვლამ შეიძლება ხელი შეგიშალოთ ისეთივე სწრაფად გამეორებისგან, როგორც თქვენი კონკურენცია, ამიტომ ბალანსის გარკვევა მთავარია.

შეცდომები, რომლებიც არ გამოსწორდება კორექტირებით ან შეუსაბამობის შეკეთებით (იხ. ქვემოთ), შეიძლება გახდეს მუტაცია - მაგრამ მხოლოდ იმ შემთხვევაში, თუ მათი არსებობა არ არის გამოვლენილი ხარისხის კონტროლის კიდევ ერთი პროცესით: შეუსაბამობის შეკეთება (განხილულია ქვემოთ).

დნმ პოლიმერაზას მიერ კორექტირება ასწორებს შეცდომებს რეპლიკაციის დროს.

შემოთავაზებული დისკუსია

რა დადებითი და უარყოფითი მხარეები აქვს დნმ პოლიმერაზების კორექტირების შესაძლებლობებს?

წამყვანი და ჩამორჩენილი ძაფების სინთეზი რთულია! რატომ არ გვაქვს მეორე დნმ პოლიმერაზა, რომელიც აგრძელებს ძაფს 3'-დან 5'-მდე მიმართულებით? ორი პოლიმერაზას ქონა, ერთად უღელში და ორივე ძაფზე ერთდროულად მიმდინარეობა, როგორც ჩანს, უფრო მარტივი გამოსავალია. ენერგიის მოთხოვნილება მაინც შესრულდება: პოლიმერიზაციის საპირისპირო მიმართულებით გასატარებლად, უბრალოდ გვექნება მზარდი ძაფები, რომელიც მთავრდება 5' ტრიფოსფატით, რომელსაც თავს დაესხმება შემომავალი dNTP-ის 3' OH. თუმცა, წარმოსახვითი პოლიმერაზა, რომელიც ამატებს ჯაჭვის 5' ბოლოს და არა 3' ბოლოს, პრობლემები ექნება კორექტირებასთან. მათ ბოლო დროს დამატებული ნუკლეოტიდი ატარებს ტრიფოსფატს. თუ ეს ბაზა მცდარია და ამოღებულია კორექტორული ეგზონუკლეაზას მიერ, აღარ იქნება ტრიფოსფატი ჯაჭვის 5' ბოლოში. ამიტომ ჯაჭვი ვერ გაგრძელდა. სცადეთ დახატოთ ეს სიტუაცია, რეალური პოლიმერაზა ამ წარმოსახვითი პოლიმერაზას წინააღმდეგ, რომელიც აგრძელებს მზარდი ჯაჭვის 5' ბოლოს.

რეპლიკაციის შეცდომები და დნმ-ის შეკეთება

მიუხედავად იმისა, რომ დნმ-ის რეპლიკაცია, როგორც წესი, ძალიან ზუსტი პროცესია და დნმ პოლიმერაზების კორექტირება ხელს უწყობს შეცდომის დაბალი კოეფიციენტის შენარჩუნებას (დაახლოებით 1/10-მდე).6 საფუძვლები), შეცდომები მაინც ხდება. რეპლიკაციის შეცდომების გარდა, დნმ-ს შესაძლოა გარემოს ზიანიც მოჰყვეს. რეპლიკაციის ასეთმა შეუსწორებელმა შეცდომებმა ან გარემოს დნმ-ის დაზიანებამ შეიძლება გამოიწვიოს სერიოზული შედეგები. ამრიგად, ბუნებამ შეიმუშავა რამდენიმე მექანიზმი დაზიანებული ან არასწორად სინთეზირებული დნმ-ის გამოვლენისა და აღდგენისთვის.

შეუსაბამობის შეკეთება

ზოგიერთი შეცდომა არ სწორდება რეპლიკაციის დროს, მაგრამ სწორდება რეპლიკაციის დასრულების შემდეგ; ამ ტიპის რემონტი ცნობილია როგორც შეუსაბამობის შეკეთება. სპეციფიური ფერმენტები ცნობენ არასწორად დამატებულ ნუკლეოტიდს და ამოკვეთენ მას; მისი ჩანაცვლება სწორი ბაზით, დის ძაფების შაბლონად გამოყენებით. საკმარისად მარტივი! საკითხია: როგორ ცნობენ შეუსაბამობის აღმდგენი ფერმენტები

რომელიც

ორი არასწორად დაწყვილებული ფუძიდან არის

არასწორი

ერთი?

In E. coli, რეპლიკაციის შემდეგ რაღაც მომენტში, ადენინების ქვეჯგუფი (სპეციფიკური 4 ბაზის თანმიმდევრობით) იძენს მეთილის ჯგუფს. რეპლიკაციის შემდეგ, მშობლის (ძველ) დნმ-ის ჯაჭვს ექნება მეთილის ჯგუფები ამ A-ებზე, მაშინ როცა ახლად სინთეზირებულ ჯაჭვს აკლია ისინი (ფერმენტმა, რომელიც ამ უბნებს ამოიცნობს, ჯერ ვერ იპოვა ახალი ჯაჭვი). ამრიგად, ეს არის შესაძლებლობა, შეუსაბამობის აღდგენის ფერმენტებს შეუძლიათ დნმ-ის სკანირება მოაცილონ არასწორად შეყვანილი ბაზები ახლად სინთეზირებული, არამეთილირებული ჯაჭვიდან, მეთილირებული ჯაჭვის გამოყენებით, როგორც "სწორი" შაბლონი, საიდანაც შეიტანება ახალი. ნუკლეოტიდი. ევკარიოტებში ძველისა და ძველის გარჩევის მექანიზმი.ახალი ძაფები არც ისე კარგად არის გასაგები, მაგრამ ითვლება, რომ იგი მოიცავს ახალ ძაფში დაულუქული ნიკების ამოცნობას, ისევე როგორც ზოგიერთი რეპლიკაციის ცილების მოკლევადიანი მუდმივი ასოციაციას ახალ ქალიშვილთან რეპლიკაციის დასრულების შემდეგ.

ნუკლეოტიდის ამოკვეთის შეკეთება

ნუკლეოტიდის ამოკვეთის შეკეთება ფერმენტები ცვლის დაზიანებულ ფუძეებს დაზიანებული ადგილის ორივე 3' და 5' ბოლოებზე გაჭრით. დნმ-ის მთელი სეგმენტი ამოღებულია და ჩანაცვლებულია სწორად დაწყვილებული ნუკლეოტიდებით დნმ პოლიმერაზას მოქმედებით. ბაზების შევსების შემდეგ, დარჩენილი უფსკრული ილუქება ფოსფოდიესტერის კავშირით, რომელიც კატალიზირებულია ფერმენტ დნმ ლიგაზას მიერ. აღდგენის ეს მექანიზმი ხშირად გამოიყენება, როდესაც ულტრაიისფერი სხივების ზემოქმედება იწვევს პირიმიდინის დიმერების წარმოქმნას.

ნუკლეოტიდის ამოკვეთა აღადგენს თიმინის დიმერებს. ულტრაიისფერი სხივების ზემოქმედებისას, ერთმანეთის მიმდებარე პირიმიდინებმა შეიძლება შექმნან დიმერები - ეს ამახინჯებს სპირალს და არ არის მისაღები შაბლონი რეპლიკაციური პოლიმერაზის მიერ დნმ-ის სინთეზისთვის. ნორმალურ უჯრედებში ხდება მათი ამოკვეთა და ჩანაცვლება.

დაზიანების შებრუნება

ზემოთ აღწერილი მექანიზმები ასახავს დნმ-ის აღდგენის სტრატეგიას „ამოღება და ჩანაცვლება“ და ისარგებლებს ორმაგი სპირალის ინფორმაციის სიჭარბით. გაითვალისწინეთ, რომ ამოკვეთის შეკეთება არ შეიძლება გამოყენებულ იქნას ერთჯაჭვიანი დნმ-ის ან რნმ-ის გენომებში, რომლებიც ხშირად გვხვდება ვირუსებში. თუმცა, არსებობს რამდენიმე სახის დაზიანება, რომელიც იმდენად გავრცელებულია, რომ განვითარდა სპეციალური სარემონტო გზა, რათა ამოიცნო და უბრალოდ შეცვალოს ფუძეების ამ კონკრეტული ტიპის დაზიანება, ვიდრე დაზიანებული ოლიგონუკლეოტიდის ამოკვეთა და ჩანაცვლება. ერთი მაგალითია ფოტოლიზაზა - ფერმენტი, რომელიც ამოიცნობს და აბრუნებს პირიმიდინის დიმერებს, ულტრაიისფერი სხივების გამოწვეულ დაზიანების ყველაზე გავრცელებულ ფორმას. ეს ფერმენტი რეალურად „იკვებება“ ლურჯი შუქით (რომელიც უნდა იყოს წარმოდგენილი ნებისმიერ გარემოში, სადაც ნახავთ ულტრაიისფერი შუქს). ცილა ამოიცნობს პირიმიდინის დიმერებს და სინათლის დარტყმისას ელექტრონს აძლევს (და შემდეგ იბრუნებს), არღვევს შეუსაბამო კავშირებს ორ მიმდებარე ფუძეს შორის. თითქმის ყველა ცოცხალი არსება გამოხატავს ამ ფერმენტს - გარდა, სამწუხაროდ, პლაცენტური ძუძუმწოვრებისა. ჩვენ „გაჭედილი ვართ“ ამოკვეთის შეკეთებაში, როგორც ულტრაიისფერი გამოსხივებით გამოწვეული დაზიანების შეკეთების ჩვენი ერთადერთი მეთოდი.

რეპლიკაციის, ტრანსკრიფციის და თარგმანის შეცდომების შედეგები

რაღაც მოსაფიქრებელია:

უჯრედებმა შეიმუშავეს სხვადასხვა გზა, რათა დარწმუნდნენ, რომ დნმ-ის შეცდომები აღმოჩენილია და გამოსწორებულია. ჩვენ უკვე განვიხილეთ რამდენიმე მათგანი. რატომ განვითარდა ესენი? ასეთი მექანიზმები არ განვითარებულა რნმ-ის ან ცილების შესაკეთებლად. რა შედეგები მოჰყვება ტრანსკრიფციის შეცდომას? იმოქმედებს თუ არა ასეთი შეცდომა შთამომავლობაზე? იქნება ეს უჯრედისთვის სასიკვდილო? რაც შეეხება თარგმანში შეცდომებს? როგორ განსხვავდება ეს დნმ-ის რეპლიკაციის შეცდომებთან? თუ არ იცნობთ ტრანსკრიფციას ან თარგმანს, არ ინერვიულოთ. ჩვენ მათ მალე ვისწავლით და კვლავ დავუბრუნდებით ამ კითხვას.


დნმ-ის რეპლიკაციის დაქვეითება ამცირებს ქრომატინს და წარმოქმნის ტრანსგენერაციულად მემკვიდრეობით ეპიგენეტიკურ მეხსიერებას.

დნმ-ის რეპლიკაციის დარღვევა არის კიბოს დამახასიათებელი ნიშანი და გენომის არასტაბილურობის მიზეზი. ჩვენ ვახსენებთ, რომ გენეტიკური ცვლილებების გამომწვევი გარდა, დნმ-ის რეპლიკაციის დარღვევამ ემბრიონის განვითარების დროს შეიძლება გამოიწვიოს გენომის ძირითადი ეპიგენეტიკური შედეგები. გენომის მასშტაბურ ეკრანზე, ჩვენ დავადგინეთ დნმ-ის რეპლიკაციის დაქვეითება, როგორც რეპრესირებული ტრანსგენის ექსპრესიის გაზრდის მიზეზი Caenorhabditis elegans. შეძენილი გამოხატვის მდგომარეობა იქცეოდა როგორც "ეპიალელი", რომელიც მემკვიდრეობით მიიღება მრავალი თაობის განმავლობაში სრულ გადატვირთვამდე. დერეპრესია არ შემოიფარგლებოდა ტრანსგენით, მაგრამ გამოწვეული იყო ჰეტეროქრომატინთან ასოცირებული ჰისტონის მოდიფიკაციების გლობალური შემცირებით, დნმ-ზე მოდიფიცირებული ჰისტონების დაქვეითებული შეკავების გამო ადრეულ ემბრიონში რეპლიკაციის დროს. ამრიგად, განვითარების დროს დნმ-ის რეპლიკაციის დარღვევამ შეიძლება გლობალურად შეაჩეროს ქრომატინი, შექმნას ახალი თაობათაშორის მემკვიდრეობითი ეპიგენეტიკური ექსპრესიის მდგომარეობა.

ფიგურები

ნახ. 1. დნმ-ის რეპლიკაციის დარღვევა ემბრიონის დროს…

ნახ. 1. დნმ-ის რეპლიკაციის დარღვევა ემბრიონის განვითარების დროს ახდენს ტრანსგენური მასივის დეპრესიას.

ნახ. 2. რეპრესიული ჰისტონის არარსებობა…

ნახ. 2. რეპრესიული ჰისტონის მოდიფიკაციების არარსებობა თრგუნავს დარღვეული რეპლიკაციის ეფექტს…

სურ. 3. დნმ-ის რეპლიკაციის დარღვევა გლობალურად ცვლის…

ნახ. 3. დნმ-ის რეპლიკაციის დარღვევა გლობალურად ცვლის ჰისტონების მოდიფიკაციას.

( რომ C ) წარმომადგენელი…

ნახ. 4. დნმ-ის რეპლიკაციის დარღვევა გლობალურად აფერხებს…

ნახ. 4. დნმ-ის რეპლიკაციის დაქვეითება გლობალურად ამცირებს ქრომატინს.

გენების რუკების გამოხატვის მხრივ ცვლილება…

ნახ. 5. დაქვეითებული რეპლიკაცია ხელს უშლის…

ნახ. 5. დაქვეითებული რეპლიკაცია ხელს უშლის H3K27me3-ით მოდიფიცირებული მამის ჰისტონების მემკვიდრეობას.

სურ. 6. ტრანსგენერაციული ეპიგენეტიკური მემკვიდრეობა შეძენილი…

სურ. 6. შეძენილი ექსპრესიის ტრანსგენერაციული ეპიგენეტიკური მემკვიდრეობა დნმ-ის რეპლიკაციის დარღვევის შემდეგ.

ადრეული ემბრიონის გაყოფის დროს დნმ-ის რეპლიკაციის დარღვევა იწვევს არაეფექტურ შეკავებას…


დნმ-ის რეპლიკაციის დაწყების რეგულირება Schizosaccharomyces pombe-ში

Schizosaccharomyces pombe-ის უჯრედები გაიზარდა მინიმალურ გარემოში აზოტის სხვადასხვა წყაროებით სტაბილურ მდგომარეობაში, გაორმაგების დროით 2,5-დან 14 საათამდე. ნაკადის ციტომეტრია და ფლუორესცენტული მიკროსკოპია დაადასტურეს ადრინდელი დასკვნები, რომ სწრაფი ზრდის ტემპებით, G1 ფაზა ხანმოკლე იყო და უჯრედების გამოყოფა მოხდა S ფაზის ბოლოს. აზოტის ზოგიერთი წყაროსთვის ზრდის ტემპი მნიშვნელოვნად შემცირდა, G1 ფაზას ეკავა უჯრედული ციკლის 30-50%, ხოლო უჯრედების გამოყოფა მოხდა G1-ის დასაწყისში. ამის საპირისპიროდ, აზოტის სხვა წყაროები მხარს უჭერდნენ ზრდის დაბალ ტემპებს G1 ხანგრძლივობის მნიშვნელოვანი ზრდის გარეშე. აღწერილი მეთოდი საშუალებას იძლევა მანიპულირება G1-ის სიგრძით და S ფაზის უჯრედული ციკლის შედარებითი პოზიციით ველური ტიპის უჯრედებში. უჯრედის მასა გაზომილი იყო ნაკადის ციტომეტრიით, როგორც გაფანტული შუქი და როგორც პროტეინთან ასოცირებული ფლუორესცენცია. G1-ის გაფართოებები არ იყო დაკავშირებული უჯრედის მასასთან S ფაზაში შესვლისას. ჩვენი მონაცემები არ ადასტურებს ჰიპოთეზას, რომ უჯრედებმა უნდა მიაღწიონ გარკვეულ ფიქსირებულ, კრიტიკულ მასას S-ში შესვლამდე. ჩვენ ვარაუდობთ, რომ უჯრედის მასა G1/S გარდამავალ წერტილში ცვალებადია და განისაზღვრება მოლეკულური პარამეტრების სიმრავლით. წინამდებარე ექსპერიმენტებში, ამ პარამეტრებზე გავლენას ახდენდა აზოტის სხვადასხვა წყაროები ისე, რომ დამოუკიდებელი იყო რეალური ზრდის ტემპისგან.


კომენტარი

ფონური ინფორმაცია

Human PSC-ს დიდი დაპირება აქვს რეგენერაციული მედიცინის სფეროში. მიუხედავად ამისა, იმისათვის, რომ მივაღწიოთ ამ უჯრედების სრულ პოტენციალს, პირველ რიგში უნდა გამოვიყენოთ მათი უნარი, სწრაფად და უსასრულოდ განახლდნენ გენეტიკურად სტაბილური და არადიფერენცირებული უჯრედების დიდი რაოდენობით გენერირებისთვის. თუმცა, აშკარა გახდა, რომ ადამიანის PSC იძენს გენეტიკურ ცვლილებებს გრძელვადიანი კულტურის დროს, რაც იწვევს შეშფოთებას ღეროვანი უჯრედებიდან მიღებული პროდუქტების უსაფრთხოებასთან დაკავშირებით, რომლებიც განკუთვნილია კლინიკისთვის (Draper et al., 2004, Olariu et al., 2010 წ. ). გარკვეული კარიოტიპური ცვლილებების მორეციდივე ბუნება, როგორიცაა 1q, 12p, 17q და 20q ქრომოსომების გაძლიერება, ხაზს უსვამს, რომ გარკვეული მუტაციები ზრდის უპირატესობას ვარიანტულ უჯრედს, რომელიც დროთა განმავლობაში შეირჩევა კულტურაში (Amps et al. , 2011, Baker et al., 2016, Olariu et al., 2010). მიუხედავად იმისა, რომ შერჩევის მექანიზმი ახლა კარგად არის განსაზღვრული, შედარებით ცოტა რამ არის ცნობილი ძირითადი მუტაციური მექანიზმების შესახებ, თუმცა დაკვირვებები რეპლიკაციის სტრესზე და გენომიურ დაზიანებაზე ადამიანის PSC-ში მსგავსია ონკოგენით გამოწვეული გენეტიკური არასტაბილურობის მოდელის კიბოს განვითარებასა და პროგრესირებაში (Halazonetis , გორგოულისი და ბარტეკი, 2008 წ.). ადამიანის PSC-ის თვითგანახლებას ახასიათებს შემოკლებული G1 ფაზა, რომელიც გვერდს უვლის Rb/E2F საკონტროლო პუნქტს და განპირობებულია ციკლინის D2-ის მაღალი ექსპრესიით და ციკლინის E-ს შემადგენელი ექსპრესიით (Becker et al., 2006, Filipczyk, Laslett, Mummery, & Pera, 2007). ამ სწრაფი პროლიფერაციის შენარჩუნებამ კულტურების ფართო პერიოდებში შეიძლება გამოავლინოს ეს უჯრედები რეპლიკაციის სტრესის მიმართ, რომელთა მახასიათებლები, როგორიცაა რეპლიკაციის შემცირებული სიჩქარე, განისაზღვრა ადამიანის PSC-ში დნმ-ის ბოჭკოების ანალიზის გამოყენებით (Halliwell et al., 2020). გარდა ამისა, ჩვენ ახლახან გამოვავლინეთ მიკროჰომოლოგიის რეგიონები მე-20 ქრომოსომის ტანდემური გაძლიერების წყვეტის წერტილში, რაც გულისხმობს, რომ შაბლონის გადართვის მექანიზმები შეჩერებულ ან ჩამონგრეულ ჩანგლებზე პასუხისმგებელნი არიან ამ მუტაციებზე (JA Halliwell, D. Baker, PW Andrews, I. Barbaric, unpub. დაკვირვება.). ერთობლივად, ამ კვლევებმა დაადგინა, რომ გენეტიკური სტაბილურობა ადამიანის PSC-ში აშკარად არის დაკავშირებული დნმ-ის რეპლიკაციასთან. ეს სტატია შეიცავს ექსპერიმენტულ დეტალებს და პროტოკოლებს, რომლებიც საჭიროა დნმ-ის ბოჭკოების ანალიზის შესასრულებლად, რომლებიც ოპტიმიზებულია ადამიანის PSC-ში რეპლიკაციის სტრესის შესასწავლად.

ამ სტატიაში აღწერილი პროცედურა ოპტიმიზირებულია ადამიანის PSC-თან გამოსაყენებლად და წარმატებით იქნა გამოყენებული ადამიანის iPSC და ადამიანის ESC უჯრედების რამდენიმე ხაზზე (Halliwell et al., 2020). ჩვენ გამოვიყენეთ ეს ანალიზი კულტურის პირობების გასაუმჯობესებლად: კულტურების დამატება ნუკლეოზიდებით ამსუბუქებს რეპლიკაციის სტრესს და ამცირებს მიტოზური შეცდომების სიხშირეს, რაც ხაზს უსვამს იმას, რომ ეს მოვლენები დაკავშირებულია ადამიანის PSC-ში (Halliwell et al., 2020). დნმ-ის ბოჭკოების ანალიზმა გამოავლინა მიდგომები, რომლებიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას ადამიანის PSC-ში გენეტიკური არასტაბილურობის შესამცირებლად, რაც აუცილებელია რეგენერაციულ მედიცინაში ადამიანის PSC-ის უსაფრთხო გამოყენებისთვის.

კრიტიკული პარამეტრები

ჩვენ შევამჩნიეთ მცირე განსხვავება ბოჭკოვანი ანალიზის შედეგებში, არის თუ არა ადამიანის PSC კულტივირებული mTeSR, E8 ან Nutristem უჯრედების კულტურის გარემოში. ამჟამად, მიმწოდებლის შრეზე დამოკიდებული უჯრედული კულტურის პრაქტიკა არ არის გამოცდილი. მთელი ანალიზი შეიძლება გაკეთდეს ერთ დღეში, თუმცა ჩვენ ჩავრთეთ გაჩერების წერტილი ფიქსაციის ეტაპის შემდეგ ძირითად პროტოკოლ 2-ში, რომელიც იძლევა პროტოკოლის გაშვების საშუალებას 2 დღის განმავლობაში.

ჩვენ გირჩევთ დაუშვათ ადამიანის PSC-ს გამოჯანმრთელება მინიმუმ 48 საათის განმავლობაში დარგვის შემდეგ. ეს საშუალებას მისცემს 24 სთ კულტურას Rho-თან ასოცირებული, დახვეული ხვეულის შემცველი პროტეინ კინაზა 1 ინჰიბიტორის გარეშე (Y-27632). ის ასევე საშუალებას მისცემს გამოჯანმრთელდეს სტრესული ხელახალი დაფარვისგან და უჯრედები კვლავ შევიდნენ ლოგარითმული ზრდის ფაზაში. კრიტიკულია, სადაც ექსპერიმენტების შედეგები უნდა შევადაროთ, რომ თავდაპირველად დათესილი უჯრედების სიმკვრივე და ექსპერიმენტის დაწყების წერტილში შესართავი თანმიმდევრული იყოს. უფრო მაღალმა შერწყმამ შეიძლება გამოიწვიოს უჯრედების პროლიფერაცია და დნმ-ის რეპლიკაციის შენელება.

რაც შეეხება დნმ-ის მარკირებას, შესაძლებელია პულსის მარკირების დროის გაზრდა ან შემცირება, მაგრამ ეს გამოიწვევს, შესაბამისად, უფრო გრძელი და მოკლე დნმ-ის ბოჭკოებს. ისევ და ისევ, მარკირების დრო უნდა იყოს მუდმივი შესადარ ექსპერიმენტებში. ასევე მნიშვნელოვანია, რომ მარკირების დრო ზუსტად იყოს გაზომილი. 1 წუთიდან ერთი გადახრები გაზრდის ეტიკეტირებას 5%-ით და დაარღვევს ექსპერიმენტის შედეგებს. დროული მარკირების უზრუნველსაყოფად, რეკომენდებულია რეაგენტების მომზადება ექსპერიმენტის დაწყებამდე. ასევე, მეორე ნუკლეოტიდის ანალოგის (IdU) დამატებისას, ფირფიტა უნდა მოიხსნას ინკუბატორიდან პირველი ინკუბაციური პერიოდის დასრულებამდე 1 წუთით ადრე, რათა მოხდეს დროის ბუფერი მეორე ეტიკეტის მომზადებისას.

მოსავლის აღების შემდეგ, უჯრედები უნდა იყოს შეჩერებული ყინულივით ცივ PBS-ში და ინახება ყინულზე. შემდეგ დნმ-ის გავრცელება უნდა განხორციელდეს 30 წუთში, რათა მინიმუმამდე დაიყვანოს უჯრედების სიკვდილი.

დნმ-ის ბოჭკოების გავრცელებისას მომხმარებელმა უნდა აირჩიოს სლაიდები, სადაც წვეთი სლაიდის სიგრძეზე 3-დან 5 წუთამდე გავრცელდება მუდმივი სიჩქარით. ჩვენი გამოცდილებით, სლაიდების პარტიები შეიძლება განსხვავდებოდეს ერთმანეთისგან და თითოეული პარტია უნდა იყოს ოპტიმიზირებული.

Დიაგნოსტიკა

ცხრილი 2 აღწერს პრობლემებს, რომლებიც შეიძლება წარმოიშვას ანალიზის სხვადასხვა ეტაპზე, მათ შესაძლო მიზეზებთან და გადაწყვეტილებთან ერთად.

ნაბიჯი პრობლემა შესაძლო მიზეზი გამოსავალი
ძირითადი პროტოკოლი 1 (ნაბიჯი 18) ძალიან ბევრი გადახურული დნმ ბოჭკო ეტიკეტირებული უჯრედების გავრცელების სიმკვრივე ძალიან მაღალია მოკრეფილი ეტიკეტირებული უჯრედის ხსნარი განზავდეს
ძირითადი პროტოკოლი 2 (ნაბიჯი 6) ბოჭკოების გავრცელება ხდება ძალიან ნელა ან სწრაფად Ოთახის ტემპერატურაზე გავრცელების ბუფერის მოცულობის გაზრდა ან შემცირება
ტენიანობა გაზარდეთ ან შეამცირეთ სლაიდის დახრის კუთხე
მიკროსკოპის სლაიდი გამოყენებამდე გააუმჯობესეთ გავრცელების პირობები თითოეული ბრენდისა და მიკროსკოპის სლაიდების ჯგუფისთვის
მხარდაჭერის პროტოკოლი 2 არათანმიმდევრული შედეგები ბიოლოგიურ და ტექნიკურ რეპლიკებს შორის პულსის მარკირების სიგრძე დარწმუნდით, რომ CldU ან IdU დაემატება ზუსტად 20 წუთის განმავლობაში
დრო უჯრედის აღებასა და გავრცელებას შორის შეასრულეთ გავრცელება უჯრედის აღების შემდეგ უფრო ადრე. შეამცირეთ ნიმუშების რაოდენობა, რომ გახდეთ უფრო მართვადი.

Სტატისტიკური ანალიზი

მნიშვნელოვანია გადაიღოთ ველების სურათები მინიმალური ბოჭკოვანი გადაკვეთით მთელ სლაიდზე, რათა უზრუნველყოფილი იყოს პროგრესირებადი რეპლიკაციის ჩანგლების მყარად გაზომვა. მინიმუმ 150-200 ცალკეული ბოჭკო უნდა გაიზომოს პროგრესირებად ჩანგლებს შორის ჰეტეროგენურობის გასათვალისწინებლად. დაჭიმული დნმ-ის ბოჭკოების გარდაქმნის ფაქტორი არის 2,59 კბ/მკმ (Jackson & Pombo, 1998).

ყურადღება უნდა მიექცეს მონაცემთა პრეზენტაციას. ჰისტოგრამები და სკატერის ნახაზები შესაბამისია რეპლიკაციის ჩანგლის პროგრესირების ნორმალური განსხვავებების დასაფიქსირებლად. სტატისტიკური მნიშვნელოვნება შეიძლება გამოითვალოს დაუწყვილებელი Mann-Whitney-ის გამოყენებით U-ტესტი.

შედეგების გაგება

წარმოებული დნმ-ის ბოჭკოები შეიძლება იყოს ცვალებადი, მაგრამ, ჩვენი გამოცდილებით, ნორმალური ზრდის პირობებში, ისინი უნდა შეიცავდეს CldU და IdU შეღებვის თანაბარ სიგრძეს. გაზომვისას ვხვდებით, რომ რეპლიკაციის ჩანგლის სიჩქარე მერყეობს 0,5-დან 0,75 კბ/წთ-მდე. ბოჭკოს შემცირებული სიგრძე ან ჩანგლის სიჩქარე შეიძლება მიუთითებდეს რეპლიკაციის სტრესზე.

რეპლიკაციის მოვლენების სიხშირის მონიტორინგს შეუძლია მიაწოდოს ღირებული ინფორმაცია ადამიანის PSC-ის კულტურის დროს მიმდინარე რეპლიკაციის პროცესებთან დაკავშირებით (ნახ. 3). რეპლიკაციის წარმოშობის სიმკვრივის მკაცრი კონტროლია საჭირო ქრომოსომული სტაბილურობის შესანარჩუნებლად (Prioleau & MacAlpine, 2016). რეპლიკაციის წარმოშობის გადაჭარბებულმა გასროლამ შეიძლება დაასუსტოს დნმ-ის ეფექტური რეპლიკაციისთვის საჭირო ცილა და მეტაბოლიტები (Sørensen & Syljuåsen, 2012). საწყისთაშორისი მანძილის შემცირება ან მხოლოდ IdU-ზე ეტიკეტირებული ბოჭკოების უფრო მაღალი სიმკვრივე არის გაზრდილი საწყისი სიმკვრივის საზომი, რაც მიუთითებს რეპლიკაციის ერთდროულად გასროლის საწყისების დიდ რაოდენობაზე. ჩანგალი დნმ-ის გატეხვის წინაპირობაა, რომელიც შეიძლება გახდეს გენეტიკური არასტაბილურობის სუბსტრატი (Toledo, Neelsen, & Lukas, 2017). მხოლოდ CldU ბოჭკოების სიხშირის გაზომვა ან IdU ეტიკეტების თანაფარდობა ორმიმართულ ჩანგალზე შეიძლება გამოყენებულ იქნას ჩანგლის გაჩერების გასაზომად. ორმხრივი ჩანგლის ერთ მხარეს მოკლე IdU ბოჭკო გულისხმობს ჩანგლის გაჩერებას და გამოიწვევს IdU ტრაქტებს შორის უფრო დიდ თანაფარდობას.

დროის მოსაზრებები

ძირითადი პროტოკოლი 1

უჯრედები უნდა გაიზარდოს მინიმუმ 48 საათის განმავლობაში დათესვის შემდეგ, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ 72 საათი ოპტიმალურია. საფეხურები 1-დან 6-მდე: ~40 წუთი დასჭირდება უჯრედის დათესვას. ~20 წთ დღეში დაგჭირდებათ საშუალების განახლებისთვის.

საფეხურები 7-დან 18-მდე: ~1 სთ იქნება საჭირო უჯრედების იმპულსური ეტიკეტირებისა და მოსავლისთვის.

ძირითადი პროტოკოლი 2

საფეხური 1-დან 4-მდე: უჯრედის ლიზატის მომზადებას დნმ-ის გავრცელებისთვის დასჭირდება ~15 წუთი.

ნაბიჯი 5-დან 7-მდე: დნმ-ის გავრცელებას დასჭირდება ~20 წუთი სამი სლაიდის ერთი ნაკრების ერთდროულად გასავრცელებლად.

ნაბიჯი 8-დან 10-მდე: დნმ-ის ბოჭკოების ფიქსაცია დასჭირდება ~15 წთ.

ძირითადი პროტოკოლი 3

ნაბიჯი 1-დან 18-მდე: დნმ-ის იმუნომარკეტირების საფეხურებს დასჭირდება ~6,5 სთ.

მხარდაჭერის პროტოკოლი 1 და 2

რამდენიმე საათი დასჭირდება გამოსახულების მიღებისა და მონაცემთა ანალიზისთვის, მაგრამ ეს ცვალებადი იქნება დნმ-ის ბოჭკოების ხარისხზე და დასმულ ბიოლოგიურ კითხვაზე.

მადლიერებები

ამ პროექტმა მიიღო დაფინანსება ევროკავშირის ჰორიზონტ 2020 კვლევისა და ინოვაციების პროგრამისგან საგრანტო ხელშეკრულებით No668724.

ეს ნამუშევარი ნაწილობრივ დაფინანსდა ევროკავშირის Horizon 2020 კვლევისა და ინოვაციების პროგრამით საგრანტო ხელშეკრულებით No. 668724 და ნაწილობრივ გაერთიანებული სამეფოს რეგენერაციული მედიცინის პლატფორმის მიერ, MRC მითითება MR/R015724/1.


4 პასუხი 4

პროფესორ ალენ გატმანს აქვს შესანიშნავი 10 წუთიანი ვიდეო Youtube-ზე, სადაც განმარტავს ნუკლეოტიდის დამატების რეაქციას 5'-დან 3'-მდე მიმართულებით და რატომ არ მუშაობს სხვაგვარად.

მოკლედ, ფოსფოდიესტერული ბმის წარმოქმნის ენერგია მოდის dNTP-დან, რომელიც უნდა დაემატოს. dNTP არის ნუკლეოტიდი, რომელსაც აქვს ორი დამატებითი ფოსფატი მიმაგრებული მის 5' ბოლოზე. იმისათვის, რომ შეუერთდეს 3'OH ჯგუფს შემდეგი ნუკლეოტიდის ფოსფატთან, ერთი ჟანგბადი უნდა მოიხსნას ამ ფოსფატის ჯგუფიდან. ეს ჟანგბადი ასევე მიმაგრებულია ორ დამატებით ფოსფატთან, რომლებიც ასევე ერთვის Mg++-ს. Mg++ იზიდავს ჟანგბადის ელექტრონებს, რაც ასუსტებს ამ კავშირს და ჟანგბადის ე.წ. ნუკლეოფილური შეტევა 3'OH-დან წარმატებულია, რითაც წარმოიქმნება ფოსპოდიესტერული ბმა.

თუ თქვენ ცდილობთ შეუერთდეთ dNTP-ის 3'OH ჯგუფს შემდეგი ნუკლეოტიდის 5' ფოსფატს, არ იქნება საკმარისი ენერგია 5' ფოსფორთან დაკავშირებულ ჟანგბადს შორის კავშირის შესუსტებისთვის (dNTP-ის დანარჩენი ორი ფოსფატი არის 5' ბოლოზე და არა 3' ბოლოზე), რაც ართულებს ნუკლეოფილურ შეტევას.

უყურეთ ვიდეოს, იქ უფრო კარგად არის ახსნილი.

დნმ-ის რეპლიკაციას სჭირდება ენერგიის წყარო, რომ გაგრძელდეს, ეს ენერგია მიიღება ნუკლეოტიდის 5'-ტრიფოსფატის დაშლით, რომელიც ემატება არსებულ დნმ-ის ჯაჭვს. პოლიმერაზას ნებისმიერმა ალტერნატიულმა მექანიზმმა უნდა გაითვალისწინოს ნუკლეოტიდის დასამატებლად საჭირო ენერგიის წყარო.

უმარტივესი გზა, რომელიც შეიძლება წარმოვიდგინოთ საპირისპირო 3'-5' პოლიმერიზაციის შესასრულებლად, იქნება ნუკლეოტიდ-3'-ტრიფოსფატის გამოყენება ნუკლეოტიდ-5'-ტრიფოსფატის ნაცვლად, რომელსაც ყველა არსებული პოლიმერაზა იყენებს. ეს საშუალებას მისცემს პრაქტიკულად იდენტური მექანიზმის შექმნას, როგორც არსებული პოლიმერაზები, მხოლოდ სხვადასხვა ნუკლეოტიდებით, როგორც სუბსტრატები. ამ მოდელის პრობლემა ის არის, რომ რიბონუკლეოტიდ-3'-ტრიფოსფატები ნაკლებად სტაბილურია მჟავე პირობებში მეზობელი 2'-OH-ის გამო (თუმცა ეს აშკარად ეხება მხოლოდ რნმ-ს და არა დნმ-ს).

ასე რომ, ნებისმიერ 3'-5' პოლიმერაზას სავარაუდოდ დასჭირდება იგივე ნუკლეოტიდ-5'-ტრიფოსფატების გამოყენება, რაც 5'-3' პოლიმერაზას. ეს ნიშნავს, რომ ტრიფოსფატი, რომელიც უზრუნველყოფს ახალი ნუკლეოტიდის დამატების ენერგიას, იქნება დნმ-ის ძაფზე, რომელიც გაფართოებულია და არა ახლად დამატებულ ნუკლეოტიდზე.

ამ მიდგომის ერთი მინუსი არის ის, რომ ნუკლეოტიდური ტრიფოსფატები სპონტანურად ჰიდროლიზდება წყლის პირობებში. ეს არ არის მნიშვნელოვანი პრობლემა 5'-3' პოლიმერაზასთვის, რადგან ტრიფოსფატი არის ახალ ნუკლეოტიდზე და პოლიმერაზამ უბრალოდ უნდა მოძებნოს ახალი ნუკლეოტიდი. 3'-5' პოლიმერაზასთვის სპონტანური ჰიდროლიზი პრობლემაა, რადგან ტრიფოსფატი მზარდ ჯაჭვზეა. თუ ის ჰიდროლიზდება, მთელი პოლიმერიზაცია ან უნდა შეწყდეს ან ტრიფოსფატი წაიკითხოს რაიმე მექანიზმით.

ამის შესახებ მეტი ინფორმაციისთვის შეგიძლიათ გადახედოთ ჯოშუა ბალანკოსა და მარკ ლ. მენსფილდის სტატიას "ნუკლეოტიდური პოლიმერაზას მიმართულების ევოლუციის მოდელი". მათ შექმნეს მოდელი ადრეული პოლიმერაზას ევოლუციის შესახებ, თუმცა საბოლოო დასკვნამდე არ მიდიან.

ჩემი აზრით, პროფესორ ალენ გატმანის "დიდი 10 წუთიანი ვიდეო Youtube-ზე" დროის კარგვაა, თუ უკვე იცით, როგორ ხდება ჰიდროლიზი.ფაქტობრივად, მან არ განიხილა 3'->5' მარშრუტი მიუკერძოებლად, როგორც ჩანს, არ უყურებს ტრიფოსფატის გამოჩენის შესაძლებლობას ძაფების მზარდ 5' წვერზე 3'->5'-ში. საქმე.

სინამდვილეში, ერთადერთი განსხვავება ორ მარშრუტს შორის (5'->3' და 3'->5') არის ის, რომ მორეაქტიული ტრიფოსფატი ჩნდება სხვადასხვა ადგილას. ჩვეულებრივ შემთხვევაში, ჰიდროლიზირებული ტრიფოსფატი მიეკუთვნება დამატებულ ნუკლეოტიდს, ხოლო ამ უკანასკნელ შემთხვევაში, ჰიდროლიზირებული ტრიფოსფატი მიეკუთვნება მზარდ ძაფზე არსებულ ნუკლეოტიდს. ორივე შესაძლებელია.

ფაქტობრივად, ცნობილია, რომ რნმ პოლიმერაზას აქვს ორმაგი აქტივობა, მაგრამ ხედავთ, რნმ პოლიმერაზას არ აქვს კორექტირების აქტივობა!. კორექტირება საჭიროებს შეუსაბამო ფუძის მოცილებას, მაგრამ 3'->5 მიმართულებით ბაზის დანამატმა მოიხმარა ტრიფოსფატი ღეროს 5' წვერზე, ამიტომ აღარ არის ხელმისაწვდომი შემცვლელი ბაზის დამატება. 3'->5' აქტივობა ადვილად ანადგურებს პოლიმერაზას კორექტირების შესაძლებლობას ასე რომ, ძირითადად, ეს არის კორექტირების საჭიროება, რომელიც ზღუდავს დნმ-ის ჯაჭვების სინთეზს 5'->3'-მდე.. რატომ არის ასე, უფრო მეტი ახსნა დასჭირდება (თუ სიტყვებით), მაგრამ მე ვფიქრობ, რომ სურათს გაცილებით უკეთესი ახსნა-განმარტების ძალა აქვს ვიდრე ათას სიტყვას. მე დავამატე სურათი საიდან ძირითადი უჯრედული ბიოლოგია რომელიც აჩვენებს პასუხს კითხვაზე "რატომ":

კიდევ ერთი მნიშვნელოვანი საკითხია რემონტი. თუ ერთი ან მეტი ნუკლეოტიდი აკლია ერთ ჯაჭვში, დაკარგული ნუკლეოტიდის შეკეთება შეუძლებელი იქნება 3'-დან 5'-მდე სინთეზისთვის, რადგან არ არსებობს 5'-ტრიფოსფატი. მეორეს მხრივ, 5'-დან 3'-მდე სინთეზს არ სჭირდება 3'-ტრიფოსფატი, რომელიც იმყოფება სარემონტო ადგილზე. Ეს მნიშვნელოვანია. ანუ 3'-დან 5'-მდე სინთეზი არ იძლევა ნუკლეოტიდის შეკეთების საშუალებას.


შედეგები

TrAEL-seq-ის განხორციელება

სხვადასხვა ლიგაზას შეუძლია ერთჯაჭვიანი დნმ-ის ლინკერების მიმაგრება ერთჯაჭვიანი დნმ-ის 3' ბოლოზე, მაგრამ ეფექტურობა ზოგადად დაბალია. მიურასა და კოლეგების მიერ აღწერილი ალტერნატიული მეთოდი იყენებს ტერმინალურ დეოქსინუკლეოტიდილ ტრანსფერაზას (TdT) 1-დან 4 ადენოზინის ნუკლეოტიდის დასამატებლად ერთჯაჭვიან დნმ 3' ბოლოებზე, რაც ქმნის სუბსტრატს რნმ ლიგაზებით დნმ-ის ადაპტერის ლიგაციისთვის [41,42] (ნახ. 1A საფეხურები). მე და II). სატესტო სუბსტრატზე in vitro, TdT-მ დაამატა 1-დან 3 ნუკლეოტიდს A კუდები ერთჯაჭვიანი დნმ-ის მოლეკულების >95%, რომელიც იყო ლიგირებული დაახლოებით 10%-იანი ეფექტურობით TrAEL-seq ადაპტერ 1-ში შეკვეცილი T4 RNA ლიგაზა 2 KQ (ნახ. 1B) .

(A) TrAEL-seq მეთოდის სქემატური წარმოდგენა. აგაროზაში ჩაშენებული გენომიური დნმ გამოიყენება, როგორც საწყისი მასალა, შტეფსელები ინტენსიურად ირეცხება არალიგირებული TrAEL ადაპტერი 1-ის მოსაშორებლად და აგაროზა ამოღებულია Bst 2.0 პოლიმერაზას საფეხურამდე. TrAEL-ადაპტორი 2-ის ბლანტირება და ლიგირება ხორციელდება NEBNext Ultra II დნმ-ის ნაკრების გამოყენებით, ხოლო TrAEL-ადაპტორი 2 ჰომოდიმერები ამოღებულია სტრეპტავიდინის მარცვლების დაბანით USER ფერმენტით დამუშავებამდე. მზა მასალა მზად არის PCR გაძლიერებისთვის NEBNext გამაძლიერებელი სისტემის გამოყენებით. გაითვალისწინეთ, რომ TrAEL-seq კითხულობს რუკას ანტისენსს გაწყვეტილ ძაფზე, კითხულობს დამატებით მიმდევრობას დაწყებული პირველი ნუკლეოტიდიდან გაყოფის ადგილამდე. *-ბიოტინის ნაწილი, U-დეოქსიურაცილი, N-ნებისმიერი დნმ-ის ბაზა, rA-ადენოზინი. () ადაპტერის ლიგაციის ინ ვიტრო ანალიზი. 18-ნუკლეოტიდის ერთჯაჭვიანი დნმ ოლიგონუკლეოტიდი დამუშავებული იყო TdT-ით ან მის გარეშე, შემდეგ ლიგირებული იყო TrAEL ადაპტერ 1-თან T4 RNA ლიგაზა 2-ის შეკვეცილი KQ-ის გამოყენებით. პროდუქტები გამოყოფილი იყო 15%-იან PAGE გელზე და ვიზუალიზებული იყო SYBR Gold შეღებვით. (C) სკატერული დიაგრამა, რომელიც ადარებს წაკითხვის რაოდენობას საფუარის დნმ-ით დამუშავებული სფიᲛᲔ, PmeᲛე და არამე, გენომის საშუალოსთან ერთად, ეფუძნება END-seq და TrAEL-seq. გაითვალისწინეთ, რომ გენომის საშუალო სიგნალი მოიცავს ყველა ერთ ასლ 13 bp რეგიონს, რომელიც არ ემთხვევა ადგილს, ხოლო შეზღუდვის ფერმენტის რაოდენობრივი მაჩვენებელი წარმოადგენს წაკითხვის რუქას 13 bp-მდე ამოცნობის ადგილის გარშემო (სფიI საიტი არის 13 bp, არაᲛᲔ / PmeI საიტები გაფართოვდა 13 bp-მდე). () ზუსტი რუკების სფივყოფ უბნებს TrAEL-seq და END-seq მიხედვით. სფიI უბნები, რომლებიც შეიცავს 5 დეგენერაციულ ფუძეს, დაიყო ისეთებად, რომლებიც არ შეიცავს A-ს გაყოფის ადგილზე (GGCCNNNB|BGGCC, 87 ადგილი, ზედა პანელი) ან A-ების გაყოფის ადგილის გვერდით (GGCCNNNA|AGGCC, 15 ადგილი, ქვედა პანელი). დაშლის ადგილები წინა და უკანა ძაფებზე ცალკე. 3' ბოლოების რუკირებული მდებარეობები დაფიქსირდა საშუალოდ თითოეული კატეგორიის საიტზე და გამოიხატებოდა, როგორც პროცენტი ყველა 3' ბოლოების, რომლებიც შედგენილია თითოეული მეთოდით საიტის ამ კატეგორიაში. () მეიოტური DSB პროფილების შედარება dmc1Δ უჯრედები შესრულებული TrAEL-seq და sae2Δ უჯრედები S1-seq-ით (SRA შეერთება: SRP261135) [45]. ორივე ტექნიკამ უნდა ასახოს Spo11 გაყოფის ადგილები მოცემულ მუტანტებში. 25 კბ და 2,5 კბ უბნები III ქრომოსომაზე ნაჩვენებია 20 bp ფანჯარაში დათვლილი წაკითხვისთვის. ყველაზე დაბალი პანელი აჩვენებს 500 bp-ს მთავარი პიკის გარშემო წაკითხვისთვის, რომელიც დათვლილია ერთი bp გარჩევადობით. () ლოგ-ტრანსფორმირებული ნორმალიზებული წაკითხვის რაოდენობის გაფანტული დიაგრამა 3,907 Spo11 გაყოფის ცხელ წერტილში, ანოტირებული მოჰიბულას და კინის მიერ, შედარება dmc1Δ TraEL-seq ერთად sae2Δ S1-seq მონაცემები (მარჯვნივ) [16,45,47] (SRA შეერთება: SRP261135). ამ ფიგურის საფუძვლიანი რიცხვითი მონაცემები შეგიძლიათ იხილოთ S1 Data-ში, ლარის გამოსახულება S1 Raw Images-ში. DSB, ორჯაჭვიანი შესვენება TdT, ტერმინალური დეოქსინუკლეოტიდილ ტრანსფერაზა TrAEL-seq, ტრანსფერაზა-აქტივირებული ბოლო ლიგაციის თანმიმდევრობა.

TrAEL-seq ადაპტერი 1 არის თმის სამაგრი, რომელიც ახორციელებს ერთჯაჭვიანი ლიგაციის პროდუქტების გარდაქმნას ბიბლიოთეკის მშენებლობისთვის შესაფერის ორჯაჭვიან დნმ-ად, შეიცავს ბიოტინის ნაერთს დეზოქსიურაცილის ნარჩენებით, რაც საშუალებას აძლევს ლიგაციის პროდუქტების შერჩევით გაწმენდას და გამორეცხვას და მოიცავს 8- ნუკლეოტიდის უნიკალური მოლეკულური იდენტიფიკატორი (UMI) PCR დუბლიკატების ბიოინფორმაციული მოცილებისთვის (ნახ 1A). მას შემდეგ, რაც TrAEL-seq ადაპტერი 1 ლიგირებულია, თერმოფილური პოლიმერაზა ძლიერი ჯაჭვის გადაადგილებით და საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას აქტივობით აგრძელებს თმის სამაგრს, რათა ჩამოაყალიბოს გაუთავებელი ორჯაჭვიანი დნმ (ნახ. იწმინდება სტრეპტავიდინის მაგნიტურ მარცვლებზე (ნახ. 1A, საფეხურები IV და v). ფრაგმენტაციის დროს წარმოქმნილი დნმ-ის ბოლოები გაპრიალებულია და ლიგირებულია TrAEL ადაპტერ 2-ზე, სანამ ჯერ კიდევ არის მიბმული მარცვლებზე (ნახ. 1A, ნაბიჯი vi), შემდეგ გაწმენდილი ფრაგმენტები, რომლებიც გარშემორტყმულია TrAEL ადაპტერებით 1 და 2, გამოირეცხება დეოქსიურაცილის ნარჩენების დაშლით ბიბლიოთეკამდე. გაძლიერება (ნახ 1A, ნაბიჯი vii). მიღებული ბიბლიოთეკის თანმიმდევრობა ხდება პრაიმერის გამოყენებით, რომელიც ანელებს TrAEL-seq ადაპტერ 1-ს, ისე, რომ TrAEL-seq წაკითხული არის ორიგინალური დნმ 3' დასასრულის საპირისპირო კომპლიმენტი (ნახ 1A, ნაბიჯი VIII).

3' გაფართოებული დნმ-ის გამოვლენა მთავრდება TrAEL-seq-ით

ჩვენ გამოვცადეთ TrAEL-seq აგაროზაში ჩაშენებულ საფუარის გენომურ დნმ-ზე, რომელიც მონელებულია რესტრიქციული ფერმენტებით არაᲛᲔ, PmeᲛე და სფიI, რომელიც გამოყოფს 5′ გაფართოებულ, ბლაგვ და 3′ გაფართოებულ ბოლოებს, შესაბამისად, და წარმოქმნის BLESS-ის ტიპის END-seq ბიბლიოთეკას შედარებისთვის იმავე დამუშავებული მასალისგან (ნახ 1C). შედეგად მიღებული TrAEL-seq ბიბლიოთეკა შეიცავდა ფრაგმენტებს 200-დან 2000 bp-მდე, როგორც მოსალოდნელი იყო (S1A ნახ), და თანმიმდევრობის მონაცემები დამუშავდა მორგებული ბიოინფორმატიული მილსადენის მეშვეობით A-კუდის ამოსაღებად, წაკითხულის რუკაზე და UMI-ით დუბლიკატისთვის (ილუსტრირებულია S1B ნახ. ). TrAEL-seq და END-seq მონაცემების შედარება გვიჩვენებს, რომ ორივე მეთოდი აღმოაჩენს შემაკავებელი ფერმენტის გაყოფის ადგილებს: ეფექტურობა დაახლოებით ტოლია 3' გაფართოებულ ბოლოებზე, END-seq უფრო ეფექტურია 5' გაფართოებულ ბოლოებზე, ხოლო TrAEL-seq მოულოდნელად უკეთესია ბლაგვი PmeI მთავრდება (ნახ 1C). ამიტომ, ორივე მეთოდი ეფექტურად აღმოაჩენს DSB-ებს, მიუხედავად იმისა, რომ მარკირების სტრატეგიები ძალიან განსხვავებულია.

შეზღუდვის ფერმენტი სფიმე მაქვს გადაგვარებული ამოცნობის თანმიმდევრობა (GGCCNNNN|NGGCC), რომელიც საშუალებას იძლევა შეფასდეს TrAEL-seq ლიგაციის ეფექტურობა სხვადასხვა 3' ბოლო თანმიმდევრობებზე, რაც საშუალებას გვაძლევს დავრწმუნდეთ, რომ არ არსებობს მიკერძოება დნმ-ის ბოლოებისთვის 3' ან მიმდებარე ნუკლეოტიდებზე დაყრდნობით (S1C ნახ. ). ნაპრალების ჯარიმა რუკაზე სფიI ამოცნობის საიტი GGCCNNNN|NGGCC ავლენს განსხვავებებს END-seq და TrAEL-seq-ს შორის: END-seq, BLESS-ის ტიპის სხვა მეთოდებთან ერთად, ანადგურებს 3' გადახურვას და აბრუნებს 4-დან 5-მდე ნუკლეოტიდების კონსენსუსის გაყოფის ადგილს 3'. ამოცნობის ადგილი (ნახ 1D). ამის საპირისპიროდ, TrAEL-seq-ს შეუძლია ასახოს რეალური გაყოფის ადგილი (3' ნუკლეოტიდი 8) და ამას აკეთებს >98% მოვლენებისთვის, მაგრამ მხოლოდ სფიI ადგილები, რომლებსაც აკლიათ A ნუკლეოტიდები დაშლის ადგილის მიმდებარედ (ანუ GGCCNNNB|BGGCC) (ნახ. 1D, ზედა). ეს პრობლემა მომდინარეობს TdT-ის მიერ დამატებული A-კუდებიდან, რომლებიც ვერ გამოირჩევიან გენომით კოდირებული A-ებისგან. ამ საკითხის მოსაგვარებლად, ჩვენ გამოვიყენეთ ტრიმირების ალგორითმი, რომელიც წაკითხვის დაწყებიდან ამოიღებს მაქსიმუმ 3 T-ს. ვინაიდან კუდის საშუალო სიგრძეა 2-დან 4-მდე ნუკლეოტიდი, ეს სწორად ასახავს მას სფიმე ვყოფ უბნებს ნუკლეოტიდებს 7-დან 9-ში, წაკითხვის >98%-ში, მაშინაც კი, როცა განიხილება მხოლოდ ყველაზე რთული უბნები რუკებისთვის (ისინი GGCCNNNA|AGGCC სტრუქტურით) (ნახ. 1D, ქვედა). მნიშვნელოვანია, რომ ეს ალგორითმი არ აჭარბებს ბოლოებს გენომის კოდირებულ A ტრაქტებში ისე, რომ 10 სფიI საიტები 2 ან მეტი 3′ A-ით (GGCCNNAA|NGGCC) იგივე სიზუსტით არის დატანილი (S1D ნახ). ჩვენ ვარაუდობთ, რომ ეს საერთო რუკების სიზუსტე >98% ±1 ნუკლეოტიდის ფარგლებში საკმარისი იქნება თითქმის ყველა აპლიკაციისთვის.

TrAEL-seq-ის მთავარი სიძლიერე უნდა იყოს DSB-ების ორიგინალური ადგილების რუკა რეზექციის შემდეგაც კი, წერტილი ჰომოლოგიური რეკომბინაციის პროცესში, რომელიც განსაკუთრებით ექვემდებარება სტაბილიზაციას მუტაციების გამოყენებით, რომლებიც ხელს უშლიან ძაფების შეჭრას. ჩვენ ავირჩიეთ მეიოზი, როგორც in vivo მოდელის სისტემა ამის დასადასტურებლად, რადგან მეიოტური DSB შაბლონები ძალიან კარგად იყო დახასიათებული. Spo11-ით წარმოქმნილი მეიოტური DSB მუშავდება Sae2-ით სხვა ფაქტორებთან ერთად რეზექციამდე, რის შემდეგაც ჯაჭვის შეჭრა ჰომოლოგიურ ქრომოსომაში ხდება Dmc1-ის შუამავლობით [43,44]. ამიტომ Sae2-ის დაკარგვა ასტაბილურებს DSB-ებს რეზექციამდე, ხოლო Dmc1-ის დაკარგვა ასტაბილურებს DSB-ებს რეზექციის შემდეგ და ძაფების შეჭრამდე. TrAEL-seq მოკვეთილი DSB-ების 3' ბოლოებისთვის შიგნით dmc1Δ უჯრედებმა მეიოზის ინდუქციის შემდეგ 7 საათის შემდეგ გამოავლინეს DSB ნიმუში, რომელიც დაფიქსირდა არარეზეცირებული DSB-ებისთვის sae2Δ მუტანტი შედგენილია S1-seq-ით (BLESS ვარიანტი, სპეციფიკური მეიოტური რეკომბინაციისთვის) (ნახ 1E) ​​[45]. TrAEL-seq ტექნიკური რეპლიკა ძალზედ რეპროდუცირებადია Spo11 გაყოფის ცნობილ ცხელ წერტილებში (R = 0.99) (S1E ნახ) და ამ ცხელ წერტილების რაოდენობრივი რაოდენობა TrAEL-seq კარგად შეესაბამება S1-seq-ს sae2Δ უჯრედები (R = 0.87) (ნახ. 1F, მარცხნივ) და Spo11 ოლიგონუკლეოტიდის თანმიმდევრობა (R = 0.85) (S1F ნახ) [46,47]. 3,907 ცნობილი ცხელ წერტილიდან, TrAEL-seq აღმოაჩენს 3,542-ს ფონზე 2 SD-ის ზღურბლზე დაყრდნობით, რომელიც მდებარეობს S1-seq (2,556) და Spo11 ოლიგონუკლეოტიდის თანმიმდევრობას შორის (ბევრად შრომატევადი მეთოდი, რომელიც ქმნის ოქროს სტანდარტს მეიოტიკისთვის. DSB რუკა, 3,784). TrAEL-seq-ის მგრძნობელობა ძირითადად მსგავსია CC-seq-ის (პროტეინთან ასოცირებული დნმ-ის ბოლოებისთვის სპეციალიზებული მეთოდი [19]), რომელიც იმავე კრიტერიუმებით აღმოაჩენს 3223 ადგილს. ეს აჩვენებს, რომ TrAEL-seq ზუსტად ასახავს და რაოდენობრივად ასახავს ენდოგენურ DSB უბნებს საბოლოო რეზექციის შემდეგაც კი. მნიშვნელოვანია, რომ მეიოზური რეკომბინაცია უჩვეულოა იმით, რომ ცნობილია მუტანტები, რომლებიც სრულად ასტაბილურებენ DSB-ებს, ხოლო სტაბილიზაციის შესვენების შემდგომი რეზექცია ხშირად უფრო პრაქტიკულია სხვა სისტემებში.

მთლიანობაში, TrAEL-seq უზრუნველყოფს ეფექტურ მეთოდს DSB-ების გენომის გამოვლენისა და რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის, თუნდაც საბოლოო რეზექციის შემდეგ.

შეჩერებული რეპლიკაციის ჩანგლების მაღალი გარჩევადობის რუკების შედგენა TrAEL-seq-ით

რეპლიკაციის ჩანგლები ჩერდება დნმ-ის რეპლიკაციის დროს სხვადასხვა დაბრკოლებებზე და შეჩერებულმა ჩანგლებმა შეიძლება განიცადოს შებრუნება ან გახლეჩა, რადგან უჯრედი ცდილობს რეპლიკაციის ხელახლა დაწყებას (ნახ 2A). რეპლიკაციის ჩანგლის ბარიერი (RFB) აყვავებული საფუარის rDNA-ში არის კლასიკური სისტემა რეპლიკაციის ჩანგლის შეჩერების კვლევისთვის და შედეგია რეპლიკაციის ჩანგლებისგან, რომლებიც ხვდებიან დნმ-თან შეკავშირებულ Fob1 ცილას [48]. Fob1 აკავშირებს 35S რიბოსომური რნმ-ის (rRNA) გენის ქვემოთ და ხელს უშლის რეპლიკაციის ჩანგლების გავლას, რომლებიც მოძრაობენ 35S ტრანსკრიფციის მიმართულების საწინააღმდეგოდ, რომელიც სხვაგვარად შეხვდება რნმ პოლიმერაზა I-ს მექანიზმს პირისპირ [49,50]. RFB ინტენსიურად იქნა შესწავლილი, როგორც მოდელი შეჩერებული რეპლიკაციის ჩანგლებისთვის, რომლებიც იწყებენ რეკომბინაციას და გენომის გადაწყობას [51,52], და DSB-ები, რომლებიც ფიქრობდნენ, რომ წარმოიქმნება ჩანგლის გაყოფისგან, მოხსენებული იყო RFB-ზე, როგორც სამხრეთის ბლოტინგზე, ასევე qDSB-seq-ზე დაფუძნებული (BLESS) -ტიპის მეთოდი ორჯაჭვიანი დნმ-ის ბოლოების რუკების შესამოწმებლად) [13,53,54].

(A) შეჩერებული რეპლიკაციის ჩანგლის დამუშავების პოტენციური გზები. ჩამორჩენილი ჯაჭვის დამუშავება, სავარაუდოდ, დამთავრების შემდეგ მალევე დასრულდება და ყოველ შემთხვევაში საფუარის RFB-სთვის ცნობილია, რომ ჩამორჩენილი ჯაჭვის რნმ პრაიმერი ამოღებულია [55]. ჩანგალი შემდეგ შეიძლება გაიაროს ჩანგლის შებრუნება ჰოლიდეის შეერთების გამოსაყვანად, ან დაიჭრა წინა ან ჩამორჩენილ ძაფზე. მაშინ როცა გაყოფა შეუქცევადია და საჭიროებს რეკომბინაციის მოვლენას რეპლიკაციის ჩანგლის ხელახლა დასაწყებად, შებრუნებულ ჩანგლებს შეუძლიათ დაუბრუნდნენ რეპლიკაციის ჩანგლის ნორმალურ სტრუქტურას Holliday Junction მიგრაციით (შეინიშნება HJ მიგრაცია). 3' დნმ-ის ბოლოები, რომლებიც ვარაუდობენ, რომ იქნება TrAEL-seq სუბსტრატები, ეტიკეტირებულია მწვანე წერტილებით. რნმ პრაიმერი ოკაზაკის ფრაგმენტზე ყველაზე მარცხენა სტრუქტურაში ნაჩვენებია წითლად. () საფუარის rDNA RFB სიგნალების შედარება TrAEL-seq მონაცემთა ნაკრებებში qDSB-seq-თან შედარებით (SRA შეერთება: SRX5576747) [13] და GLOE-seq (SRA შეერთებები: SRX6436839 და SRX6436840) [40]. წაკითხვები რაოდენობრივად შეფასდა 1 ნუკლეოტიდურ საფეხურზე და ნორმალიზდა წაკითხვამდე მილიონ რუქაზე. qDSB-seq მონაცემები მიღებული იყო S-ფაზის სინქრონიზებული უჯრედებიდან, ყველა სხვა ნიმუში არის ასინქრონული ლოგ-ფაზის უჯრედების პოპულაციები, რომლებიც იზრდება YPD მედიაში. სქემატური დიაგრამა გვიჩვენებს RFB ელემენტების პოზიციებს, რომლებიც ადრე იყო გამოსახული 2D გელის ელექტროფორეზით [49,50], ხოლო შავი სამკუთხედები მიუთითებენ დნმ-ის ბოლოების ადრე შედგენილ ადგილებზე [53,55]. (C) rDNA TrAEL-seq იკითხება hESC-ებში. ნაჩვენებია ორი ბიოლოგიური რეპლიკა, თითოეული საშუალოდ 2 ტექნიკური რეპლიკა. წაკითხული შეჯამდა 100 bp მოცურულ ფანჯრებში, რომლებიც დაშორებულია ყოველ 10 bp. ნაჩვენებია rDNA-ს ერთი გამეორება, რნმ პოლიმერაზა I-ტრანსკრიბირებული 45S რნმ ნაჩვენებია რუხი ხაზით მომწიფებული rRNA-ებით სქემატურ დიაგრამაზე მწვანედ მონიშნული. გაითვალისწინეთ, რომ 45S გენი ნაჩვენებია, როგორც ტრანსკრიბირებული მარჯვნიდან მარცხნივ, რათა შეინარჩუნოს თანმიმდევრულობა საფუარის მონაცემებთან, ისე, რომ თანმიმდევრობა არის rDNA საცნობარო თანმიმდევრობის საპირისპირო დამატება U13369. R გამეორებები, რომლებიც შეიცავს RFB-ებს, მონიშნულია მწვანედ, ხოლო რეპლიკაციის პირველადი მიმართულება ნაჩვენებია წითელი ისრით, სახელწოდებით "რეპლიკაცია?" გასათვალისწინებელია მტკიცებულება იმისა, რომ ჩანგლებს შეუძლიათ ორივე მიმართულებით მოძრაობა ადამიანის rDNA-ს მეშვეობით. () საშუალო TrAEL-seq პროფილები ცენტრომერებში +/− 1 კბ ველური ტიპის უჯრედების 3 ბიოლოგიური რეპლიკისთვის (დახატული წითელი, ნარინჯისფერი და მეწამული). ცენტრომერები კატეგორიზებულია საფუარის გენომის კრებულში რეპლიკაციის მიმართულებიდან გამომდინარე, მათ შორის, რომლებიც განმეორდება წინ (CEN3, CEN5, CEN13, CEN2), უკუღმა (CEN11, CEN15, CEN10, CEN8, CEN12, CEN9) და ტერმინალურ ზონებში, რომლებიც შეიძლება განმეორდეს. ორივე მიმართულებით (CEN14, CEN16, CEN1, CEN4, CEN7, CEN6), იხილეთ S2C ნახ. წაკითხვის რაოდენობა მილიონ წაკითხვაზე რუკზე გამოთვლილი იყო 10 bp ურნებში გადახურვის გარეშე, ვერტიკალური ხაზები მიუთითებს ცენტრომერების ანოტირებულ საზღვრებზე. () საშუალო TrAEL-seq პროფილები tRNA-ებში +/− 200 bp ველური ტიპის უჯრედების 3 ბიოლოგიური რეპლიკაციისთვის (დახატული წითელი, ნარინჯისფერი და მეწამული). tRNA იყოფა ისეთებად, რომლებშიც ტრანსკრიფცია თანამიმართულია რეპლიკაციის ჩანგლისა და იმათ, რომლებისთვისაც ტრანსკრიფცია მიმდინარეობს რეპლიკაციის ჩანგლის მიმართულებით. tRNA-ები, რომელთა რეპლიკაციის მიმართულება არ არის კარგად განსაზღვრული, გამოირიცხა. ისრები მიუთითებს მწვერვალებზე, რომლებიც დამოკიდებულია რეპლიკაციის მიმართულებაზე. წაკითხვის რაოდენობა მილიონ წაკითხვაზე გამოთვლილ იქნა 5 bp ურნებში გადახურვის გარეშე, ვერტიკალური ხაზები მიუთითებს tRNA-ების ანოტირებულ საზღვრებს. ამ ფიგურის საფუძველში არსებული რიცხვითი მონაცემები შეგიძლიათ იხილოთ S2 Data-ში. hESC, ადამიანის ემბრიონის ღეროვანი უჯრედის RFB, რეპლიკაციის ჩანგლის ბარიერის rRNA, რიბოსომური რნმ TrAEL-seq, ტრანსფერაზა-აქტივირებული ბოლო ლიგაციის თანმიმდევრობა.

RFB-ზე გაჩერებული რეპლიკაციის ჩანგლების გამოსავლენად და ამ სახეობების გარჩევადობაში ჰომოლოგიური რეკომბინაციის მოთხოვნის შესამოწმებლად, ჩვენ მოვამზადეთ TrAEL-seq ბიბლიოთეკები არასინქრონიზებული ველური ტიპისგან, fob1Δ, და rad52Δ უჯრედები, რომლებიც იზრდება შუა ლოგ ფაზაში: fob1Δ უჯრედებს არ აქვთ RFB აქტივობა, ხოლო rad52Δ მუტანტებს არ შეუძლიათ ჰომოლოგიური რეკომბინაციის დაწყება. ამიტომ RFB სიგნალები არ უნდა იყოს fob1Δ, ხოლო სიგნალები, რომლებიც წარმოადგენენ DSB-ებს, რომლებიც წარმოიქმნება ჩანგლის გაყოფით, უნდა დაგროვდეს შიგნით rad52Δ, რადგან ამ მუტანტს არ შეუძლია აღადგინოს ასეთი დნმ-ის რღვევები ჩამოყალიბების შემდეგ.

ორი RFB ადგილი აშკარად ჩანს ველური ტიპის TrAEL-seq მონაცემებში, როგორც საპირისპირო სტრიქონის წაკითხვის პიკები, მაგრამ ისინი არ არიან fob1Δ მუტანტი (ნახ 2B, ველური ტიპი და fob1Δ პანელები). ეს მწვერვალები ზუსტად რეპროდუცირებულია 2 ბიბლიოთეკას შორის, რომლებიც მომზადებულია ერთი და იგივე ფიქსირებული უჯრედებისგან დამოუკიდებლად (სხვადასხვა მკვლევარის მიერ, რომლებიც მუშაობენ 6 თვის ინტერვალით, S2A Fig) და გამოვლენილია მაღალი სიგნალის ხმაურამდე 3 ველური ტიპის ბიოლოგიურ რეპლიკაში (S2B Fig). ეს საიტები კარგად შეესაბამება RFB საიტებს, რომლებიც შედგენილია მაღალი რეზოლუციის გელების გამოყენებით [53,55] და ასევე ჩანს გამოქვეყნებულ qDSB-seq და GLOE-seq მონაცემთა ნაკრებებში, თუმცა TrAEL-seq მონაცემები შეიცავს ნაკლებ დამატებით პიკებს ამ რეგიონში, ვიდრე GLOE-seq. მონაცემები და RFB მწვერვალები უფრო მჭიდროდ შეესაბამება ცნობილ ადგილებს, ვიდრე qDSB-seq მწვერვალები (ნახ 2B) [13,40].

ძუძუმწოვრების უჯრედებისთვის TrAEL-seq-ის გამოყენებადობის დასადგენად, ჩვენ შევქმენით 2 TrAEL-seq მონაცემთა ნაკრები 0,5 მილიონი ადამიანის ემბრიონული ღეროვანი უჯრედის 2 ბიოლოგიური რეპლიკირებული ბიბლიოთეკიდან (hESCs). ძირითადი პიკი დაფიქსირდა rDNA-ში რნმ პოლიმერაზა I-ის შეწყვეტის ადგილის ქვემოთ ორივე hESC ბიოლოგიურ რეპლიკაში, საპირისპირო ჯაჭვზე, რომელიც მდებარეობს ყველაზე დისტალურ RFB უბნებზე (ნახ 2C) [56]. ეს დაკვირვება შეესაბამება ეფექტურ პოლარულ RFB-ს, რომელიც მდებარეობს რნმ პოლიმერაზა I-ის ტრანსკრიფციის ერთეულის ქვემოთ, როგორც ჩანს მრავალფეროვან სახეობებში, მცენარეებიდან საფუარიდან თაგვებამდე [49,57-60]. გარდა ამისა, ჩვენ აღმოვაჩენთ პატარა, მაგრამ გამეორებად მწვერვალებს ორივე ჯაჭვზე სამივე RFB უბანზე, რაც შეესაბამება დაბალი ეფექტურობის ორმხრივი RFB აქტივობას, რომელიც დაფიქსირდა ადამიანის უჯრედებში 2D გელებისა და დნმ-ის კომბინირების საფუძველზე (ნახ 2C) [56,61,62] .

rDNA RFB არ არის ერთადერთი ადგილი, სადაც რეპლიკაციის ჩანგლები ჩერდება, მაგალითად, მოხსენებული GLOE-seq მწვერვალები საფუარის ცენტრომერებზე, სავარაუდოდ, გამოწვეულია რეპლიკაციის ჩანგლებიდან, რომლებიც გაჩერებულია ცენტრომერულ ქრომატინზე [40,63]. ამ ურთიერთობის შესამოწმებლად, ჩვენ ჯერ დავაფიქსირეთ ცენტრომერები, რომლებიც მრავლდება მხოლოდ საპირისპირო ჩანგლებით, და ისინი განლაგებულია ტერმინალურ ზონებში, სადაც ჩანგლები იყრის თავს (S2C ნახ.). მხოლოდ ერთი მიმართულებით გამრავლებულ ცენტრომერებზე, ჩვენ დავაკვირდით კითხვის დაგროვებას რეპლიკაციის მიმართულების საპირისპირო მიმართულებაზე, რომელიც მდებარეობს ცენტრომერის წინ, ხოლო ჩანგლები ტერმინალურ ზონებში, რომლებიც შეიძლება გამრავლდეს ორივე მიმართულებით, აჩვენებდნენ ორივე პიკს (ნახ. 2D და S1 ფაილი ). tRNA ლოკების ანალოგიურმა ანალიზმა, რომელიც ასევე ცნობილია, რომ აჩერებს რეპლიკაციის ჩანგლებს [64], გამოიღო უფრო რთული ნიმუშები (ნახ 2E).ეს რეგიონები აჩვენებდნენ მწვერვალებს tRNA-ს ზემოთ ან ქვემოთ რეპლიკაციის მიმართულებიდან გამომდინარე (ნახ 2E, ისრები), წინა კვლევებთან შესაბამისობაში, სადაც ნათქვამია, რომ ორივე მიმართულების და თავდაპირველი tRNA ტრანსკრიფციას შეუძლია შეაჩეროს რეპლიკაციის ჩანგლები, ყოველ შემთხვევაში, რეპლიკაციური ჰელიკაზების არარსებობის შემთხვევაში. [64–67]. თუმცა, ჩვენ ასევე დავაფიქსირეთ ძირითადი პიკი, რომელიც მოიცავს tRNA გენის პირველ დაახლოებით 15 bp-ს, რომელიც გავლენას არ ახდენდა რეპლიკაციის მიმართულებაზე და, როგორც ჩანს, აღნიშნავს ტრანსკრიპციასთან ასოცირებულ წყვეტას შაბლონის ჯაჭვზე, რომელიც უნდა იყოს tRNA ტრანსკრიპციის შენარჩუნებული მახასიათებელი. ასევე აღმოჩენილია hESC ნიმუშებში (S2D ნახ). ამას გარდა, ჩვენ აღმოვაჩენთ, რომ რეპლიკაციის ჩანგლის ადგილები, რომლებიც გაჩერებულია როგორც RFB-ზე, ასევე სხვა უბნებზე, ვლინდება TrAEL-seq წაკითხვის დაგროვებით რეპლიკაციის მიმართულების საპირისპირო ძაფზე.

ჩანგლის დამუშავების შედეგად მიღებულ სტრუქტურებს აქვთ სხვადასხვა ორჯაჭვიანი 3' ბოლოები, რომლებიც უნდა იყოს სუბსტრატები TrAEL-seq-ისთვის ჩვენი შეზღუდვის ფერმენტის ანალიზის საფუძველზე (ნახ. 1C და 2A, მწვანე წერტილები). თუმცა, სიგნალის ინტენსივობაში განსხვავება არ დაფიქსირებულა rad52Δ და ველური ტიპი rDNA-ზე, ცენტრომერებზე ან tRNA-ზე, რაც აჩვენებს, რომ ეს ორჯაჭვიანი ბოლოები ჩვეულებრივ არ მუშავდება ჰომოლოგიური რეკომბინაციის აპარატით (ნახ. 2B, S2E და S2F ნახ). ცნობილია, რომ rDNA-ში წარმოქმნილი DSB-ები აღდგენილია ჰომოლოგიური რეკომბინაციით, და მიუხედავად იმისა, რომ ჩვენ და სხვებმა აღვნიშნეთ Rad52-დამოუკიდებელი რეკომბინაცია rDNA-ზე, ეს იშვიათი მოვლენებია, რომლებიც უცნობია ველური ტიპის უჯრედებში [68-70]. თუ TrAEL-seq მწვერვალები წარმოადგენენ ჩანგლის გაყოფის მოვლენებს, ჩვენ მოველით ძლიერ სტაბილიზაციას rad52Δ მუტანტი. ამრიგად, დაფიქსირებული სტაბილიზაციის ნაკლებობიდან გამომდინარე, მიგვაჩნია, რომ დნმ-ის აბსოლუტური უმრავლესობა მთავრდება რეპლიკაციის ჩანგლის გაჩერების ადგილებში, წარმოადგენს შებრუნებულ ჩანგლებს, რომლებსაც შეუძლიათ დაუბრუნდნენ რეპლიკაციის ჩანგლის ნორმალურ სტრუქტურებს Holliday Junction-ის მიგრაციით, რეკომბინაციის გარეშე (იხ. ნახაზი 2A და განხილვა).

ერთად აღებული, ეს შედეგები აჩვენებს, რომ TrAEL-seq საშუალებას იძლევა რეპლიკაციის ჩანგლის შეჩერების მგრძნობიარე და ზუსტი რუკების შედგენა, სავარაუდოდ, შებრუნებული რეპლიკაციის ჩანგლების მარკირების გზით.

TrAEL-seq პროფილები აღწერს რეპლიკაციის ჩანგლის მიმართულებას

საფუარის TrAEL-seq მონაცემების თვალსაჩინო თვისებაა გენომის სხვადასხვა ადგილას წაკითხვის ძაფების მიკერძოების მასიური ცვალებადობა: 1 კბ ურნებში შებრუნებული წაკითხვის ფრაქციის ვიოლინო დიაგრამა აჩვენებს 2 განსხვავებულ პიკს 15%-დან 30%-მდე და 70. %-დან 85%-მდე, ქცევა გაცილებით ნაკლებად აშკარაა შესადარებელ GLOE-seq მონაცემებში (ნახ 3A) [40]. TrAEL-seq წაკითხვის პოლარობა ასინქრონულ ველური ტიპის უჯრედებში (გამოითვლება უკუ და წინ წაკითხული სიმკვრივის სხვაობიდან) ქმნის მკაფიო დომენებს დიდ გენომიურ რეგიონებზე გამოსახულებისას, რომლებიც თითქმის სრულყოფილად ემთხვევა ოკაზაკის ფრაგმენტის GLOE-seq რუკას, რომელიც მთავრდება Cdc9 დნმ ლიგაზაში. ამოწურვის ექსპერიმენტი, თუმცა საპირისპირო პოლარობით (ნახ 3B და S3A ნახ) [40]. ოკაზაკის ფრაგმენტების ბოლოების რუქა კარგად დადასტურებული მეთოდია რეპლიკაციის ჩანგლების გამოსავლენად [35,36] და TrAEL-seq მონაცემების მჭიდრო კორელაცია ოკაზაკის ფრაგმენტების განაწილებასთან მტკიცედ ვარაუდობს, რომ TrAEL-seq აღმოაჩენს პროცესურ რეპლიკაციის ჩანგლებს ველური ტიპის უჯრედებშიც კი. . მართლაც, ადგილები, რომლებზეც TrAEL-seq პოლარობა იცვლება უარყოფითიდან პოზიტიურზე, ზუსტად ემთხვევა რეპლიკაციის საწყისებს (ავტონომიურად განმეორებადი თანმიმდევრობა ან ARS ელემენტები) (ნახ. 3B, წერტილოვანი ვერტიკალური ხაზები) და TrAEL-seq-ის გასწორება იკითხება 30 kb-ის ორივე მხარეს. ყველა ARS ელემენტი ავლენს პოლარობის შეცვლას, როგორც მოსალოდნელია რეპლიკაციის ჩანგალებისთვის, რომლებიც განსხვავდება რეპლიკაციის საწყისიდან (ნახ 3C). გარდა ამისა, TrAEL-seq წაკითხვები rDNA-ში ასახავს Fob1-ის ცნობილ როლს rDNA-ს ცალმხრივი რეპლიკაციის განხორციელებაში, რადგან წაკითხვები ძალზე პოლარიზებულია ველური ტიპის უჯრედებში, მაგრამ ეს პოლარიზაცია არ არის fob1Δ (S3B ნახ).

(A) TrAEL-seq და GLOE-seq წაკითხვის პოლარობა შეფასებული 1 კბ ფანჯრებში გენომის მასშტაბით, ფანჯრების გამოკლებით, რომლებიც გადახურულია მრავალკოპიური რეგიონებით, წარმოდგენილი, როგორც მთლიანი წაკითხულის პროცენტი ამ რუკაზე საპირისპირო ზოლზე. წერტილოვანი ხაზი აღნიშნავს 50%-ს, რაც უდრის ძაფების მიკერძოების არარსებობას. TrAEL-seq ბიბლიოთეკები არის BY4741 ველური ტიპის 3 ბიოლოგიური რეპლიკა. GLOE-seq ველური ტიპის ნიმუშები (SRA შეერთებები: SRX6436839 და SRX6436840) მიღებული იყო YPD-ში მზარდი ასინქრონული ლოგ-ფაზის უჯრედებიდან, ისევე როგორც TrAEL-seq ნიმუშები. The cdc9 მონაცემთა ნაკრები არის სინქრონიზებული უჯრედები, რომლებიც ამოწურულია დნმ ლიგაზას Cdc9-ით (SRA შეერთება: SRX6436838). () წაიკითხეთ პოლარობის დიაგრამები TrAEL-seq BY4741 ველური ტიპისთვის, რომელიც იზრდება ლოგ ფაზაში YPD და GLOE-seq Cdc9 ამოწურვის მონაცემებზე (SRA შეერთება: SRX6436838) V ქრომოსომაზე, გამოითვლება როგორც (R−F)/(R+F), სადაც R და F მიუთითებს უკან და წინ წაკითხულს, შესაბამისად. TrAEL-seq მონაცემები არის საშუალოდ 2 ტექნიკური გამეორება. წაკითხვის პოლარობა გამოითვლებოდა 1000 bp მოცურების ფანჯრებისთვის, რომლებიც დაშორებულია ყოველ 100 bp-ზე, ყველა ერთი ასლი რეგიონის ხარვეზებისთვის 450 kb-თან ახლოს და 500 kb არის Ty ელემენტები. ვერტიკალური წერტილოვანი ხაზები აჩვენებს ARS ელემენტების ადგილმდებარეობას. გაითვალისწინეთ, რომ წაკითხული პოლარობის ღერძი cdc9 მონაცემები ინვერსიულია მარტივი შედარებისთვის TrAEL-seq-თან, როგორც cdc9 მუტაცია ამდიდრებს ჩამორჩენილ ძაფზე 3' ბოლოებს, ხოლო TrAEL-seq აღმოაჩენს წამყვანი ჯაჭვის 3' ბოლოს. (C) TrAEL-seq და GLOE-seq მონაცემთა ნაკრების საშუალო წაკითხვის პოლარობა 30 კბ ფანჯრებში ანოტირებული ARS ელემენტების ორივე მხარეს. გამოითვლება, როგორც საპირისპირო წაკითხვის %tage ყველა წაკითხულს შორის. ნიმუშები არის როგორც . () აბსოლუტური TrAEL-seq წაკითხვის სიღრმე წაკითხვებში მილიონ რუქაზე, წაკითხვის პოლარობის მიუხედავად, იგივე ნიმუშისთვის ნაჩვენები . წაკითხვის სიღრმე ფართოდ ერთგვაროვანია ერთი ეგზემპლარის გენომში, გარდა პიკისა ცენტრომერზე (როგორც ნახაზი 2D-ში) და დაბლა ყოველ აქტიურ ARS-ზე. () TrAEL-seq სიგნალები ველური ტიპის უჯრედებში შეჩერებულია G1-ში (ზედა) ან გამოშვებულია S-ში (ქვედა). წაკითხვის რაოდენობა მილიონ წაკითხვაზე გამოთვლილი იყო 1000 bp მოცურების ფანჯრებისთვის, რომლებიც დაშორებულია ყოველ 100 bp-ზე ყველა ერთი ასლი რეგიონისთვის, და სტრიქონები ნაჩვენებია ცალკე, რათა გამოავლინოს როგორც წაკითხვის აბსოლუტური რაოდენობა, ასევე წაკითხული პოლარობა თითოეულ წერტილში - წაკითხული პოლარობის განაწილება ქრომოსომაზე S-ფაზის უჯრედებისთვის არის ნახ 3B-ის ექვივალენტური. წაკითხვის რაოდენობის შედარების მიზნით 2 ნიმუშს შორის, G1 და G1->S ნიმუშები მიბმული იყო TrAEL ადაპტერ 1 ვარიანტზე, რომელიც ატარებდა 2 სხვადასხვა შტრიხკოდს. ეს ნიმუშები შემდეგ იყო გაერთიანებული, დამუშავებული და თანმიმდევრობით, რათა შეენარჩუნებინათ წაკითხვის შედარებითი რაოდენობა ნიმუშებს შორის, და ნორმალიზება თითოეული ნიმუშისთვის იყო წაკითხვის საერთო რაოდენობაზე, რომელიც გამოსახული იყო ორივე ბიბლიოთეკაში. იმის უზრუნველსაყოფად, რომ სხვადასხვა ადაპტერის შტრიხკოდებმა გავლენა არ მოახდინოს შედეგზე, შესრულდა 2 ტექნიკური გამეორება G1 და G1->S-ის თითოეული დაწყვილებული ნიმუშისთვის, შტრიხკოდის გადამყვანებით შებრუნებული. ნაჩვენები მონაცემები ტექნიკური რეპლიკების საშუალოა, მაგრამ მცირე განსხვავება დაფიქსირდა ბიბლიოთეკის შედარებით რაოდენობრივ განსაზღვრაში, რაც შეიძლება მიეკუთვნებოდეს შტრიხკოდირებას. ექსპერიმენტისთვის ორი ბიოლოგიური რეპლიკა ნაჩვენებია წითელ და ლურჯ ფერებში. () წაკითხვის პოლარობის სიძლიერე და განმეორებადობა TrAEL-seq და GLOE-seq მონაცემთა ნაკრებებს შორის. წაკითხვის პოლარობა გამოითვლებოდა 1000 bp ფანჯრებში, რომლებიც დაშორებულია ყოველ 1000 bp და ნაჩვენებია უწყვეტი ხაზების სახით. სამი ბიოლოგიური რეპლიკაციის მონაცემთა ნაკრები ველური ტიპის TrAEL-seq-ისთვის არის გამოსახული ზედა დიაგრამაზე და აჩვენებს იგივე რეპლიკაციის პროფილებს. ორი ველური ტიპის GLOE-seq მონაცემთა ნაკრები გადაფარებულია ქვედა გრაფიკზე (SRA შეერთებები: SRX6436839 და SRX6436840). TrAEL-seq და GLOE-seq მონაცემთა ნაკრები ყველა გამომდინარეობს ასინქრონული კულტურებიდან, რომლებიც აღებულია YPD-ში ლოგ-ფაზის ზრდის დროს [40]. ვერტიკალური წერტილოვანი ხაზები აჩვენებს ARS ელემენტების ადგილმდებარეობას. () წაიკითხეთ პოლარობის დიაგრამა, როგორც აქ BY4741 ველური ტიპის TrAEL-seq მონაცემთა ნაკრების 2 ბიოლოგიური რეპლიკისთვის RNase H2 მუტანტებთან შედარებით rnh201Δ და rnh202Δ და ტოპოიზომერაზა I მუტანტს top1Δ. () წაიკითხეთ TrAEL-seq მონაცემების პოლარობის დიაგრამები ასინქრონული ველური ტიპის hESC-ებისთვის, ნაჩვენებია 2 ბიოლოგიური რეპლიკა, თითოეულში საშუალოდ 2 ტექნიკური რეპლიკა. შედარებისთვის ნაჩვენებია LIG1-ით დაცლილი HCT116 უჯრედების GLOE-seq მონაცემები (SRA შეერთების საშუალო: SRX7704535 და SRX7704534). წაკითხვის პოლარობა გამოითვლებოდა 250 კბ მოცურულ ფანჯრებში, რომლებიც დაშორებულია ყოველ 10 კბ-ში. გაითვალისწინეთ, რომ HCT116 მონაცემების პოლარობა შებრუნებულია, რათა დაეხმაროს შედარებას TrAEL-seq ნიმუშებთან, რაც ხაზგასმულია წითლად მონიშნული შკალით. პროფილები ძირითადად მსგავსია უჯრედების 2 ტიპს შორის, მაგრამ ზოგიერთი წარმოშობა აქტიურია მხოლოდ hESC-ებში, მაგალითები მითითებულია მწვანე ისრებით. ამ ფიგურის საფუძველში არსებული რიცხვითი მონაცემები შეგიძლიათ იხილოთ S3 Data-ში. ARS, ავტონომიურად რეპლიკაციური თანმიმდევრობა hESC, ადამიანის ემბრიონის ღეროვანი უჯრედი TrAEL-seq, ტრანსფერაზა-აქტივირებული ბოლო ლიგაციის თანმიმდევრობა.

აბსოლუტური TrAEL-seq წაკითხვის სიმკვრივე დიდწილად ერთგვაროვანია ერთი ეგზემპლარის გენომში, გარდა გამოხატული ჩავარდნებისა თითოეულ ARS-ზე (ნახ 3D), რაც ვარაუდობს, რომ TrAEL-seq სიგნალები ძირითადად მიღებულია აქტიური რეპლიკაციის ჩანგლებიდან მცირე ხმაურით. თუ ასეა, მაშინ TrAEL-seq სიგნალები უნდა განსხვავდებოდეს უჯრედულ ციკლში. თუმცა, როგორც სხვა თანმიმდევრობის მეთოდების შემთხვევაში, მთლიანი TrAEL-seq სიგნალის რაოდენობრივი შედარება ბიბლიოთეკებს შორის არ არის მარტივი, რადგან არ არსებობს კავშირი ბიბლიოთეკაში წაკითხვის მთლიან რაოდენობასა და ორიგინალურ ნიმუშში სუბსტრატის რაოდენობას შორის. ასეთი შედარებების დასაშვებად, ჩვენ შევცვალეთ TrAEL-seq მილსადენი ისე, რომ 2 ნიმუში ადრეულ ეტაპზე შტრიხკოდირებულია და შემდეგ გაერთიანებულია დამუშავებისთვის, თანმიმდევრობით და შემდგომი დამუშავებისთვის, როგორც ერთი ნიმუში. ეს მიდგომა ინარჩუნებს სუბსტრატის აბსოლუტურ თანაფარდობას 2 ნიმუშს შორის, რაც იძლევა რაოდენობრივი შედარების საშუალებას.

ჩვენ გამოვიყენეთ ეს მეთოდი, რათა შევადაროთ G1-ში დაპატიმრებული უჯრედები α-ფაქტორის გამოყენებით იმავე კულტურის უჯრედებს S-ფაზაში გაშვების შემდეგ. TrAEL-seq ადაპტერი 1-ის ორი ვარიანტი უნიკალური შტრიხკოდებით იყო მიბმული G1 და G1->S ნიმუშებზე, რომლებიც შემდეგ გაერთიანდა და თითოეულ ექსპერიმენტში, ჩვენ ვასრულებდით 2 ტექნიკურ რეპლიკას შტრიხკოდების გაცვლით, რათა უზრუნველვყოთ რაოდენობრივი განსხვავებები არ გამოჩენილიყო ადაპტერებიდან. საკუთარ თავს. ორმა ბიოლოგიურმა რეპლიკატორმა ექსპერიმენტმა არსებითად იდენტური შედეგი გამოიღო, სადაც TrAEL-seq წაკითხვის რაოდენობა ერთი ასლის რეგიონებში მკვეთრად მაღალია G1->S ნიმუშებში, ვიდრე G1-დაკავებულ ნიმუშებში. წაკითხვის აბსოლუტური რაოდენობისა და ძაფების მიკერძოების საილუსტრაციოდ, ჩვენ დავხატეთ წაკითხვის რაოდენობა წინა და საპირისპირო ძაფებზე ცალ-ცალკე V ქრომოსომის გასწვრივ (ნახ 3E) S-ფაზის ნიმუშები აჩვენებს ძლიერ სიგნალებს, რომელიც ფაზაშია წინა და საპირისპირო წაკითხვებს შორის ქრომოსომის გასწვრივ, ხოლო სიგნალები G1-დან. უჯრედები თითქმის შეუმჩნეველია. გარდა ამისა, წინსა და უკუს შორის ფაზირება ემთხვევა არასინქრონიზებული ნიმუშების წაკითხული პოლარობის ვარიაციებს (შეადარეთ ნახ 3B და 3E). ეს ექსპერიმენტი აჩვენებს, რომ TrAEL-seq სიგნალები ძირითადად წარმოიქმნება აქტიური დნმ-ის რეპლიკაციის ჩანგლებიდან და ძალიან დაბალია არარეპლიკაციურ უჯრედებში.

წაკითხვის პოლარობის ფაზირება ასევე დაფიქსირდა ველური ტიპის ნიმუშებში, რომლებიც პროფილირებულია GLOE-seq-ით, მაგრამ მხოლოდ სუსტად, მაშინ როდესაც TrAEL-seq ბიბლიოთეკები აჩვენებენ ძალიან ძლიერ წაკითხვის პოლარობის განსხვავებებს, რომლებიც ძალიან რეპროდუცირებადია და იძლევა არსებითად იდენტურ რეპლიკაციის პროფილებს (ნახ 3A და 3E, S3C ნახ. ) [40]. როგორც Sriramachandran-მა და კოლეგებმა აღნიშნეს GLOE-seq-ისთვის [40], ამ რეპლიკაციის სიგნალის წაკითხული პოლარობა საპირისპიროა იმისგან, რაც მოსალოდნელია 3' ბოლოების ეტიკეტირებისგან ნორმალურ ჩანგლებში. ჩამორჩენილ ძაფზე არასოდეს არ უნდა იყოს ნაკლები 3' ბოლოები, ვიდრე წინა ძაფები, თუმცა TrAEL-seq-ის წაკითხვის 90%-მდე გამოდის წინა ძაფიდან. GLOE-seq სიგნალის ასახსნელად, Sriramachandran-მა და კოლეგებმა შესთავაზეს, რომ GLOE-seq ეტიკეტირება მოახდინოს იმ ადგილებზე, რომლებზეც დნმ იჭრება არასწორად ჩართული რიბონუკლეოტიდების მოცილებისას [40]. ამ იდეის შესამოწმებლად, ჩვენ შევქმენით TrAEL-seq ბიბლიოთეკები rnh201Δ და rnh202Δ მუტანტები, რომლებსაც არ გააჩნიათ RNase H2-ის ძირითადი კომპონენტები, მთავარი ფერმენტი, რომელიც არღვევს დნმ-ს არასწორად ინკორპორირებულ რიბონუკლეოტიდებს, ველური ტიპის კონტროლთან ერთად [71,72]. გასაოცარია, რომ წაკითხული პოლარობა ამ მუტანტებში ექვივალენტურია ველური ტიპის, რაც აჩვენებს, რომ TrAEL-seq წაკითხვის წამყვანი ჯაჭვის მიკერძოება არ არის გამოწვეული RNase H2-ით და, შესაბამისად, ნაკლებად სავარაუდოა, რომ წარმოიქმნება არასწორად ჩართული რიბონუკლეოტიდების ამოკვეთის შედეგად (ნახ 3G და S3D ნახ). ასევე შესაძლებელია, რომ TrAEL-seq (და მართლაც GLOE-seq) სიგნალები წარმოიქმნება, როდესაც რეპლიკაციის მანქანა ხვდება Top1 დაშლის კომპლექსებს [73], მაგრამ ჩვენ არ ვნახეთ TrAEL-seq პოლარობის ან სიგნალის შემცირება. top1Δ უჯრედები (ნახ 3G და S3D Fig). კიდევ ერთი დაკვირვება ამ კუთხით არის ის, რომ END-seq მონაცემები აჩვენებს პოლარობის მიკერძოებას, თუმცა სუსტი, რომელიც პარალელურად ახასიათებს პოლარობის მიკერძოებას იმავე უჯრედებიდან გამომუშავებულ TrAEL-seq მონაცემებში (S3E ნახ.). ეს მიუთითებს იმაზე, რომ ორჯაჭვიანი ბოლოები ასევე წარმოიქმნება ნორმალური რეპლიკაციის დროს, თუმცა ეს სუსტი სიგნალები ასევე შეიძლება წარმოიშვას რეპლიკაციის ჩანგლების დელიკატური ერთჯაჭვიანი უბნების დაშლის შედეგად დამუშავების დროს.

შემდეგ ჩვენ ვკითხეთ, შეიმჩნევა თუ არა ეკვივალენტური მიმართულება hESC ბიბლიოთეკებში. ამ ბიბლიოთეკებში წაკითხვის შეზღუდული გაშუქება საშუალებას აძლევდა მხოლოდ წაკითხვის პოლარობის განსაზღვრას 250 კბ ფანჯრებში, მაგრამ მიუხედავად ამისა, გასაოცარი ვარიაცია დაფიქსირდა გენომში (ნახ 3H). მნიშვნელოვანია, რომ ეს პროფილები ძალიან ჰგავდა ტექნიკურ და ბიოლოგიურ რეპლიკებს შორის და, შესაბამისად, არ შეიძლება წარმოიქმნას უბრალოდ ხმაურის შედეგად, ეს შეიძლება შეინიშნოს განსაზღვრულ გენომიურ რეგიონებში, მაგრამ ასევე ნათელია გაფანტულ ნახაზში, რომელიც აჩვენებს, რომ საშუალო წაკითხვის პოლარობა თითოეულ ფანჯარაში კორელაციაშია მონაცემთა ნაკრებებს შორის ( R = 0.84, S3F და S3G ნახ). გარდა ამისა, GLOE-seq შედეგებთან შედარებამ LIG1-ით დაქვეითებული ადამიანის უჯრედული ხაზი, რომელიც დეფექტურია ოკაზაკის ფრაგმენტის ლიგირებაში, კვლავ გამოავლინა გასაოცარი მსგავსება hESC TrAEL-seq მონაცემებთან, თუმცა საპირისპირო პოლარობით (ნახ 3H და S3H ნახ) [40. ]. საინტერესოა, რომ წარმოშობის ქვეჯგუფი რეპროდუცირებად იქნა აღმოჩენილი hESC ნიმუშებში, მაგრამ არ იყო HCT116 მონაცემებში, რაც შეესაბამება მტკიცებულებას, რომ საწყისი გამოყენება განსხვავდება ამ უჯრედულ ხაზებს შორის (ნახ. 3H, მწვანე ისრები) [24].

აქედან გამომდინარე, ჩვენ დავასკვნით, რომ TrAEL-seq ძირითადად ამოიცნობს პროცესურ რეპლიკაციის ჩანგლებს და ამას აკეთებს განსაკუთრებით მაღალი სიგნალის ხმაურამდე. TrAEL-seq პროფილები ძალიან რეპროდუცირებადია და მათი მიღება შესაძლებელია ველური ტიპის უჯრედებიდან უჯრედების სინქრონიზაციის, დახარისხების ან ეტიკეტირების საჭიროების გარეშე. TrAEL-seq-ის მიერ აღმოჩენილი 3' ბოლოები შეესაბამება წინა და არა ჩამორჩენილ ძაფს, მიუხედავად იმისა, რომ კიდევ ბევრი 3' ბოლო ჩნდება ჩამორჩენილ ძაფზე, და ჩვენ ვარაუდობთ, რომ ეს 3' ბოლოები გამოაშკარავდეს რეპლიკაციის ჩანგლის შებრუნებით. in vivo ან ნიმუშის დამუშავების დროს (იხ. განხილვა).

გარემოზე ზემოქმედება რეპლიკაციის დროზე და ჩანგლის პროგრესირებაზე

და ბოლოს, ჩვენ ვკითხეთ, შეუძლია თუ არა TrAEL-seq-ს გამოავლინოს რეპლიკაციის ცვლილებები ან დნმ-ის დაზიანება, და კერძოდ, შეგვიძლია თუ არა გამოვავლინოთ შეჯახება ტრანსკრიფციისა და რეპლიკაციის მექანიზმებს შორის.

ვინაიდან ამ მომენტამდე გენერირებული საფუარის ყველა ბიბლიოთეკა იძლევა დნმ-ის რეპლიკაციის არსებითად იდენტურ პროფილებს rDNA-ს გარეთ, ჩვენ პირველ რიგში გვინდოდა დაგვერწმუნებინა, რომ რეპლიკაციის პროფილის ცვლილებები მართლაც შესამჩნევი იყო. ამიტომ ჩვენ გამოვიკვლიეთ უჯრედები, რომლებსაც აკლიათ Clb5, საფუარის ციკლინი B, რომელიც მთავარ როლს თამაშობს გვიან სროლის რეპლიკაციის ჩანგლების გააქტიურებაში [74]. TrAEL-seq პროფილი clb5Δ ძალიან ჰგავდა ველურ ტიპს გენომის უმეტეს ნაწილში, მაგრამ გარკვეული წარმომავლობა აშკარად არ იყო ან ძლიერად იყო რეპრესირებული, რის შედეგადაც დნმ-ის სინთეზის გაფართოებული ტრაქტები მიმდებარე საწყისებიდან ჩანს, როგორც ძალიან განსხვავებული პოლარობის რეგიონები (ნახ. 4A, მწვანე ისრები, S4A ნახ.) . ეს არის როგორც იწინასწარმეტყველა clb5Δ მუტანტები და ადასტურებს, რომ TrAEL-seq ნამდვილად მგრძნობიარეა რეპლიკაციის პროფილის ცვლილებების მიმართ.


Უყურე ვიდეოს: დნმ-ის რეპლიკაცია (აგვისტო 2022).