ინფორმაცია

გელის ელექტროფორეზის ოპტიმიზაცია: ამპერი, ვოლტი და ბუფერის კონცენტრაციები

გელის ელექტროფორეზის ოპტიმიზაცია: ამპერი, ვოლტი და ბუფერის კონცენტრაციები



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ვარ ბიოქიმიის მაგისტრატურის სტუდენტი, გელის ელექტროფორეზი ადრეც არაერთხელ გამომიყენებია. რაც მინდა ვიცოდე არის ის, თუ როგორ უნდა დაარეგულიროთ mA (mAmpere) ძაბვასთან და ბუფერთან შედარებით.

ჩვეულებრივ მე ვიყენებდი 1xTAE ბუფერს (90V-ზე მუშაობს) ან 1x ნატრიუმის ბორატ ბუფერს (იმუშავებს 110V-ზე). ვიცი, რომ ძაბვას თუ დავარეგულირებ, ბუფერი უფრო სწრაფად თბება, ნიმუშები უფრო სწრაფად მოძრაობენ, მაგრამ გელის „სურათი“ უფრო ბუნდოვანი ხდება. თუმცა ეს ყველაფერია რაც ვიცი პარამეტრის კორექტირების შესახებ.

ასე რომ, ჩემი კითხვები შეიძლება შეჯამდეს შემდეგნაირად:

  1. როგორ დავარეგულირო ამპერი, არის თუ არა დიაპაზონი მე უნდა ვიყო იმ ბუფერთან ან ნიმუშთან შედარებით, რომელსაც ვატარებ?

  2. ახდენს თუ არა ამპერი გავლენას მოგზაურობის სიჩქარეზე, თუ რეგულირდება ზემოთ ან ქვემოთ?

  3. შემიძლია თუ არა ბუფერის კონცენტრაციის დარეგულირება ნიმუშის უფრო მაღალ ძაბვაზე გასაშვებად, რა ეფექტი ექნება ამას (კონცენტრაციის გაზრდა ან შემცირება)?

  4. არის თუ არა კავშირი ამპერსა და ძაბვას შორის, რომლითაც შემიძლია მანიპულირება, ამ შემთხვევაში: როგორ და რატომ?


  1. რამდენადაც მე ვიცი, თქვენ შეგიძლიათ დაარეგულიროთ ამპერი ან ძაბვა, რადგან ორივე დამოკიდებულია ბუფერის წინააღმდეგობაზე. რაც იმას ნიშნავს, რომ მე გირჩევთ დატოვოთ ძაბვა ისე, როგორც არის.

  2. როგორც ამპერი = ძაბვა / წინააღმდეგობა და ძაბვა = წინააღმდეგობა * ამპერი და როგორც ხედავთ, რომ ძაბვა უნდა გაიზარდოს, თუ ამპერი გაიზარდა და ამპერი უნდა გაიზარდოს, თუ ძაბვა გაიზარდა (ყოველ შემთხვევაში, თუ სწორად მესმის ) მოძრაობის სიჩქარე უნდა გაიზარდოს რაც უფრო მაღალია ამპერი დაყენებული.

  3. ბუფერის კონცენტრაციას არც დავაკლებ და არც გავზრდი. შესაძლოა სხვა სახის ბუფერის მარტივად გამოყენება დაგეხმაროს. მაგრამ ეს დამოკიდებულია სხვადასხვა ნიმუშებზე, რომლებსაც თქვენ აწარმოებთ. შესაძლოა, ეს დაგეხმაროს: ბროდი, ჯ.რ. და კერნი, ს.ე. (2004). გამტარ მედიის ისტორია და პრინციპები სტანდარტული დნმ ელექტროფორეზისთვის. ანალიტიკური ბიოქიმია 333, 1-13.

  4. წინააღმდეგობა მეტ-ნაკლებად არის მოცემული. ამიტომ რამდენადაც ვიცი: არა.


აგაროზა და მეტაფორა გელები

1. დაამატეთ აგაროზა 1X TBE (ან TAE) ბუფერს. გელის ზომა 20 x 24 სმ, გამოიყენეთ 300-400 მლ ბუფერი და 0,7-დან 1,0%-მდე აგაროზა.
2. დნება აგაროზა 500 მლ კოლბაში მიკროტალღურ ღუმელში, გაცხელებისას რამდენჯერმე აურიეთ. გააცივეთ 55 C-მდე (სანამ კოლბა არ შეინახება).
3. გელის უჯრის ბოლოები დააწებეთ და მოათავსეთ დონის სკამზე.
4. დაამატეთ ეთიდიუმის ბრომიდი: 2,5 მლ 10 მგ/მლ მარაგი 100 მლ-ზე. (ელექტროფორეზის შემდეგ გელის კამერა ასევე შეიღებება ეთიდიუმის ბრომიდის აბაზანაში (იხ. პუნქტი 9).

შენიშვნა: ეთიდიუმის ბრომიდი მუტაგენურია - ატარეთ ხელთათმანები დამუშავებისას და გამოიჩინეთ განსაკუთრებული სიფრთხილე. შეცვალეთ ხელთათმანები დაბინძურებისას და გადაყარეთ ცალკეულ ნარჩენებში ეთიდიუმ ბრომიდისთვის.

5. ჩაასხით უჯრაში აგაროზა და ჩადეთ სავარცხლები. ამოიღეთ ბუშტები პიპეტის წვერით. მიეცით საშუალება გამაგრდეს.
6. ამოიღეთ ლენტი და მოათავსეთ უჯრა გელის ყუთებში. ჩაასხით იმდენი 1X TBE (ან TAE) ბუფერი გელის ყუთში, რომ გელი დაფაროს მინიმუმ 0,5 სმ-ით. ამოიღეთ სავარცხლები ნიმუშების ჩასატვირთად.
7. ჩატვირთეთ 1 მკგ ლამბდა მონელებული Hind III-ით (5 მლ 200 ნგ/ულლ მარაგი), როგორც მოლეკულური წონის მარკერი, შემდეგ ჩატვირთეთ ნიმუშები.
8. იმოძრავეთ 15-25 ვ-ზე 12-24 საათის განმავლობაში.
9. თუ აგაროზას არ დაემატა ეთიდიუმის ბრომიდი: შეღებეთ გელი 1 მკგ/მლ ეთიდიუმის ბრომიდში (100 მლ 10 მგ/მლ ეთიდიუმის ბრომიდი 1000 მლ dd H2O) 20 წუთის განმავლობაში. 10. ჩამოიბანეთ გელი 20 წუთის განმავლობაში 1000 მლ ddH2O-ში.
11. გადაიტანეთ გელი ულტრაიისფერ ტრანსილუმინატორზე და გადაიღეთ ფოტო.
ფოტო გადაღების რჩევა:
მოათავსეთ ქაღალდის პატარა ნაჭერი წერილობით ან გამჭვირვალე სახაზავებით გელზე, რათა დაგეხმაროთ.

MetaPhor® Agarose
მაღალი გარჩევადობის აგაროზა
შესავალი
MetaPhor agarose არის მაღალი გარჩევადობის აგაროზა, რომელიც ებრძვის პოლიაკრილამიდს. MetaPhor agarose არის შუალედური დნობის ტემპერატურა (75°C) აგაროზა, ორჯერ აღემატება საუკეთესო გაცრილი აგაროზის პროდუქტებს. წყალქვეშა გელის ელექტროფორეზის გამოყენებით, შეგიძლიათ ამოხსნათ PCR პროდუქტები და დნმ-ის მცირე ფრაგმენტები, რომლებიც განსხვავდება ზომით 2% -ით.

ანალიტიკური სპეციფიკაციები
გელის ტემპერატურა (3%) = 35°C
დნობის ტემპერატურა (3%) = 75°C
გელის სიძლიერე (3%) = 300 გ/სმ²
აპლიკაციები
• 20-800 bp დნმ-ის ფრაგმენტების მაღალი გარჩევადობის გამოყოფა
• ფრაგმენტების აღდგენა 800 bp ქვემოთ
• PCR-ის დახვეწილი ანალიზი? პროდუქტები
• AMPFLP, STR და ტრი- და ტეტრანუკლეოტიდის განმეორებითი ანალიზი

შემოთავაზებული აგაროზის კონცენტრაციები

ორჯაჭვიანი დნმ-ის მიგრაცია ბრომფენოლ ლურჯთან (BPB) და ქსილენ ციანოლთან (XC) მიმართებაში MetaPhor აგაროზის გელებში.

Სიფრთხილის ზომები
ყოველთვის ატარეთ თვალის დამცავი დამცავი აგაროზის დაშლისას და დაიცავით თავი და სხვები მდუღარე ხსნარებისგან.

მიკროტალღური ინსტრუქციები აგაროზის მომზადებისთვის
1. შეარჩიეთ ჭიქა, რომელიც 2-4-ჯერ აღემატება ხსნარის მოცულობას.
2. დაამატეთ გაცივებული 1X ან 0.5X ელექტროფორეზის ბუფერი და მორევის ზოლი ჭიქაში.
3. ნელა დაასხით აგაროზის ფხვნილი, სანამ ხსნარი სწრაფად აურიეთ.
4. ამოიღეთ მორევის ზოლი, თუ არ არის დაფარული Teflon®.
5. გაცხელებამდე 15 წუთით გააცხელეთ აგაროზა ბუფერში. ეს ამცირებს აგაროზის ხსნარის ქაფის ტენდენციას გაცხელების დროს.
6. გაცხელებამდე აწონეთ ჭიქა და ხსნარი.
7. დააფარეთ ჭიქა პოლიეთილენის საფარით.
8. პლასტმასის შესაფუთს გაუკეთეთ პატარა ხვრელი ვენტილაციისთვის.

აგაროზის კონცენტრაციისთვის > 4%, შემდეგი დამატებითი ნაბიჯები ხელს შეუწყობს აგაროზის ხსნარის ქაფების თავიდან აცილებას დნობის/დაშლის დროს:
ა. გააცხელეთ ჭიქა მიკროტალღურ ღუმელში საშუალო სიძლიერეზე 1 წუთის განმავლობაში.
ბ. ამოიღეთ ხსნარი მიკროტალღური ღუმელიდან.
გ. მიეცით ხსნარი სკამზე 15 წუთის განმავლობაში.

9. გააცხელეთ ჭიქა მიკროტალღურ ღუმელში საშუალო სიმძლავრეზე 2 წუთის განმავლობაში.
10. ამოიღეთ ჭიქა მიკროტალღური ღუმელიდან. სიფრთხილე: ნებისმიერი მიკროტალღოვანი
ხსნარი შეიძლება ზედმეტად გაცხელდეს და აფუვდეს აჟიტირებისას.
11. ნაზად ატრიალეთ ჭიქა, რათა ხელახლა შეაჩეროთ ნებისმიერი დასახლებული ფხვნილისა და გელის ნაჭრები.
12. ხელახლა გააცხელეთ ჭიქა მაღალ სიმძლავრეზე, სანამ ხსნარი ადუღდება.
13. გააჩერეთ დუღილის ტემპერატურაზე 1 წუთის განმავლობაში ან სანამ ყველა ნაწილაკი არ დაიშლება.
14. ამოიღეთ ჭიქა მიკროტალღური ღუმელიდან.
15. ნაზად აურიეთ ჭიქა, რომ კარგად შეურიოთ აგაროზის ხსნარი.
16. დაშლის შემდეგ დაამატეთ საკმარისი ცხელი გამოხდილი წყალი საწყისი წონის მისაღებად.
17. საფუძვლიანად აურიეთ.
18. ჩამოსხმის წინ ხსნარი გააგრილეთ 50-60°C-მდე. მას შემდეგ, რაც გელის ჩამოსხმის შემდეგ, ნება დართეთ გამდნარი აგაროზა გაცივდეს და გელი ოთახის ტემპერატურაზე. ამის შემდეგ გელი უნდა განთავსდეს 4°C ტემპერატურაზე 20 წუთის განმავლობაში ოპტიმალური გარჩევადობისა და გელის გამოყენების მახასიათებლების მისაღებად.

ცხელი ფირფიტის ინსტრუქციები აგაროზის მომზადებისთვის
1 . შეარჩიეთ ჭიქა, რომელიც 2-4-ჯერ აღემატება ხსნარის მოცულობას.
2. დაამატეთ გაცივებული ელექტროფორეზის ბუფერი და მორევის ზოლი ჭიქაში.
3. ნელა დაასხით აგაროზის ფხვნილი, სანამ ხსნარი სწრაფად აურიეთ.
4. გაცხელებამდე აწონეთ ჭიქა და ხსნარი.
5. დააფარეთ ჭიქა პოლიეთილენის საფარით.
6. პლასტმასის შესაფუთს გაუკეთეთ პატარა ხვრელი ვენტილაციისთვის.
7. ხსნარი მორევისას მიიყვანეთ ადუღებამდე.
8. შეინარჩუნეთ ადუღება, სანამ მთელი აგაროზა არ დაიშლება (დაახლოებით 10 წუთი).
9. დაამატეთ საკმარისი ცხელი გამოხდილი წყალი საწყისი წონის მისაღებად.
10. საფუძვლიანად აურიეთ.
11 . ჩამოსხმის წინ ხსნარი გააგრილეთ 50-60°C-მდე. მას შემდეგ, რაც გელის ჩამოსხმის შემდეგ, ნება დართეთ გამდნარი აგაროზა გაცივდეს და გელი ოთახის ტემპერატურაზე. ამის შემდეგ გელი უნდა განთავსდეს 4°C ტემპერატურაზე 20 წუთის განმავლობაში ოპტიმალური გარჩევადობისა და გელის გამოყენების მახასიათებლების მისაღებად.


როგორ მუშაობს PFGE?

PFGE მომდინარეობს დაკვირვებით, რომ დნმ-ის მოლეკულები ელექტრული ველის გამოყენებისას გრძელდება და ელექტრული ველის ამოღებისთანავე უბრუნდება გაუგრძელებელ მდგომარეობას, ეს რელაქსაციის სიჩქარე დამოკიდებულია დნმ-ის ზომაზე.

როდესაც ელექტროფორეზის დროს იცვლება ელექტრული ველის ორიენტაცია, დნმ-ის მოლეკულები უნდა დაუბრუნდნენ წაგრძელებულ ფორმას რეორიენტაციამდე, რითაც იმოქმედებს მიგრაციის სიჩქარეზე. ეს ეფექტი შეიძლება გამოყენებულ იქნას ზომის დიაპაზონის გასაფართოვებლად, რომლებზეც შესაძლებელია ელექტროფორეზული დნმ-ის გამოყოფა.

როდესაც ელექტრული ველი გამოიყენება გელზე, დნმ-ის მოლეკულები ვრცელდება ელექტრული ველის მიმართულებით. პირველი ელექტრული ველი შემდეგ გადადის მეორე ველზე გაშვების სპეციფიკაციების მიხედვით. დნმ-მა უნდა შეცვალოს კონფორმაცია და გადააკეთოს ორიენტაცია, სანამ ამ ველის მიმართულებით გადაადგილდება.

სანამ ალტერნატიული ველები ტოლია ძაბვისა და პულსის ხანგრძლივობის მიმართ, დნმ გადავა სწორი გზით გელის ქვემოთ (იხ. ქვემოთ).

დნმ-ის მოლეკულების დროითი წარმოდგენა, რომლებიც განიცდიან PFGE-ს.


შინაარსი

რამდენიმე ფაქტორმა შეიძლება გავლენა მოახდინოს ნუკლეინის მჟავების მიგრაციაზე: გელის ფორების განზომილება, გამოყენებული ძაბვა, ბუფერის იონური სიძლიერე და კონცენტრაციის შემაერთებელი საღებავი, როგორიცაა ეთიდიუმის ბრომიდი, თუ გამოიყენება ელექტროფორეზის დროს. [2]

დნმ-ის ზომა რედაქტირება

გელი ანაწილებს დნმ-ს დნმ-ის მოლეკულის ზომით, რითაც პატარა მოლეკულები უფრო სწრაფად მოძრაობენ. ორჯაჭვიანი დნმ მოძრაობს ისეთი სიჩქარით, რომელიც დაახლოებით უკუპროპორციულია ბაზის წყვილთა რაოდენობის ლოგარითმთან. თუმცა, ეს ურთიერთობა იშლება დნმ-ის ძალიან დიდი ფრაგმენტებით და შეუძლებელია მათი გამოყოფა სტანდარტული აგაროზის გელის ელექტროფორეზის გამოყენებით. გარჩევადობის ზღვარი დამოკიდებულია გელის შემადგენლობაზე და ველის სიძლიერეზე. [3] და უფრო დიდი წრიული დნმ-ის მობილურობაზე შეიძლება უფრო ძლიერი გავლენა იქონიოს გელის პორების ზომამ, ვიდრე ხაზოვან დნმ-ზე. [4] ძალიან დიდი დნმ-ის ფრაგმენტების განცალკევებისთვის საჭიროა პულსური ველის გელის ელექტროფორეზი (PFGE). საველე ინვერსიული გელის ელექტროფორეზის დროს (FIGE, ერთგვარი PFGE) შესაძლებელია იყოს "ზოლის ინვერსია" - სადაც დიდი მოლეკულები შეიძლება მოძრაობდნენ უფრო სწრაფად, ვიდრე მცირე მოლეკულები.

დნმ-ის კონფორმაცია რედაქტირება

დნმ-ის მოლეკულის კონფორმაციამ შეიძლება მნიშვნელოვნად იმოქმედოს დნმ-ის მოძრაობაზე, მაგალითად, ზეგადახვეული დნმ ჩვეულებრივ უფრო სწრაფად მოძრაობს ვიდრე მოდუნებული დნმ, რადგან ის მჭიდროდ არის დახვეული და, შესაბამისად, უფრო კომპაქტური. ჩვეულებრივი პლაზმიდური დნმ-ის მომზადებაში შეიძლება არსებობდეს დნმ-ის მრავალი ფორმა [5] და პლაზმიდების ელექტროფორეზის გელი ჩვეულებრივ აჩვენებს მთავარ ზოლს, რომელიც იქნება უარყოფითად ზეგადახვეული ფორმა, ხოლო დნმ-ის სხვა ფორმები შეიძლება გამოჩნდეს როგორც ოდნავ სუსტი. ბენდები. ეს მცირე ზოლები შეიძლება იყოს დნმ-ის (ღია წრიული ფორმა) და მოდუნებული დახურული წრიული ფორმა, რომელიც ჩვეულებრივ უფრო ნელა მუშაობს ვიდრე ზეხვეული დნმ, და ერთჯაჭვიანი ფორმა (რომელიც ზოგჯერ შეიძლება გამოჩნდეს მომზადების მეთოდებზე დაყრდნობით) შეიძლება გადავიდეს ზემოხვეული დნმ-ზე წინ. . თუმცა, სხვადასხვა ფორმის მოძრაობის სიჩქარე შეიძლება შეიცვალოს სხვადასხვა ელექტროფორეზის პირობების გამოყენებით, მაგალითად, წრფივი დნმ შეიძლება იმუშაოს უფრო სწრაფად ან ნელა, ვიდრე ზემოხვეული დნმ-ის პირობებიდან გამომდინარე, [6] და უფრო დიდი წრიული დნმ-ის მობილურობა შეიძლება უფრო ძლიერი იყოს, ვიდრე ხაზოვანი დნმ. გელის ფორების ზომით. [4] გარდა იმ შემთხვევისა, როდესაც ზეგადახვეული დნმ-ის მარკერები არ გამოიყენება, პლაზმიდის მსგავსი წრიული დნმ-ის ზომა შეიძლება უფრო ზუსტად შეფასდეს მას შემდეგ, რაც იგი ხაზოვანი გახდება შეზღუდვის დამუშავებით.

დნმ-ის დაზიანება გაზრდილი ჯვარედინი კავშირის გამო ასევე შეამცირებს ელექტროფორეზულ დნმ-ის მიგრაციას დოზადამოკიდებული გზით. [7] [8]

ეთიდიუმის ბრომიდის კონცენტრაცია რედაქტირება

წრიულ დნმ-ზე უფრო ძლიერად მოქმედებს ეთიდიუმის ბრომიდის კონცენტრაცია, ვიდრე ხაზოვანი დნმ, თუ ეთიდიუმის ბრომიდი იმყოფება გელში ელექტროფორეზის დროს. ყველა ბუნებრივად არსებული დნმ-ის წრე ქვემოდან არის შემოჭრილი, მაგრამ ეთიდიუმის ბრომიდს, რომელიც ერწყმის წრიულ დნმ-ს, შეუძლია შეცვალოს დნმ-ის მოლეკულის მუხტი, სიგრძე და სუპერელექტურობა, ამიტომ ელექტროფორეზის დროს მისმა არსებობამ შეიძლება გავლენა მოახდინოს მის მოძრაობაზე გელში. დნმ-ში ინტერკალირებული ეთიდიუმის ბრომიდის გაზრდამ შეიძლება შეცვალოს იგი უარყოფითად ზეგადახვეული მოლეკულიდან სრულად მოდუნებულ ფორმაში, შემდეგ კი დადებითად დახვეულ სუპერსპირალში მაქსიმალური ინტერკალაციის დროს. [9] აგაროზას გელის ელექტროფორეზი შეიძლება გამოყენებულ იქნას წრიული დნმ-ის გადასაჭრელად სხვადასხვა ზეგადახვევის ტოპოლოგიით.

გელის კონცენტრაცია რედაქტირება

გელის კონცენტრაცია განსაზღვრავს გელის ფორების ზომას, რომელიც გავლენას ახდენს დნმ-ის მიგრაციაზე. დნმ-ის გარჩევადობა იცვლება გელის პროცენტული კონცენტრაციით. გელის აგაროზის კონცენტრაციის გაზრდა ამცირებს მიგრაციის სიჩქარეს და აუმჯობესებს დნმ-ის მცირე მოლეკულების განცალკევებას, ხოლო გელის კონცენტრაციის დაქვეითება იძლევა დიდი დნმ-ის მოლეკულების გამოყოფის საშუალებას. სტანდარტული აგაროზის გელის ელექტროფორეზისთვის, 0.7% იძლევა კარგ განცალკევებას ან გარჩევადობას დიდი 5-10 კბ დნმ-ის ფრაგმენტებისთვის, ხოლო 2% გელი იძლევა კარგ გარჩევადობას მცირე 0.2-1 კბ ფრაგმენტებისთვის. 3%-მდე შეიძლება გამოყენებულ იქნას ძალიან პატარა ფრაგმენტების გასაყოფად, მაგრამ ვერტიკალური პოლიაკრილამიდის გელი უფრო შესაფერისი იქნება მცირე ფრაგმენტების მოსახსნელად. მაღალი კონცენტრაციის გელი, თუმცა მოითხოვს უფრო ხანგრძლივ მუშაობის პერიოდს (ზოგჯერ დღეებს) და მაღალი პროცენტული გელები ხშირად მყიფეა და შეიძლება თანაბრად არ დადგეს. მაღალი პროცენტული აგაროზის გელები უნდა იყოს გამოყენებული PFGE ან FIGE-ით. დაბალი პროცენტული გელები (0.1−0.2%) მყიფეა და შეიძლება გატყდეს. 1% გელები გავრცელებულია მრავალი გამოყენებისთვის. [10]

გამოყენებული ველი რედაქტირება

დაბალი ძაბვის დროს დნმ-ის მიგრაციის სიჩქარე გამოყენებული ძაბვის პროპორციულია, ანუ რაც უფრო მაღალია ძაბვა, მით უფრო სწრაფად მოძრაობს დნმ. თუმცა, ელექტრული ველის სიძლიერის გაზრდისას, მაღალი მოლეკულური წონის დნმ-ის ფრაგმენტების მობილურობა დიფერენციალურად იზრდება და განცალკევების ეფექტური დიაპაზონი მცირდება და, შესაბამისად, გარჩევადობა დაბალია მაღალი ძაბვის დროს. 2 კბ-ზე მეტი ზომის დნმ-ის ოპტიმალური გარჩევადობისთვის სტანდარტული გელის ელექტროფორეზის დროს რეკომენდებულია 5-დან 8 ვ/სმ-მდე. [6] ძაბვა ასევე შეზღუდულია იმით, რომ ის ათბობს გელს და შეიძლება გამოიწვიოს გელის დნობა, თუ გელი მაღალ ძაბვაზე მუშაობენ ხანგრძლივი პერიოდის განმავლობაში, განსაკუთრებით დაბალი დნობის წერტილის აგაროზის გელის შემთხვევაში.

თუმცა, დნმ-ის მობილურობა შეიძლება შეიცვალოს არასტაბილურ ველში. ველში, რომელიც პერიოდულად იცვლება, კონკრეტული ზომის დნმ-ის მობილურობა შეიძლება მნიშვნელოვნად შემცირდეს კონკრეტული ველოსიპედის სიხშირით. [11] ამ ფენომენმა შეიძლება გამოიწვიოს ზოლის ინვერსია, რომლის დროსაც უფრო დიდი დნმ-ის ფრაგმენტები უფრო სწრაფად მოძრაობენ, ვიდრე პატარაები PFGE-ში.

მისი ფოსფატის ხერხემლის უარყოფითი მუხტი ელექტროფორეზის დროს დნმ-ს დადებითად დამუხტული ანოდისკენ მოძრაობს. თუმცა, დნმ-ის მოლეკულების მიგრაცია ხსნარში, გელის მატრიცის არარსებობის შემთხვევაში, დამოუკიდებელია მოლეკულური წონისგან ელექტროფორეზის დროს, ანუ არ ხდება ზომით გამოყოფა გელის მატრიცის გარეშე. [12] ჰიდროდინამიკური ურთიერთქმედება დნმ-ის სხვადასხვა ნაწილებს შორის წყდება ნაკადის კონტრაიონებით, რომლებიც მოძრაობენ საპირისპირო მიმართულებით, ამიტომ არ არსებობს მექანიზმი, რომელიც წარმოქმნის სიჩქარის დამოკიდებულებას სიგრძეზე სკრინინგის სიგრძეზე 10 ნმ-ზე მეტი მასშტაბით. [11] ეს განასხვავებს მას სხვა პროცესებისგან, როგორიცაა დანალექი ან დიფუზია, სადაც მნიშვნელოვანია გრძელვადიანი ჰიდროდინამიკური ურთიერთქმედება.

ამიტომ გელის მატრიცა პასუხისმგებელია ელექტროფორეზის დროს დნმ-ის ზომის მიხედვით განცალკევებაზე, თუმცა ზუსტი მექანიზმი, რომელიც პასუხისმგებელია განცალკევებაზე, ბოლომდე არ არის ნათელი. გელის მატრიცაში ბიომოლეკულების გამოყოფის მექანიზმის მრავალი მოდელი არსებობს, ფართოდ მიღებულია ოგსტონის მოდელი, რომელიც პოლიმერულ მატრიქსს განიხილავს, როგორც საცერს, რომელიც შედგება შემთხვევით განაწილებული ურთიერთდაკავშირებული ფორების ქსელისგან. [13] გლობულური ცილა ან შემთხვევითი ხვეული დნმ მოძრაობს დაკავშირებულ ფორებში საკმარისად დიდი, რათა მოერგოს მის გავლას და უფრო დიდი მოლეკულების მოძრაობა შეფერხდება და შენელდება გელის მატრიცასთან და სხვადასხვა მოლეკულებთან შეჯახებით. ამდენად, ზომები შეიძლება განცალკევდეს გაცრის ამ პროცესში. [11]

თუმცა, ოგსტონის მოდელი იშლება დიდი მოლეკულებისთვის, რის გამოც ფორები მოლეკულის ზომაზე მნიშვნელოვნად მცირეა. 1 კბ-ზე მეტი ზომის დნმ-ის მოლეკულებისთვის ყველაზე ხშირად გამოიყენება რეპტაციის მოდელი (ან მისი ვარიანტები). ეს მოდელი ვარაუდობს, რომ დნმ-ს შეუძლია "გველივით" (აქედან "რეპტაცია") ფორების მეშვეობით მოგრძო მოლეკულის სახით დაცოცვა. უფრო მაღალი ელექტრული ველის სიძლიერის შემთხვევაში, ეს გადაიქცევა მიკერძოებულ რეპტაციის მოდელად, რომლის დროსაც მოლეკულის წამყვანი ბოლო ძლიერად მიკერძოებულია წინა მიმართულებით და ეს წინა კიდე მიიზიდავს მოლეკულის დანარჩენ ნაწილს. სრულად მიკერძოებულ რეჟიმში, მობილურობამ მიაღწია გაჯერების წერტილს და დნმ-ს გარკვეული ზომის მიღმა გამოყოფა შეუძლებელია. [13] ჯაჭვის სრულყოფილი პარალელური გასწორება ველთან, თუმცა პრაქტიკაში არ შეინიშნება, რადგან ეს ნიშნავს იგივე მობილურობას გრძელი და მოკლე მოლეკულებისთვის. [11] მიკერძოებული რეპტაციის მოდელის შემდგომი დახვეწა ჯაჭვის შიდა რყევებს ითვალისწინებს. [14]

მიკერძოებული რეპტაციის მოდელი ასევე გამოყენებულია PFGE-ში დნმ-ის მობილობის ასახსნელად. დნმ-ის ორიენტაცია თანდათანობით ყალიბდება რეპტაციით ველის გაჩენის შემდეგ და დრო, როდესაც ის მიაღწია მუდმივ სიჩქარეს, დამოკიდებულია მოლეკულის ზომაზე. როდესაც ველი იცვლება, უფრო დიდ მოლეკულებს უფრო მეტი დრო სჭირდება გადაადგილებისთვის, ამიტომ შესაძლებელია განვასხვავოთ გრძელი ჯაჭვები, რომლებიც ვერ მიაღწევენ თავის სტაბილურ მდგომარეობას სიჩქარეს მოკლე ჯაჭვებისგან, რომლებიც უმეტეს დროს მოძრაობენ სტაბილური სიჩქარით. [14] თუმცა, სხვა მოდელებიც არსებობს.

შეღებილი მოლეკულების რეალურ დროში ფლუორესცენციულმა მიკროსკოპამ აჩვენა უფრო დახვეწილი დინამიკა ელექტროფორეზის დროს, დნმ აჩვენებდა მნიშვნელოვან ელასტიურობას, რადგან ის მონაცვლეობით იჭიმება გამოყენებული ველის მიმართულებით და შემდეგ იკუმშება ბურთში, ან ხდება U- ფორმის მიჯაჭვულობა, როდესაც ის იღებს. დაიჭირეს პოლიმერულ ბოჭკოებზე. [15] [16] ამ დაკვირვებას შეიძლება ეწოდოს „ქიაყელის“ მოდელი. [17] სხვა მოდელი ვარაუდობს, რომ დნმ ერევა პოლიმერულ მატრიქსთან და რაც უფრო დიდია მოლეკულა, მით უფრო დიდია მისი ჩახლართული და მოძრაობის შეფერხება. [18]

ყველაზე გავრცელებული საღებავი, რომელიც გამოიყენება დნმ-ის ან რნმ-ის ზოლების დასანახად აგაროზის გელის ელექტროფორეზისთვის, არის ეთიდიუმის ბრომიდი, ჩვეულებრივ შემოკლებით EtBr. ის ფლუორესცირდება ულტრაიისფერი შუქის ქვეშ, როდესაც შედის დნმ-ის (ან რნმ) მთავარ ღარში. დნმ-ის გაშვებით EtBr-თ დამუშავებული გელის მეშვეობით და მისი ვიზუალიზაცია ულტრაიისფერი შუქით, ნებისმიერი ზოლი, რომელიც შეიცავს

20 ნგ დნმ აშკარად ჩანს. EtBr არის ცნობილი მუტაგენი, [19] და ხელმისაწვდომია უფრო უსაფრთხო ალტერნატივები, როგორიცაა GelRed, წარმოებული Biotium-ის მიერ, რომელიც აკავშირებს მცირე ღარს. [20]

SYBR Green I არის კიდევ ერთი dsDNA ლაქა, რომელიც წარმოებულია Invitrogen-ის მიერ. ის უფრო ძვირია, მაგრამ 25-ჯერ უფრო მგრძნობიარე და, შესაძლოა, უფრო უსაფრთხო ვიდრე EtBr, თუმცა არ არსებობს მონაცემები ადამიანებში მის მუტაგენურობასა და ტოქსიკურობაზე. [21]

SYBR Safe არის SYBR Green-ის ვარიანტი, რომელსაც დადასტურებული აქვს მუტაგენურობისა და ტოქსიკურობის საკმარისად დაბალი დონე, რათა ჩაითვალოს არასახიფათო ნარჩენად აშშ-ს ფედერალური რეგულაციების მიხედვით. [22] მას აქვს მსგავსი მგრძნობელობის დონე EtBr-სთან, [22] მაგრამ, ისევე როგორც SYBR Green, მნიშვნელოვნად უფრო ძვირია. თუმცა, იმ ქვეყნებში, სადაც საშიში ნარჩენების უსაფრთხო განადგურება სავალდებულოა, EtBr-ის განკარგვის ხარჯებმა შეიძლება ადვილად გადააჭარბოს საწყისი ფასის სხვაობას.

ვინაიდან EtBr შეღებილი დნმ არ ჩანს ბუნებრივ შუქზე, მეცნიერები დნმ-ს ურევენ უარყოფითად დამუხტულს ბუფერების ჩატვირთვა ნარევის გელში დამატებამდე. ჩატვირთვის ბუფერები სასარგებლოა, რადგან ისინი ხილულია ბუნებრივ შუქზე (განსხვავებით ულტრაიისფერი შუქისგან EtBr შეღებილი დნმ-ისთვის) და ისინი დნმ-თან ერთად დალექილდებიან (რაც ნიშნავს, რომ ისინი მოძრაობენ იმავე სიჩქარით, როგორც გარკვეული სიგრძის დნმ). Xylene cyanol და Bromophenol blue არის ჩვეულებრივი საღებავები, რომლებიც გვხვდება ჩატვირთვის ბუფერებში, ისინი მუშაობენ დაახლოებით იგივე სიჩქარით, როგორც დნმ-ის ფრაგმენტები, რომლებიც არიან 5000 bp და 300 bp სიგრძით, შესაბამისად, მაგრამ ზუსტი პოზიცია განსხვავდება გელის პროცენტული მაჩვენებლის მიხედვით. სხვა ნაკლებად ხშირად გამოყენებული პროგრესის მარკერებია Cresol Red და Orange G, რომლებიც მუშაობენ დაახლოებით 125 bp და 50 bp, შესაბამისად.

ვიზუალიზაცია ასევე შეიძლება მიღწეული იქნას SDS-PAGE-ის შემდეგ დნმ-ის გადატანით ნიტროცელულოზის მემბრანაზე, რასაც მოჰყვება ჰიბრიდიზაციის ზონდი. ამ პროცესს სამხრეთის ბლოტი ეწოდება.

ფლუორესცენტური საღებავებისთვის, ელექტროფორეზის შემდეგ გელი ანათებს ულტრაიისფერი ნათურას (ჩვეულებრივ, ნათურ ყუთზე მოთავსებით, ხოლო დამცავი ხელსაწყოს გამოყენებით ულტრაიისფერი გამოსხივების ზემოქმედების შეზღუდვის მიზნით). ილუმინატორის აპარატი ძირითადად ასევე შეიცავს ვიზუალიზაციის აპარატს, რომელიც იღებს გელის სურათს ულტრაიისფერი გამოსხივებით განათების შემდეგ. ეთიდიუმის ბრომიდი დნმ-ის თანდასწრებით მოწითალო-ნარინჯისფერი ფლუორესციით ხდება, რადგან ის დნმ-თან ურთიერთქმედებს. დნმ-ის ზოლი ასევე შეიძლება ამოიჭრას გელისგან და შემდეგ დაიშალა გაწმენდილი დნმ-ის მოსაპოვებლად. გელის გადაღება შესაძლებელია ჩვეულებრივ ციფრული ან პოლაროიდის კამერით. მიუხედავად იმისა, რომ შეღებილი ნუკლეინის მჟავა ფლუორესციებს მოწითალო-ნარინჯისფერს, გამოსახულებები ჩვეულებრივ ნაჩვენებია შავ-თეთრად (იხ. ნახატები). დნმ-ის ნიმუშის UV დაზიანებამ შეიძლება შეამციროს ნიმუშის შემდგომი მანიპულირების ეფექტურობა, როგორიცაა ლიგირება და კლონირება. მოკლე ტალღის სიგრძის ულტრაიისფერი გამოსხივება (302 ან 312 ნმ) იწვევს უფრო დიდ ზიანს, მაგალითად, 45 წამის ზემოქმედებას შეუძლია მნიშვნელოვნად შეამციროს ტრანსფორმაციის ეფექტურობა. ამიტომ, თუ დნმ უნდა იქნას გამოყენებული ქვედა დინების პროცედურებისთვის, უფრო მოკლე ტალღის სიგრძის ულტრაიისფერი გამოსხივების ზემოქმედება უნდა იყოს შეზღუდული, ნაცვლად უფრო მაღალი ტალღის სიგრძის UV გამოსხივება (365 ნმ), რომელიც ნაკლებ ზიანს აყენებს, უნდა იქნას გამოყენებული. თუმცა უფრო მაღალი ტალღის სიგრძის გამოსხივება წარმოქმნის სუსტ ფლუორესცენციას, ამიტომ, თუ საჭიროა გელის გამოსახულების გადაღება, მოკლე ტალღის სიგრძის ულტრაიისფერი შუქი შეიძლება გამოყენებულ იქნას მოკლე დროში. ციტიდინის ან გუანოზინის დამატება ელექტროფორეზის ბუფერში 1 მმ კონცენტრაციით შეიძლება დაიცვას დნმ დაზიანებისგან. [23] ალტერნატიულად, შეიძლება გამოყენებულ იქნას ცისფერი სინათლის აგზნების წყარო ლურჯად აგზნებადი ლაქით, როგორიცაა SYBR Green ან GelGreen.

გელის ელექტროფორეზის კვლევა ხშირად იყენებს პროგრამული უზრუნველყოფის გამოსახულების ანალიზის ხელსაწყოებს, როგორიცაა ImageJ.


ელექტროფორეზის საფუძვლები

ელექტროფორეზი გულისხმობს დამუხტული მოლეკულების მიგრაციას თხევადი ან გელის საშუალებით ელექტრული ველის გავლენის ქვეშ. ზონის ელექტროფორეზი, ანუ მაკრომოლ-ეკულების მიგრაცია ფოროვანი საყრდენი საშუალების ან გელის მეშვეობით, დღეს თითქმის უნივერსალურად გამოიყენება მოლეკულური ბიოლოგიის ლაბორატორიებში. ელექტროფორეზი (ამ თავში ყველა განხილვა მოიცავს ზონის ელექტროფორეზს, მაგრამ მოკლედ მოიხსენიება როგორც ელექტროფორეზი) არის მძლავრი განცალკევების საშუალება, რომელსაც შეუძლია აღმოაჩინოს მაკრომოლეკულების დიფერენციალური მიგრაცია მხოლოდ სუსტად განსხვავებული სტრუქტურით. გამოყენებული ორი ფორმატია ფილის გელის ელექტროფორეზი, რომელშიც ელექტროფორეზი ხდება დამხმარე გარემოში, აგაროზაში ან პოლიაკრილამიდში და კაპილარული ელექტროფორეზი (CE), ინსტრუმენტული ტექნიკა, რომელშიც ელექტროფორეზი ხდება კაპილარულ მილში.

მაკრომოლეკულის მიგრაციის სიჩქარე გელის მატრიცაში დამოკიდებულია რამდენიმე ფაქტორზე, მათ შორის (1) მოლეკულაზე წმინდა მუხტზე pH-ზე, რომელზეც ტარდება ანალიზი, (2) მოლეკულის ზომა და ფორმა, (3). ) ელექტრული ველის სიძლიერე ან ძაბვის ვარდნა, (4) გელის ფორების ზომა და (5) ტემპერატურა. ძალები, რომლებიც მოქმედებენ ანალიტზე, რათა გაატარონ იგი გელის მეშვეობით, არის მოლეკულის მუხტი და ელექტრული ველის სიძლიერე. განტოლება

(1) აღწერს ელექტროფორეზულ მამოძრავებელ ძალას (ცხრილი 1).

ძალები, რომლებიც მოქმედებენ მოლეკულის მოძრაობის შეფერხებაზე, არის ხახუნის ძალები, რომლებიც განისაზღვრება ანა-ლიტის სიჩქარით, გელის ფორების ზომით და მოლეკულის ზომითა და ფორმით. ხახუნის ძალებით ანალიზის აჩქარების წინააღმდეგობა აღწერილია სტოქსის კანონით, როგორც ნაჩვენებია განტოლებაში.

(2) (ცხრილი 1). როდესაც ელექტროფორეზული მამოძრავებელი ძალა უდრის ხახუნის ძალას (F = F), შედეგი არის ანალიზის მოლეკულის მუდმივი სიჩქარე გელის მატრიცაში [Eq. (2), ცხრილი 1]. ტერმინი viX აღწერს ანალიზის სიჩქარეს გელის მატრიცის გავლით (cms) ველის სიძლიერის ერთეულზე (Vicm) მუდმივ პირობებში (ანუ იგივე ბუფერული პირობები და იგივე გელის სიბლანტე). ეს ტერმინი (მოცემულია სიმბოლო ||) განისაზღვრება, როგორც ანალიზის ელექტროფორეზული მობილურობა (გამოხატული როგორც cm2iV-s). ელექტროფორეზული მობილურობის ერთეულებიდან ჩანს, რომ თუ გელი მუშაობს მუდმივი ძაბვის პირობებში (Vicm მუდმივი) დროის მოცემული პერიოდის განმავლობაში (s), მაშინ (cm2iV-s) (V-sicm) არის მანძილი. მიგრაცია (სმ-ში). ამრიგად, თუ გელები ისე მუშაობენ, რომ ძაბვისა და დროის პროდუქტი მუდმივია, იგივე ანალიტი გადავა გელში იმავე მანძილზე. მოხერხებულობისთვის, ეს ჩვეულებრივ გამოიხატება ვოლტ-საათებში. მაგალითად, თუ ერთი გელი იმუშავებს 50 ვ-ზე 10 საათის განმავლობაში (500 Vh) და იდენტური გელი (მუდმივი სიგრძე, სიბლანტე და ბუფერის კონცენტრაცია) მუშაობს 100 V-ზე 5 საათის განმავლობაში (500 Vh), გამოჩნდება იგივე ანალიტი. ორივე გელზე ერთსა და იმავე მდგომარეობაში. გელის პროფილების რეპროდუცირების ეს უნარი არის ერთ-ერთი მთავარი მიზეზი იმისა, რომ მუდმივი ძაბვის მუშაობის პირობები სასურველია დნმ-ის ანალიზისთვის. გამონაკლისი არის დნმ-ის თანმიმდევრობისთვის სასურველი პირობები. როგორც მოგვიანებით იქნება განხილული, თანმიმდევრობის გელები მუშაობენ ამაღლებულ ტემპერატურაზე, რათა უზრუნველყონ ერთჯაჭვიანი დნმ-ის მოლეკულების ადეკვატური დენატურაცია ამ შემთხვევაში, გელის გაშვება მუდმივ ვატზე სასარგებლოა გელის თანაბარი გაცხელების შესანარჩუნებლად.

ცილის ანალიზში, ელექტროფორეზის ბუფერის pH შეიძლება იყოს ძლიერი ინსტრუმენტი კონკრეტული განცალკევების ოპტიმიზაციისთვის. ეს იმიტომ ხდება, რომ ცილებზე ნაპოვნი იონიზირებადი ჯგუფების ტიპი (მჟავე ან ძირითადი) და რაოდენობა ცვალებადია. თუმცა, დნმ-ის ანალიზისთვის დომინანტურია ფოსფატის ხერხემლის მუხტი. ამიტომ, დნმ ელექტროფორეზი, როგორც წესი, ტარდება ოდნავ ტუტე pH-ზე, რათა უზრუნველყოს ფოსფატის ნარჩენების სრული იონიზაცია.

3.1. ლარის მატრიცა: აგაროზა დნმ-ის ლაბორატორიებში გავრცელებულია გელის მატრიქსის ორი ტიპი: აგაროზი და პოლიაკრილამიდი. აგაროზა არის პოლისაქარიდი, რომელიც კომერციულად მიიღება ზღვის მცენარეებისგან. აგაროზის პოლიმერი შედგება მრავალი აგარბიოზის მოლეკულისგან, რომლებიც დაკავშირებულია ხაზოვან ჯაჭვებად, საშუალო მოლეკულური მასით 120,000 დალტონს. აგარბიოზის ქვედანაყოფი არის დისაქარიდი, რომელიც შედგება P-d-გალაქტოზისა და 3,6-ანჰიდრო-ა-ლ-გალაქტოზისგან (ნახ. 1) (6). ნაწილობრივ გაწმენდილი მასალა, აგარი, შედგება არადამუხტული პოლიმერული ჯაჭვისგან, აგაროზისა და უარყოფითად დამუხტული ჯაჭვებისგან. უარყოფითი მუხტები, როგორც წესი, სულფატის (-SO4) ნარჩენების შედეგია. ზოგადად, რაც უფრო მაღალი ხარისხისაა აგაროზა, მით უფრო დაბალია სულფატის კონცენტრაცია, მით უფრო მაღალია გამოყოფის ხარისხი და უფრო მაღალი ფასი. აგაროზა მიეწოდება თეთრი, არაჰიდროსკოპიული ფხვნილის სახით. გელი მზადდება აგაროზის ფხვნილის ბუფერთან შერევით, ნარევის დუღილით, გამდნარი გელის ჩამოსხმის უჯრაში ჩასხმით და გაგრილებით. ამ პროცესის დროს, აგაროზის ჯაჭვები ხსნარში არსებულიდან შემთხვევითი ხვეულების სახით გადადის სტრუქტურაში, რომელშიც ჯაჭვები შეფუთულია ორმაგ ხვეულებად. აგაროზის გელების ფორების საშუალო ზომა ჩვეულებრივ 100-300 ნმ3 დიაპაზონშია. აგაროზას გელები გამოიყენება 1% (wiv) კონცენტრაციით დნმ-ის ფრაგმენტების გამოსაყოფად 1-დან 20 კბ-მდე ზომის დიაპაზონში. დნმ-ის დიაგნოსტიკის ლაბორატორიაში გავრცელებული გამოყენების მაგალითები მოიცავს დიდი პლაზმიდების შეზღუდვის მონელების ანალიზს და გენომიური დნმ-ის სამხრეთ გადაცემის ანალიზს.

ნახ. 2. სქემატური დემონსტრირება აკრილამიდის და ბის-აკრილამიდის მონომერების პოლიმერიზაციის შესახებ.


აგაროზის გელი დნმ-ის ელექტროფორეზი

ლარის დასასხმელადაგაროზის ფხვნილს ურევენ ელექტროფორეზის ბუფერს სასურველ კონცენტრაციამდე, შემდეგ აცხელებენ მიკროტალღურ ღუმელში სრულ გადნებამდე. ყველაზე ხშირად, ეთიდიუმის ბრომიდი ემატება გელს (საბოლოო კონცენტრაცია 0.5 მკგ/მლ) ამ ეტაპზე, რათა ხელი შეუწყოს დნმ-ის ვიზუალიზაციას ელექტროფორეზის შემდეგ. ხსნარის გაციების შემდეგ, დაახლოებით 60C-მდე, მას ასხამენ ჩამოსხმის უჯრაში, რომელიც შეიცავს ნიმუშის სავარცხელს და აძლევენ გამაგრებას ოთახის ტემპერატურაზე ან, თუ ძალიან გეჩქარებათ, მაცივარში.

მას შემდეგ, რაც ლარი გამაგრდება, სავარცხელი ამოღებულია ჭების ფსკერის ამოღების მიზნით. ლარი, რომელიც ჯერ კიდევ პლასტმასის უჯრაშია, ჰორიზონტალურად არის ჩასმული ელექტროფორეზის კამერაში და მხოლოდ ბუფერით არის დაფარული. ნიმუშები, რომლებიც შეიცავს დნმ-ს, რომელიც შერეულია ჩატვირთვის ბუფერთან, შემდეგ პიპეტირდება ნიმუშის ჭაბურღილში, თავსახური და დენის მილები მოთავსებულია აპარატზე და გამოიყენება დენი. თქვენ შეგიძლიათ დაადასტუროთ, რომ დენი მიედინება ელექტროდებიდან გამოსულ ბუშტებზე დაკვირვებით. დნმ გადავა დადებითი ელექტროდისკენ, რომელიც ჩვეულებრივ წითელი ფერისაა.

გელში დნმ-ის მიგრაციის მანძილი შეიძლება შეფასდეს თვალთვალის საღებავების მიგრაციის ვიზუალური მონიტორინგით. ბრომფენოლი ლურჯი და ქსილენ ციანოლის საღებავები მიგრირებენ აგაროზის გელებს დაახლოებით იგივე სიჩქარით, როგორც ორჯაჭვიანი დნმ-ის ფრაგმენტები 300 და 4000 bp, შესაბამისად.

როდესაც მოხდა ადეკვატური მიგრაცია, დნმ-ის ფრაგმენტების ვიზუალიზაცია ხდება ეთიდიუმის ბრომიდით შეღებვით. ეს ფლუორესცენტური საღებავი ურთიერთქმედებს დნმ-სა და რნმ-ის ფუძეებს შორის. ის ხშირად შედის გელში ისე, რომ შეღებვა ხდება ელექტროფორეზის დროს, მაგრამ გელის შეღებვა შესაძლებელია ელექტროფორეზის შემდეგაც, ეთიდიუმის ბრომიდის განზავებულ ხსნარში გაჟღენთვით. დნმ-ის ან რნმ-ის ვიზუალიზაციისთვის გელი მოთავსებულია ულტრაიისფერ ტრანსილუმინატორზე. გაითვალისწინეთ, რომ დნმ დროთა განმავლობაში გავრცელდება გელის შიგნით და გამოკვლევა ან ფოტოგრაფია უნდა ჩატარდეს ელექტროფორეზის შეწყვეტის შემდეგ მალევე.

დნმ-ის ფრაგმენტების მიგრაცია აგაროზაში

სხვა მოსაზრებები

აგაროზის გელები, როგორც ზემოთ იყო განხილული, წარმოადგენს დნმ-ის ფრაგმენტების იზოლირებისა და გაწმენდის ყველაზე ხშირად გამოყენებულ საშუალებას, რაც წინაპირობაა ნებისმიერი ტიპის რეკომბინანტული დნმ-ის მოლეკულის შესაქმნელად.

ბუფერული შემადგენლობისა და მუშაობის პირობების ცვლილებით, აგაროზის გელების გამოყენება შეიძლება გაფართოვდეს. მაგალითები მოიცავს:

  • პულსირებული ველის ელექტროფორეზი არის ტექნიკა, რომლის დროსაც ელექტროფორეზის პალატაში დენის დინების მიმართულება პერიოდულად იცვლება. ეს საშუალებას აძლევს დნმ-ის ნაწილაკების დანაწილებას 50,000-დან 5 მლნ bp-მდე, რაც ბევრად აღემატება სტანდარტულ გელებს.
  • ტუტე აგაროზის გელები მზადდება და ელექტროფორეზირება ხდება ნატრიუმის ჰიდროქსიდის შემცველ ბუფერებში. ასეთი ტუტე პირობები სასარგებლოა ერთჯაჭვიანი დნმ-ის ანალიზისთვის.

დაბოლოს, თუ არ გქონიათ საშუალება, გაუშვათ აგაროზის გელები, სცადეთ აგაროზის ელექტროფორეზის ვირტუალური ლაბორატორია.


გელის ელექტროფორეზის ოპტიმიზაცია: ამპერი, ვოლტი და ბუფერული კონცენტრაციები - ბიოლოგია

სახელი, &lsquowestern&rsquo blot, პირველად გამოიგონა დოქტორმა ბერნეტმა 1981 წელს, დნმ-ის იგივე სამხრეთის ბლოტის შემდეგ  და რნმ-ისთვის 1977 წელს ჩრდილოეთ blot-ის მონეტების შემდეგ.[1][2] ვესტერნ ბლოტი (WB) არის ეფექტური და ფართოდ გამოყენებული იმუნოანალიზი, რომელიც უზრუნველყოფს ცილის ექსპრესიის შერჩევით ანალიზს. WB ირჩევს ინდივიდუალურ პროტეინს პოტენციურად მნიშვნელოვანი  მილიიდან ანტიგენის (Ag) - ანტისხეულის (Ab) შეკავშირების სპეციფიკის გამოყენებით. აღსანიშნავია მისი გამოყენება კლინიკურ პათოლოგიაში, სადაც western blot აღმოაჩენს პათოლოგიურად მნიშვნელოვანი ცილის არსებობას პაციენტის ნიმუშიდან. ეს მიმოხილვა  განიხილავს ამ ტექნიკის ბიოქიმიურ პრინციპებს, კლინიკურ მნიშვნელობას და პრობლემების აღმოფხვრის ასპექტებს. 

ნიმუშის მოთხოვნები და პროცედურა

Western Blot-ის პრინციპები

Western blot ეყრდნობა ცილების თანაბარი დატვირთვის პრინციპებს, ცილების გამოყოფას მოლეკულური წონით, ელექტროფორეზული გადაცემის შესაბამის მემბრანაზე და ანტისხეულების გამოკვლევის პრინციპებს.

ცილების თანაბარი დატვირთვა

ნიმუშის სათანადო მომზადება შემდგომი ელექტროფორეზისთვის გადამწყვეტია ქვედა დინების ანალიზისთვის. Western blot-ის ნიმუშები პირველად მზადდება ცილის ექსტრაქციის გზით, სპეციალიზებული უჯრედების ლიზის ბუფერებით და პროტეაზასა და ფოსფატაზას ინჰიბიტორებით (PPIs). მოპოვების მრავალი მეთოდი არსებობს და სწორი შერჩევა დამოკიდებულია ნიმუშის ტიპზე. მაგალითად, ქსოვილის უმეტესი მომზადება ხდება ჰომოგენიზაციის ან სონიკაციის გზით, თუმცა, ოსმოსური შოკი ან სარეცხი საშუალებების ლიზი უფრო შეეფერება ადვილად ლიზის უჯრედებს, როგორიცაა ერითროციტები ან კულტივირებული უჯრედები. გარდა ამისა, ექსტრაქციაში გამოყენებული უჯრედის ლიზისის ბუფერი უნდა შეესაბამებოდეს სამიზნე ცილის უჯრედულ ლოკალიზაციას.[3] მაგალითად, რადიოიმუნოპრეციპიტაციური ანალიზის ბუფერი (RIPA) უფრო კომპეტენტურია ბირთვული და მიტოქონდრიული ცილებისთვის. მიუხედავად იმისა, რომ იშვიათია, ზოგიერთი ანტისხეული ვერ შეძლებს დენატურირებული ნიმუშების აღმოჩენას. როგორც ასეთი, საჭიროა ნაზი ბუფერები სარეცხი საშუალებების გარეშე. PPI გამოიყენება სამიზნე ცილის სტრუქტურისა და ფოსფორილირების სტატუსის შესანარჩუნებლად ენდოგენური ფოსფატაზების აქტივობიდან უჯრედების ლიზისის და ეგზოგენური ფოსფატაზების აქტივობიდან ლიზისის მიკროგარემოში. ერთობლივად, ეს ინფორმაცია ხაზს უსვამს ცილის მოპოვების საჭიროებას ნიმუშის ტიპსა და სამიზნე ცილაზე.

ვესტერნ ბლოტის ნიმუშზე უნდა იყოს ცილების თანაბარი კონცენტრაცია. ინტუიციურად, ეს აუცილებელია მართებული ექსპერიმენტისთვის, რადგან უთანასწორო ცილებს თითო ზოლში შეუძლია ანალიზის დამახინჯება. ბრედფორდის ანალიზის ჩატარებით, კოლორიმეტრული ცილის ანალიზი, რომელიც იყენებს საღებავებთან ურთიერთქმედებას პროტეინთან, ცილის კონცენტრაცია რიცხოვნდება.[4] მოკლედ, საღებავი Coomassie Brilliant Blue G-250 კომპლექსდება ცილებთან ფერის შესაცვლელად და ეს შთანთქმის ცვლილება აღირიცხება სპექტროფოტომეტრით. ამრიგად, ამ ანალიზის ცნობილი ცილის სტანდარტებით გატარებით, წარმოიქმნება  წრფივი რეგრესიის სტანდარტული მრუდი პროტეინის ექსტრაქტის უცნობი კონცენტრაციების გამოსათვლელად.

ვესტერნ ბლოტის ყველა ნიმუშს აქვს სამი რამ: ცილის ექსტრაქტი, უჯრედის ლიზისის ბუფერი და Laemmli (ნიმუშის) ბუფერი. ცილის ექსტრაქტი ნორმალიზდება უჯრედის ლიზისის ბუფერით ცილის სასურველ კონცენტრაციამდე და ემატება თანაბარი მოცულობის Laemmli (ნიმუში) ბუფერი. მაშასადამე, western blot-ის ნიმუშში ყოველთვის არის ნორმალიზებული ცილის და ლაემმლის ბუფერის 1-დან 1 მოცულობის თანაფარდობა. Laemmli ბუფერი (60mM Tris-HCl pH 6.8 20% გლიცერინი 2% SDS 4% ბეტა-მერკაპტოეთანოლი 0.01% ბრომფენოლი ლურჯი)  უნიკალურია Western blot-ის ნიმუშის მომზადებისთვის, რადგან თითოეული რეაგენტი განკუთვნილია SDS-PAGE-ისთვის[5][6][6]. ] გლიცეროლი ნიმუშებს მატებს სიმკვრივეს, ამიტომ ისინი გადადიან ჩატვირთვის ჭებში. ბრომფენოლი ლურჯი (BPB) არის არარეაქტიული რეაგენტი, რომელიც ემსახურება ელექტროფორეზის საღებავის ფრონტს. SDS არის ძლიერი ანიონური სარეცხი საშუალება, რომელიც ფარავს დენატურირებულ ცილებს თანაბარი ანიონისა და მასის თანაფარდობით, ეს ნიღბავს  ცილებს მუხტის, ფორმისა და ზომის მახასიათებლებს და აქცევს მათ მხოლოდ მოლეკულური წონის ფუნქციას. ბეტა-მერკაპტოეთანოლი (BME) არის შემამცირებელი აგენტი, რომელიც მოქმედებს დისულფიდურ ობლიგაციებზე BME-ს არარსებობის შემთხვევაში, დისულფიდური ბმების მქონე ცილები ინარჩუნებენ გარკვეულ ფორმას და არ ელექტროფორიზირდებიან მოლეკულური წონის მიხედვით. Tris-HCl pH 6.80 მუშაობს წყვეტილ ბუფერულ სისტემასთან ერთად, რომელიც უფრო დეტალურად არის ახსნილი ქვემოთ. მომზადებული ნიმუშები თბება ჩატვირთვამდე, რათა შემდგომში მოხდეს ცილების დენატურაცია მათ შესაბამის პირველად სტრუქტურამდე.  ამრიგად, ცილები ელექტროფორეზის გადიან მათი მონომერული წონის მიხედვით. 

ცილების გამოყოფა მოლეკულური წონის მიხედვით

ცილების წონის მიხედვით განცალკევება შესაძლებელია ნატრიუმის დოდეცილსულფატ-პოლიაკრილამიდის გელის ელექტროფორეზის (SDS-PAGE) გამო - განსაკუთრებით მისი კომბინირებული გამოყენების სარეცხი და უწყვეტი ბუფერული სისტემა.

როგორც წესი, PAGE არის ანალიტიკური ბიოქიმიური მეთოდი, რომელიც გამოიყენება შიგთავსის გამოყოფისთვის, როგორიცაა ნუკლეინის მჟავები და პროტეინები ელექტროფორეზული მობილურობით ქიმიურად ინერტულ გელში, თუმცა SDS, ძლიერი ანიონური სარეცხი საშუალებების დამატებით, ყველა დენატურირებული ცილა დაფარული იქნება თანაბარი მუხტისა და მასის თანაფარდობით. . ამიტომ, ცილის მიგრაციის სიჩქარე წონის პროპორციულია. მართლაც, უფრო დიდი პროტეინები უფრო ნელა მოძრაობენ, ვიდრე მცირე პროტეინებთან შედარებით, ფოროვანი გელის შემაფერხებელი თვისებების გამო. გელის მატრიცა წარმოიქმნება აკრილამიდის პოლიმერიზაციით და ჯვარედინი ბმულით N, N'-მეთილენბისაკრილამიდი. ეს მატრიცა ქმნის მოლეკულურ საცერს, რომელიც აძლიერებს შემანელებელ თვისებებს. ამ საცრის ფორების ზომა შეიძლება შეიცვალოს პოლიაკრილამიდის პროცენტის კორექტირებით/ N, N'-მეთილენისაკრილამიდი, რადგან ისინი უკუპროპორციულია.[7] PAGE-ში გამოიყენება ორი სხვადასხვა ზომის საცერი: დასაწყობი გელი და გამხსნელი გელი. როგორც სახელწოდება გვთავაზობს, გელი აწყობს პროტეინებს ვიწრო ზოლში, რათა ცილებს ერთდროულად შევიდნენ გამხსნელ გელში, რაც შესაძლებელია მისი უფრო დიდი ფორების ზომისა და მჟავიანობის გამო. მისი გაცილებით მცირე ფორების ზომითა და ბაზისით, გამხსნელი გელი არის ადგილი, სადაც ხდება ცილების გამოყოფა.

Laemmi უწყვეტი ბუფერული სისტემა ყველაზე ხშირად გამოიყენება SDS-PAGE-ში. ეს სისტემა იყენებს გაშვებულ ბუფერს (25mM Tris 192mM გლიცინი 0.1% SDS pH

8.30) როგორც ელექტროდის ბუფერი და Tris-HCl მჟავე დასაწყობი გელის ბუფერისთვის (pH

6.80) და ძირითადი გამხსნელი გელი (pH

8.80). მრავალფეროვანი pH-ების მიზანმიმართული გამოყენება იყენებს გლიცინისა და მუხტის თვისებებს. მჟავე გარემოში გლიცინი არის ზვიტერიონი, მაგრამ ძირითად გარემოში ეს არის გლიცინატის ანიონი. ამრიგად, ელექტროფორეზის დაწყებისას, დენი სწრაფად იზიდავს გლიცინატს დაწყობის გელში. მჟავე გელი ახდენს გლიცინის პროტონაციას მის ცვიტერიონულ ფორმამდე, რითაც ძლიერ აფერხებს მის მოძრაობას.

ამის საპირისპიროდ, ქლორიდი ტრის-HCl ბუფერიდან გელში იშლება მისი კონტრ იონისგან და სწრაფად გადადის ანოდში. ცილები დევს გლიცინის უკანა ფრონტსა და ქლორიდის წინა ფრონტს შორის, რაც იწვევს ყველა ცილას, რომელიც ერთდროულად აღწევს გამხსნელ გელში, რაც სასიცოცხლო კომპონენტია შემდგომი გამოყოფისთვის. გამხსნელი გელის რეფორმების საფუძვლიანობა გლიცინატის ანიონების კონიუგატში დაწყობა-გამხსნელი გელის ინტერფეისზე. ამ ინტერფეისიდან გლიცინატის ანიონები სწრაფად მიგრირებენ ცილის წინა მხარეს. ახლა პროტეინები ხვდება გამხსნელ გელს ვიწრო ზოლებით, მაღალი ძაბვის ზონის გარეშე, რომელიც ადრე წარმოიქმნებოდა დაწყობის გელის წამყვანი და უკანა იონებისგან. ამრიგად, ეს საშუალებას აძლევს პროტეინებს უფრო ნელა გადაადგილდნენ გამხსნელი გელით, რაც იწვევს ცილების განცალკევებას პოლიაკრილამიდის უფრო მაღალი კონცენტრაციის გამო (სურათი 1a). 

ნიმუშები გადის მათ შესაბამის ზოლში მოლეკულური წონის მარკერთან ერთად, რომელსაც ხშირად ცილის კიბეს უწოდებენ. მაგალითად, ტიპიურ დაყენებას ექნება კიბე პირველ ზოლში და ნიმუშები დანარჩენ ზოლში.კიბე ადგენს სტანდარტულ მოლეკულური წონის ზოლებს, რომლებიც შემდეგ გამოიყენება ცილების ფარდობითი წონის წასაკითხად. 

ელექტროფორეზული ტრანსფერი (ბლოტირება)

ბლოტი არის გელის შიგთავსის ელექტროფორეზული გადატანა შესაფერის მემბრანაზე ვესტერნ ბლოტში, შიგთავსი არის ცილები. მემბრანის მრავალი სახეობის გარდა, არსებობს blotting-ის მრავალი მეთოდი. მიუხედავად იმისა, რომ არსებობს სხვადასხვა გადაცემის სისტემები (სველი, ნახევრად მშრალი, სწრაფი), ელექტროფორეზული გადაცემის ძირითადი პრინციპი იგივე რჩება. ელექტროფორეზის მსგავსად, უარყოფითად დამუხტული ნიმუშები მიგრირდება ანოდისკენ, თუმცა, ბლოტირებისას, გადაცემის სენდვიჩი გამოიყენება ოდნავ შეცვლილი ელექტროდის ბუფერთან ერთად. Towbin ბუფერი (25 mM Tris 192 mM გლიცინი 20% მეთანოლი pH 8.3)  არის სტანდარტული გადაცემის ბუფერი, თუმცა ამ ბუფერში მცირე შესწორებები შესაძლებელია სამიზნე ცილისთვის.[8] მეთანოლი მნიშვნელოვანია blotting-ში, რადგან ის ზრდის ცილების ჰიდროფობიურობას და ხელს უწყობს SDS-ის გამოყოფას, რაც ორივე ზრდის ცილების ადსორბციას მემბრანაზე. კათოდიდან ანოდამდე, სენდვიჩი ორგანიზებულია როგორც ფილტრის ქაღალდი, პოლიაკრილამიდის გელი, მემბრანა და ფილტრის ქაღალდი. სველი გადაცემის სისტემაში, ბოჭკოვანი ბალიშები ან ღრუბლები თავსდება ზედაპირულად თითოეულ მხარეს. სენდვიჩი ექვემდებარება პერპენდიკულარულ დენს, რომელიც ატარებს გელის შემცველობას მემბრანაზე. (სურათი 1ბ). სენდვიჩის შიგთავსის დაბალანსება გადაცემის ბუფერში გადამწყვეტია გადაცემის ეფექტურობის გაზრდისთვის, ის ხელს უშლის როგორც გელის, ასევე მემბრანის გაშრობას, რეცხავს ელექტროფორეზულ და დამაბინძურებლებს და ასწორებს გელის ორიგინალ ზომას. ელექტროფორეზის გაშვებისას, ძაბვა ზრდის ტემპერატურას და ეს ზრდის გელის ზომას. ამრიგად, ცივი გადაცემის ბუფერი მცირდება სათანადო ზომამდე. საინტერესოა, რომ მეთანოლი გადატანის ბუფერში ასევე ემსახურება გელის გაგრილებას წონასწორობის დროს.   

გადაცემის თითოეულ სისტემას აქვს თავისი უპირატესობები და ერთის შერჩევა დიდწილად დამოკიდებულია სამიზნე ცილაზე და ლაბორატორიულ სამუშაო პროცესზე. მრავალფეროვან გადაცემის აპარატებს შორის ორი ყველაზე ხშირად გამოყენებული  არის სველი და ნახევრადმშრალი.  აუცილებელია გავითვალისწინოთ, რომ სველ და ნახევრადმშრალ სისტემებს შორის ძირითადი განსხვავებებია გამოყენებული გადაცემის ბუფერის მოცულობა და გადაცემის დრო. სველი გადაცემა იყენებს ავზის გადაცემის სისტემას, რომელიც მოითხოვს გადაცემის ბუფერის დიდ მოცულობას, ხოლო ნახევრადმშრალი გადაცემის სისტემები ჩვეულებრივ საჭიროებს მხოლოდ სენდვიჩის დატენიანებას. ნახევრადმშრალი სისტემები ასევე დროში ეფექტურია, რადგან ლაქა ჩვეულებრივ სრულდება ერთ საათში, მაგრამ დაბალი ძაბვა გამოიყენება ღამით სველი გადაცემისას. მიუხედავად იმისა, რომ ნახევრად მშრალი ტრანსფერი, როგორც ჩანს, უკეთესი ვარიანტია, რადგან არის მნიშვნელოვანი შემცირება როგორც გადაცემის ბუფერის მოცულობაში, ასევე გადაცემის დროის ხანგრძლივობაში, მას აქვს თავისი შეზღუდვები. დიდი ცილები, როგორიცაა მემბრანული რეცეპტორები, კარგად არ იშლება და გადაცემის საერთო ეფექტურობა დაბალია. სველი გადაცემის უნარი ანათებს მაღალი ეფექტურობის გამომუშავებას ცილების ფართო სპექტრში, რითაც გთავაზობთ ყველაზე მეტ მოქნილობას. 

როდესაც Dr. ბერნეტმა და ტოუბინმა გამოაქვეყნეს თავიანთი სათესლე კვლევები ელექტროფორეზული ტრანსფერი განხორციელდა ნიტროცელულოზის მემბრანებზე. ისინი დარჩნენ ოქროს სტანდარტად პოლივინილიდენ დიფტორიდის (PVDF) მემბრანების გამოჩენამდე. მოკლედ, PVDF მემბრანები აჯობებენ ნიტროცელულოზის მემბრანებს მათი პროტეინებთან შეკავშირების უნარით, ქიმიური წინააღმდეგობით და გაზრდილი გადაცემის ეფექტურობით SDS-ის თანდასწრებით. PVDF-ის ცილების უფრო მაღალი ადსორბცია და მისი ქიმიური წინააღმდეგობა იძლევა მემბრანების გაშიშვლებასა და რეპრობირებას. ასევე, გადაცემის ბუფერში SDS-ის მცირე პროცენტის ჩასმით, ტრანსფერის ეფექტურობა საგრძნობლად უმჯობესდება. თუმცა, PVDF-დან აღნიშნულმა ცილის მგრძნობელობამ ასევე შეიძლება გაზარდოს ანალიზის ფონური სიგნალი. მეთანოლს გადაცემის ბუფერში შეუძლია ნიტროცელულოზის მემბრანების შემცირება და დიდი ცილების დალექვა. ორივე ტიპის მემბრანა მოდის სხვადასხვა ზომის ფორებში და მემბრანის ფორების ზომა პირდაპირ კავშირშია ცილის წონასთან. მცირე პროტეინებს უფრო მცირე ზომის ფორები სჭირდებათ, თუმცა ფორების ზომა 0,45 მიკრონი შესაფერისია ცილების უმეტესობისთვის. ბოლო წლებში განვითარდა უნიკალური მემბრანები, როგორიც არის ახლო ინფრაწითელი აღმოჩენის სისტემებისთვის. როგორც ასეთი, არჩეული მემბრანის ტიპი უნდა ასახავდეს სამიზნე ცილას და ქვედა დინების გამოვლენის სისტემებს.

ანტისხეულების გამოკვლევა

ელექტროფორეზული გადაცემის დასრულების შემდეგ, ცილები ახლა მემბრანაზეა და ორი ანტისხეულია ემსახურება გამოკვლევისა და ანალიზისთვის. პირველადი ანტისხეული, რომელიც აკავშირებს კონკრეტულ რეგიონს სამიზნე ცილაზე, გამოიყენება მემბრანაზე მისი არსებობის დასადგენად. მეორადი ანტისხეული აერთიანებს კომპონენტს, რომელიც გამოიყენება ანალიზისთვის. ეს ანტისხეული ირიბად აკავშირებს სამიზნე ცილას პირველადი ანტისხეულის მუდმივ რეგიონებთან შეკავშირებით (სურათი 1c). 

ვინაიდან მემბრანებს აქვთ მაღალი მიდრეკილება ცილებთან, ზონდირებამდე მემბრანების ინკუბაცია ხდება ბუფერში დარჩენილი ზედაპირის დასაფარად. ეს &lsquoblocking&rsquo ბუფერი მოიცავს ცილას მინიმალური შემაკავშირებელ აფინურობით სამიზნე ცილასთან და, შესაბამისად, ანტისხეულთან. როგორც წესი, დამბლოკავი ბუფერული ცილები მოიცავს კაზეინს რძის ფხვნილიდან ან მსხვილფეხა რქოსანი შრატის ალბუმინს (BSA). მიუხედავად იმისა, რომ კაზეინი უფრო იაფი და შესაფერისია ცილების უმეტესობისთვის, BSA ითვლება უკეთეს არჩევანად, როდესაც სამიზნე ცილა ფოსფორილირდება. არსებობს ჯვარედინი რეაქტიულობა კაზეინისა და ფოსფორილირების სპეციფიკური პირველადი ანტისხეულებისგან. დაბლოკვის შემდეგ, მემბრანა ირეცხება TBS-T-ით, Tris-ბუფერული მარილის ნარევით და Tween 20. Tween 20 არის არაიონური სარეცხი საშუალება, რომელიც ეხმარება მემბრანაზე პერიფერიულად შეკრული ცილების ამოღებას.

როგორც პირველადი, ისე მეორადი ანტისხეულების გამოკვლევა ხდება მემბრანის ინკუბაციით TBS-T-ში პირველადი ან მეორადი ანტისხეულების საცდელ ბუფერში. მემბრანა პირველად ინკუბირებულია პირველადი საცდელი ბუფერში, როგორც წესი, ღამით ცივ ოთახში, და კვლავ გარეცხილია TBS-T-ით. შემდეგ მემბრანა ინკუბირებულია მეორადი საცდელი ბუფერით დაახლოებით ერთი საათის განმავლობაში და შემდეგ ასევე ირეცხება. რეცხვის ეს ნაბიჯები გადამწყვეტია ანალიზში ფონური ხმაურის შესამცირებლად. გამოკვლევისა და გარეცხვის შემდეგ მემბრანა მზადაა წასაკითხად.

როგორც უკვე აღვნიშნეთ, მეორადი ანტისხეული კონიუგირდება ანალიზის ტიპისთვის სპეციფიკურ კომპონენტთან. ავტორადიოგრაფია იყო ზოლების ვიზუალიზაციის საერთო გზა, მაგრამ მისი პოპულარობა შემცირდა ამ მეთოდთან დაკავშირებული საფრთხის გამო. იგი იყენებს მეორად ანტისხეულთან კონიუგირებულ რადიო მარკირებულ იზოტოპს. უფრო ხშირად გამოიყენება ქიმილუმინესცენციის მეთოდი. ეს მეთოდი იყენებს სუბსტრატებს, რომლებიც რეაგირებენ ფერმენტ-კონიუგირებულ მეორად ანტისხეულთან. ეს ფერმენტები არის ან ცხენის პეროქსიდაზა (HRP) ან ტუტე ფოსფატაზა (AP). ფერმენტის შუამავლობით გამოწვეული რეაქცია წარმოქმნის სინათლეს, რომელიც შემდეგ ჩაიწერება გამოსახულების სისტემით. ახლახან, მეორადი ანტისხეულები შეუერთდა ფტორფორებს, რომელთა აღმოჩენა შესაძლებელია სუბსტრატების გარეშე. ფლუორესცენტზე დაფუძნებული ეს აღმოჩენა პოპულარობას იძენს იმის გამო, რომ აქვს ორი სამიზნე ცილის გამოკვლევის უნარი მეორადი ანტისხეულების მეშვეობით სხვადასხვა ტალღის სიგრძის ფლუოროფორებით. ეს არის შერჩევითი უპირატესობა პროტეინის შედარებითი ექსპრესიის ანალიზისთვის, რადგან საყოფაცხოვრებო ცილები ხილულია ინტერესის პროტეინთან ერთად.

ზოლების ვიზუალიზაცია შეიძლება ემსახურებოდეს სხვადასხვა ანალიტიკურ მიზნებს. უბრალოდ, ზოლების არსებობას შეუძლია გადაამოწმოს ცილის გამოხატულება, ხოლო ზოლების სიმკვრივეს შეუძლია აჩვენოს შედარებითი პროტეინის გამოხატულება. შინამეურნეობის ცილა ასევე გამოკვლეულია პროტეინის შედარებითი ექსპრესიის შესაფასებლად. საყოფაცხოვრებო ცილა არის ყველგან გავრცელებული ცილა, რომელიც კონსტიტუციურად გამოხატავს ყველა უჯრედში. სამიზნე პროტეინის ზოლის სიმკვრივის ნორმალიზებით საყოფაცხოვრებო პროტეინთან, a შეიძლება გაიზომოს სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი განსხვავება ნიმუშის ტიპებს შორის.[9][10]

კლინიკური მნიშვნელობა

როგორც უკვე აღვნიშნეთ, ვესტერნ ბლოტს აქვს საკმაო რაოდენობა. ეს ხანგრძლივი პროცესი ზრდის ზუსტი შედეგისთვის საჭირო დროსა და ხარჯებს. თუმცა, ელიზასგან განსხვავებით, ვესტერნ ბლოტი ნაკლებად სავარაუდოა, რომ იძლევა ცრუ დადებით შედეგებს, რაც განსაკუთრებით ეხება აივ-ის დიაგნოზს.[11]

Western blotting გამოიყენება ადამიანის შრატისა და შარდის ნიმუშებში აივ-ის საწინააღმდეგო ანტისხეულების გამოსავლენად. პროტეინის ნიმუშები ცნობილი აივ-ინფიცირებული ინდივიდისგან გამოიყოფა ელექტროფორეზით და შემდეგ იშლება ნიტროცელულოზის მემბრანაზე. შემდეგ სპეციფიური ანტისხეული მიმაგრებულია ცილის გამოსავლენად. ვესტერნ ბლოტი ჩვეულებრივ ტარდება ELISA ტესტის შემდეგ აივ-ის დიაგნოზის დასადასტურებლად.[12] ის ბევრად უფრო მგრძნობიარეა ვიდრე ELISA ტესტი. ახლახან, კომერციული აივ-ის ვესტერნ ბლოტის კომპლექტებში, ვირუსული ცილები მემბრანაზე ფიქსირდება.  ადამიანის შარდის ან შრატის ნიმუშების ანტისხეულები უკავშირდება ამ პროტეინებს და აივ-ის ანტისხეულები გამოიყენება ზოლების გამოსავლენად ხარისხის კონტროლთან ერთად. .

ვესტერნი ბლოტი ასევე სასარგებლოა ლაიმის დაავადებისა და ატიპიური და ტიპიური მსხვილფეხა რქოსანი სპონგური ენცეფალოპათიის გამოვლენაში.[13][14]

ხარისხის კონტროლი და ლაბორატორიის უსაფრთხოება

ხარისხის კონტროლი

ნებისმიერი ექსპერიმენტის მსგავსად, ხარისხის კონტროლი უნდა იყოს გამოყენებული აღმოჩენების დასადასტურებლად. ვესტერნ ბლოტში დადებითი კონტროლი, უარყოფითი კონტროლი, დატვირთვის კონტროლი და პირველი ხარისხის A-B კონტროლი ყველა ეფექტურია ძლიერი ექსპერიმენტების მისაღწევად და შესანარჩუნებლად.

კონტროლი არის გამოყოფილი ზოლები, სადაც ნიმუში შეცვლილია სპეციალურად კონტროლის ტიპისთვის. დადებითი კონტროლი არის ნიმუში, რომელიც ცნობილია, რომ შეიცავს სამიზნე ცილას, ხოლო უარყოფითი კონტროლი ცნობილია, რომ არ შეიცავს სამიზნე ცილას. ეს შეიძლება იყოს ისეთივე ზოგადი, როგორც სხვადასხვა ორგანოების ტიპები ან ისეთივე სპეციფიკური, როგორც სხვადასხვა უჯრედული ლოკალიზაცია. მაგალითად, თუ მიზანია ბირთვული ცილის ექსპრესიის ანალიზი და ხდება უჯრედქვეშა ფრაქციები ამ რეგიონის იზოლირებისთვის, უარყოფითი კონტროლი აფასებს ფრაქციების ხარისხს, ანტისხეულების არასპეციფიკურ შეკავშირებას და ცრუ-დადებითს. პოზიტიური კონტროლი მძლავრია იმის დასადასტურებლად, რომ სამუშაო ნაკადი კარგად არის ოპტიმიზებული, თუნდაც ნიმუშის ზოლში ზოლების არარსებობის შემთხვევაში. ასევე, დადებით კონტროლს შეუძლია უარყოფითი შედეგის გადამოწმება.

დატვირთვის კონტროლი არის საყოფაცხოვრებო ცილა, როგორიცაა ალფა-ტუბულინი ან ბეტა-აქტინი. საყოფაცხოვრებო პროტეინისთვის სპეციფიკური ანტისხეულებით გამოკვლევა ამოწმებს ცილების თანაბარ რაოდენობას სინჯზე.

არასპეციფიკურმა მეორადმა ანტისხეულმა შეიძლება გამოიწვიოს ცრუ დადებითი. მეორადი ანტისხეულის სპეციფიკა ფასდება მემბრანის ზოლის პირველადი ანტისხეულით ინკუბაციით.

Დიაგნოსტიკა

სამწუხაროდ, ამ მეთოდში ბევრი შეცდომის ჯგუფია მრავალი ნაბიჯისა და ხანგრძლივი სამუშაო პროცესის გამო. ყველა შეცდომის, მისი მიზეზისა და გამოსავლის განხილვა ამ მიმოხილვის ფარგლებს სცილდება. ყველაზე გავრცელებულ საკითხებზე და მათი პრობლემების მოგვარებაზე იქნება აქცენტი ქვემოთ.

ბენდების ღიმილი

როდესაც ზოლები არ არის თანაბრად მიგრაცია გელის ქვემოთ, ეს ნიმუში შეიძლება გადაჭარბებული იყოს ღიმილის შაბლონამდე. ეს მიუთითებს იმაზე, რომ გელს აქვს ჰაერის ბუშტები, ძაბვა ძალიან მაღალია, ან დატვირთვის ნიმუშის მოცულობა ძალიან დიდია. გელის შიგნით ჰაერის ბუშტებმა შეიძლება დაამახინჯოს ზოლების მიგრაცია. ელექტროფორეზის დროს მუდმივი ძაბვა პირდაპირპროპორციულია წინააღმდეგობისა და რადგან წინააღმდეგობა და ტემპერატურა პირდაპირ კავშირშია, მაღალი ძაბვა ზრდის ელექტროფორეზის ავზში ტემპერატურას. სითბოს ჯიბეები და გაშვებული ბუფერის ტემპერატურის საერთო მატებამ ასევე შეიძლება შეცვალოს მიგრაცია. სანამ ბუფერი გახურდება, ელექტროფორეზის დაწყებისას მაღალი ძაბვა აჩქარებს ზოლებს და გამოიწვევს არაწრფივ მიგრაციას. ჩატვირთვის ნიმუშების დიდმა მოცულობამ შეიძლება გამოიწვიოს სხვა ზოლში გადატანა და ამ დიდ ზოლებს შეიძლება სხვა ზოლში გადახვევა.

ბენდების არარსებობა

თუ გამოვლენის სისტემა არ აჩვენებს სიგნალს ყველა ზოლში, გარდა კიბისა, არსებობს მრავალი შესაძლო მიზეზი. უმჯობესია ჯერ ლოკალიზებული იქნას, თუ სად მოხდა შეცდომა. როგორც წესი, ყველაზე გავრცელებული დამნაშავეა გადაცემის ცუდი ეფექტურობა ან ცუდი ზონდირება.

მემბრანის შეღებვით Ponceau S-ით, მემბრანისთვის უსაფრთხო წითელი საღებავით, შესაძლებელია ზოლების ვიზუალიზაცია. თუ ზოლები კარგად არის ილუსტრირებული მემბრანაზე, განსაკუთრებით იმ მხარეში, სადაც მოსალოდნელია სამიზნე ცილა, ეს მიუთითებს იმაზე, რომ გადაცემის ეფექტურობა სავარაუდოდ არ არის მიზეზი. თუ ზოლები არ არის, გადაცემის პარამეტრები უნდა შეიცვალოს. ცილების გამორეცხვა შეიძლება მოხდეს, როდესაც ცილები მემბრანიდან გადადის ფილტრის ქაღალდზე. ეს არის იმის გამო, რომ გადაცემის დრო არის ძალიან მაღალი შემცირების ძაბვა და ან გადაცემის დროს შეუძლია თავიდან აიცილოს გამორეცხვა. ცუდი ტრანსფერი ასევე შეიძლება მოხდეს, თუ მემბრანაზე ცოტა ცილები შეიწოვება. გადაცემის მიმართულების გასაგებად, გელის შეღებვა შესაძლებელია ზოლების გამოსავლენად. ზოლების მნიშვნელოვანი ვიზუალიზაცია შეიძლება მიუთითებდეს, რომ ფაქტობრივი გადაცემა ცუდი იყო და არა მაღალი ძაბვა ან დრო. გადაცემის ბუფერის ხარისხის ხელახლა შემოწმება, გადაცემის პარამეტრების გაზრდა და გელისა და მემბრანის სათანადო კონტაქტის უზრუნველყოფა შეუძლია ამ პრობლემის გადაჭრას. თუ სამიზნე ცილა მცირეა, სასურველია ნახევრად მშრალი სისტემა.

თუ გამოიყენება დადებითი კონტროლის ზოლი და არ არის ზოლები, ეს შეიძლება გამოწვეული იყოს ცუდი გამოვლენის ნაკრებით, ცუდი ანტისხეულებით ან თუნდაც ანტისხეულების არასწორი კონცენტრაციით. ანტისხეულების კონცენტრაცია ოპტიმიზირებულია ტიტრაციის ექსპერიმენტებით.

მრავალი ბენდი

მხოლოდ ერთი რიგის ზოლები უნდა იყოს ვიზუალურად გამოვლენილი. მრავალი ზოლის არსებობა მიუთითებს ანტისხეულების არასპეციფიკურ შეკავშირებაზე. პოლიკლონური ანტისხეულები, როგორც წესი, წარმოქმნიან ამ შედეგს, ისევე როგორც ანტისხეულების მაღალ კონცენტრაციას. როგორც უკვე აღვნიშნეთ, ტიტრირების ექსპერიმენტები უნდა ჩატარდეს გამოვლენის ოპტიმიზაციისთვის.

მაღალი ფონი ლაქებით ან მის გარეშე

მემბრანის ცუდი ბლოკირება, ანტისხეულების გადაჭარბებული კონცენტრაცია და მშრალი მემბრანა შეიძლება გამოიწვიოს მაღალი ფონური სიგნალები. ბლოკირების პერიოდის გაზრდამ ან ბლოკირების ბუფერში გამოყენებული პროტეინის ტიპის შეცვლამ შეიძლება გადაჭრას ეს. ანტისხეულების ოპტიმიზაციისთვის ტიტრაციული ექსპერიმენტები უნდა ჩატარდეს. არასაკმარისმა დაბანამ შეიძლება გამოიწვიოს მაღალი ფონური სიგნალი და მემბრანაზე ლაქების წარმოქმნის მთავარი მიზეზი. მემბრანები სველი უნდა იყოს მთელი ექსპერიმენტის განმავლობაში და მშრალ მემბრანას შეუძლია მაღალი ფონური სიგნალების მიცემა. 

გამოიყენება ლაბორატორიის უსაფრთხოების სტანდარტული წესები. თუ ჩამოსხმის გელები, აკრილამიდი არის ძლიერი ნეიროტოქსინი, თუმცა, პოლიმერიზაციის შემდეგ ის ქიმიურად ინერტულია. ამ რეაგენტთან ფრთხილად მოპყრობა აუცილებელია და სათანადო პრევენციული ზომები უნდა იქნას დაცული მასთან დამუშავებამდე.

ჯანდაცვის გუნდის შედეგების გაძლიერება

პროფესიონალთაშორისი ჯანდაცვის ჯგუფის წევრებს, რომლებიც მონაწილეობენ იმ პირობების მკურნალობასა და მართვაში, სადაც გამოიყენება Western blot ტესტირება, უნდა გაიგონ გამოკვლევის შედეგები. ლაბორატორიის ტექნიკური და საექთნო პერსონალი, რომლებიც იღებენ და ამზადებენ ნიმუშებს, უნდა იყვნენ კარგად გაწვრთნილი, რათა დარწმუნდნენ, რომ ნიმუშები შესაბამისი ხარისხისაა ზუსტი ტესტირებისთვის. პროფესიონალთაშორისი ტრენინგი, კოორდინაცია და კომუნიკაცია გააუმჯობესებს western blot-ის შედეგების კლინიკურ ვალიდობას და გამოიწვევს პაციენტის მოვლისა და შედეგების გაუმჯობესებას. [დონე 5]


Western Blot Doctor™ — პროტეინის ზოლის გარეგნობის პრობლემები

02/28/23 09:32 AM AE,AI,AL,AM,AR,AT,AU,AZ,BA,BD,BE,BF,BG,BH,BN,BO,BR,BW,CA,CH,CL ,CM,CN,CO,CR,CY,CZ,DE,DK,DO,DZ,EC,EE,EG,EH,ER,ES,ET,FI,FM,FO,FR,GA,GE,GF,GH ,GP,GR,GT,GU,HK,HN,HR,HT,HU,ID,IE,IL,IN,IS,IT,JM,JO,JP,KE,KH,KR,KW,KZ,LB,LI ,LK,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,ML,MO,MQ,MS,MT,MU,MX,MY,NG,NI,NL,NO,NP,NZ,OM,PA,PE ,PF,PG,PH,PK,PL,PR,PS,PT,PW,PY,QA,RO,RS,RU,SA,SB,SE,SG,SI,SK,SN,ST,SV,TG,TH ,TN,TO,TR,TT,TW,TZ,UA,UG,UK,US,UY,UZ,VA,VE,VU,XK,YE,ZA,VN en LSR /LSR/Technologies/Western_Blotting N 0

Western Blot Doctor არის თვითდახმარების სახელმძღვანელო, რომელიც საშუალებას გაძლევთ მოაგვაროთ თქვენი Western Blot-ის პრობლემები. ამ განყოფილებაში შეგიძლიათ იპოვოთ გადაწყვეტილებები პროტეინის ზოლის გარეგნობასთან დაკავშირებულ საკითხებზე.

სხვა სექციები Western Blot Doctor-ში:

პრობლემები და გადაწყვეტილებები

დააწკაპუნეთ მინიატურაზე, რომელიც ყველაზე მეტად წარმოადგენს თქვენს საკუთარ ბლოტს, რათა აღმოაჩინოთ სავარაუდო მიზეზები და იპოვოთ პრობლემის კონკრეტული გადაწყვეტილებები.

პრობლემა: ცილის დონის არათანმიმდევრული კონტროლი ნიმუშებს შორის

  • შეამოწმეთ, რომ მთლიანი ცილის დონე შეესაბამება:
    • საწყისი ნიმუშის რაოდენობრივი რაოდენობა (O.D., წონა, უჯრედების რაოდენობა და ა.შ.)
    • შეამოწმეთ ცილის ნიმუშების კონცენტრაცია (მაგ., ბრედფორდის ან ლოურის ცილის ანალიზის გამოყენებით)
    • იმის დასადგენად, არის თუ არა ჩატვირთვის კონტროლის დონის ცვლილებები განპირობებული განსხვავებებით დატვირთული ნიმუშის რაოდენობაში, ან თუ განსხვავებები გამოწვეულია დატვირთვის საკონტროლო ცილების გამოხატვის ცვალებადობით, გამოიყენეთ მთლიანი ცილის ლაქები (მაგ., Ponceau S, Coomassie, კოლოიდური ოქრო , ან SYPRO Ruby) გელებზე და ბლოტებზე ცილების ვიზუალიზაციისთვის გადატანამდე და მის შემდეგ, რათა დადგინდეს პროტეინის ფარდობითი დატვირთვა. თუ გეგმავთ ბლოტის გამოყენებას ქვედა ნაკადში, დარწმუნდით, რომ თქვენი ლაქა შეიძლება მოიხსნას ან თავსებადია ანტისხეულების გამოვლენასთან. მაგალითად, Coomassie და კოლოიდური ოქრო არ არის თავსებადი ქვედა დინების საფეხურებთან (იხ. Bio-Rad Protein Stains და Protein Stain Selection Guide)
      • იმის დასადგენად, რჩება თუ არა გელზე ნარჩენი, გადაუტანელი ცილა, გამოიყენეთ მთლიანი ცილის ლაქა გელზე გადატანის შემდეგ.
      • ცილის გადაცემის შესამოწმებლად მემბრანა შეღებეთ Ponceau S-ით დაბლატის შემდეგ
      • წარმოიდგინეთ მთლიანი პროტეინი გელებზე და ბლოტებზე Bio-Rad&rsquos ლაქების გარეშე გელების გამოყენებით, ჩვენი საკუთრების უჟანგავი ტექნოლოგიით. გარდა იმისა, რომ უზრუნველყოფს გადაცემის ვიზუალურ გადამოწმებას ყოველ ნაბიჯზე, ლაქების გარეშე გამოსახულება საშუალებას იძლევა მთლიანი ცილის ნორმალიზება თითოეულ ზოლში, რაც გამორიცხავს საყოფაცხოვრებო ცილების საჭიროებას, როგორც ჩატვირთვის კონტროლის მექანიზმებს.
      • შეამოწმეთ, რომ ჩატვირთვის კონტროლის გამოხატულება თანმიმდევრულია პირობების მიხედვით მეორადი ჩატვირთვის კონტროლის გამოყენებით. თუ ჩატვირთვის კონტროლის გამოხატულება განსხვავდება ექსპერიმენტული პირობების მიხედვით, სცადეთ სხვა ჩატვირთვის კონტროლის გამოყენება
      • სცადეთ მთლიანი ცილის ნორმალიზება ლაქების გარეშე ტექნოლოგიის გამოყენებით, ნაცვლად ერთი საყოფაცხოვრებო პროტეინის ნორმალიზებისა. დამატებითი ინფორმაციისთვის იხილეთ შემდეგი:
        • აპლიკაციები და ტექნოლოგიები: ლაქების გარეშე გამოსახულების ტექნოლოგია
        • პროტეინის გამოყოფისა და ანალიზის ტენდენციები და ლაქების გარეშე ტექნოლოგიის ბიორადიაციების წინსვლა, 2014 წლის სექტემბერი
        • მეთოდი უფრო საიმედოობისთვის Western Blot Loading Controls-ში: ლაქებისგან თავისუფალი მთლიანი პროტეინის რაოდენობრივი ბიულეტენი 6360

        პრობლემა: აჩრდილის ცილის ზოლები

        • ნიმუშებისთვის დატვირთული მთლიანი ცილის შემცირება
        • გელის ჩატვირთვამდე შეამოწმეთ ცილის ნიმუშების კონცენტრაცია (მაგ. ბრედფორდის ან ლოურის პროტეინის ანალიზის გამოყენებით)
        • ნიმუშის ჩატვირთვის ოპტიმიზაცია იხილეთ Western Blots პროტოკოლისთვის შესაბამისი ნიმუშის დატვირთვის განსაზღვრა
        • პირველადი და/ან მეორადი ანტისხეულების კონცენტრაციის შემცირება
        • გააუმჯობესეთ თქვენი პირველადი და/ან მეორადი ანტისხეულების კონცენტრაციები ჭადრაკის სკრინინგის პროტოკოლის გამოყენებით
        • გამოიყენეთ უფრო მოკლე ექსპოზიციის დრო
        • გამოიყენეთ მრავალჯერადი შეძენის ფუნქცია მონაცემთა შეძენის პროგრამულ უზრუნველყოფაზე
        • გამოიყენეთ ნაკლებად მგრძნობიარე აღმოჩენის სუბსტრატი
        • შეამცირეთ ინკუბაციის დრო გამოვლენის სუბსტრატით
        • ბლოტიანი სენდვიჩის აგებისას არ შეცვალოთ ბლოტი მას შემდეგ, რაც გელის მემბრანასთან შეხება მოვიდა, რადგან ამან შეიძლება გამოიწვიოს ბლოტიან მემბრანაზე მოჩვენება.

        პრობლემა: ტრიალებს ან ზოლების გამოტოვებული ზოლები გამოჩნდება დიფუზურად ბლოტზე

        ქაფის ბალიშები Bio-Rad სველი ტანკების blotting სისტემებისთვის:

        • Criterion&trade Blotter (1704086)
        • Trans-Blot ® Plus სისტემა (1703995)
        • ტრანს-ბლოტის სისტემა (1703914)
        • მინი ტრანს-ბლოტის სისტემა (1703933)

        პრობლემა: ბუნდოვანი ზოლები

        • გაიმეორეთ გელის ელექტროფორეზი დაბალ ძაბვაზე
        • იმუშავეთ დაბალ ძაბვაზე მთელი მუშაობის განმავლობაში
        • იმუშავეთ ქვედა ძაბვაზე, სანამ ცილები არ დაიწყებენ შეღწევას გამხსნელ გელში, შემდეგ გაზარდეთ ძაბვა დარჩენილი მუშაობისთვის
        • ცილის გადატანამდე ფრთხილად ამოიღეთ ჰაერის ბუშტები გელსა და მემბრანას შორის
        • მოამზადეთ ახალი გაშვებული ბუფერი ან გამოიყენეთ წინასწარ შერეული კომერციული ბუფერები (იხილეთ ბუფერებისა და რეაგენტების ჩვენი არჩევანი)

        პრობლემა: ზოლები არის მოხრილი (იღიმის) არა სწორი

        • გელის ელექტროფორეზის პირობების შემოწმება და ოპტიმიზაცია. იხილეთ თქვენი ინსტრუქციის სახელმძღვანელო ან ელექტროფორეზის სახელმძღვანელო
        • ელექტროფორეზის დროს ძაბვის შემცირება
        • გასაშვები გელი 4&°C ტემპერატურაზე. მოათავსეთ ელექტროფორეზის უჯრედი 4&°C გამაგრილებელში გაშვების დროს. გამოიყენეთ გაცივებული ბუფერები, გამაგრილებელი ხვეული ან &ldquoblue ice&rdquo გაგრილების ჩანართი

        პრობლემა: ფართო ან არასწორი ზოლები

        • ელექტროფორეზის არტეფაქტები შეიძლება წარმოიშვას ცუდი გელის პოლიმერიზაციის, მუშაობის შეუსაბამო პირობების, დაბინძურებული ბუფერების, ნიმუშების გადატვირთვის და ა.შ.
        • შეამოწმეთ ნიმუშების მარილის კონცენტრაცია, განსაკუთრებით მარილით დალექილი ნიმუშების გაშვებისას. როდესაც შესაძლებელია, შეინარჩუნეთ მარილის მსგავსი შემცველობა ყველა ჭაბურღილში. მარილის მაღალი შემცველობის მქონე ჭაბურღილები ფართოვდება, როდესაც ოსმოსის გამო ნაკლები მარილიანი ჭაბურღილების გვერდით არის. მარილის მაღალმა დიფერენციალმა (განსაკუთრებით ნიმუშსა და ბუფერებს შორის) ასევე შეიძლება გამოიწვიოს უფრო დიდი ზოლის დამახინჯება. ფრთხილად იყავით მარილით დალექილი ნიმუშების გაშვებისას
        • მარილის მაღალი შემცველობის ნიმუშები ხშირად შეიძლება განადგურდეს Bio-Gel ® P6 სვეტების გამოყენებით

        პრობლემა: თეთრი (უარყოფითი) ზოლები ფილმზე ECL მეთოდის გამოყენებით

        • ნაკლები ნიმუშის ჩატვირთვა
        • გაიმეორეთ ნიმუშის განზავების სერიით
        • ნიმუშის ჩატვირთვის ოპტიმიზაცია იხილეთ Western Blots პროტოკოლისთვის შესაბამისი ნიმუშის დატვირთვის განსაზღვრა
        • ანტისხეულების კონცენტრაციის შემცირება/ოპტიმიზაცია ჭადრაკის სკრინინგის პროტოკოლების გამოყენებით

        პრობლემა: არ არის ბენდები

        • დაადასტურეთ ცილის გადაცემა მემბრანის შეღებვით Ponceau S-ით და/ან გელით Coomassie Blue Dye-ით, ან გამოიყენეთ Bio-Rad&rsquos ულაქო გელები გადაცემის დასადასტურებლად ჩვენი უნიკალური ლაქების გამოსახულების ტექნოლოგიის გამოყენებით.
        • გაითვალისწინეთ, რამდენად კარგად არის გადატანილი წინასწარ შეღებილი მოლეკულური წონის მარკერები ბლოტზე
        • გადაცემის პირობების და დაყენების ოპტიმიზაცია და შემოწმება (განსაკუთრებით ელექტროდებზე ორიენტაცია)
        • გაიმეორეთ ორი მემბრანის გამოყენებით იმ შემთხვევაში, თუ ცილა გადავიდა პირველ მემბრანაში (ზედმეტად გადაცემა განსაკუთრებით სავარაუდოა დაბალი მეგავატიანი ცილების შემთხვევაში)
        • სცადეთ ბლოკირების დაბალი კონცენტრაცია
        • სცადეთ ალტერნატიული ბლოკირების აგენტები
        • გამოიყენეთ აზიდებისგან თავისუფალი ბუფერები
        • გამოიყენეთ ახალი გამოვლენის რეაგენტები
        • დაამატეთ ახალი პეროქსიდი სუბსტრატის ბუფერში
        • გადახედეთ ნაბიჯებს პირველადი და მეორადი ანტისხეულების თავსებადობის შესამოწმებლად
        • გადაამოწმეთ სწორი მეორადი ან ზოლიანი ბლოტით და საჭიროების შემთხვევაში გადაამოწმეთ
        • გაიმეორეთ ექსპერიმენტი ანტისხეულების სწორი კომბინაციით
        • გაზარდეთ ანტისხეულების კონცენტრაცია 2 და 4-ჯერ მეტი, ვიდრე საწყისი ტესტი
        • გამოიყენეთ ჭადრაკის სკრინინგის პროტოკოლი
        • ინკუბაციის ხანგრძლივობის გაზრდა
        • შეამცირეთ სარეცხი ნაბიჯების სიმკაცრე
        • დაბალი ტემპერატურა, სარეცხი საშუალებების კონცენტრაციის შემცირება, იონური სიძლიერის შემცირება
        • ანტისხეულების ტესტირება და ოპტიმიზაცია წერტილოვან ლაქებზე
        • სცადეთ ალტერნატიული ანტისხეული. Bio-Rad ახლა გთავაზობთ მაღალი ხარისხის ანტისხეულებს ყველა აპლიკაციისთვის
        • შეამოწმეთ მონაცემთა ფურცელი რეკომენდებული პირობებისთვის
        • ანტისხეულების ტესტირება და ოპტიმიზაცია წერტილოვან ლაქებზე
        • შეამოწმეთ სამიზნე და ანტისხეულების კომბინაციები ჭადრაკის სკრინინგის პროტოკოლების გამოყენებით
        • სცადეთ ალტერნატიული ანტისხეული
        • ტესტი წერტილოვანი ბლოტით რამდენიმე კონცენტრაციით
        • გაყინეთ ანტისხეულების ალიქვოტები და გალღეთ მხოლოდ თითო-თითო, საჭიროებისამებრ, ბლოტებისთვის შეინახეთ გაყინული ალიქვოტები 4&°C ტემპერატურაზე
        • გამოიყენეთ ანტისხეულების ახალი ნაწილი, რომლებიც ინახება &ndash20ºC ან ქვემოთ
        • თუ ანტისხეულს ინახავთ ძალიან დიდი ხნის განმავლობაში, შეინახეთ &ndash80ºC-ზე
        • მოერიდეთ გაყინვა-დათბობის განმეორებით ციკლებს
        • დამატებითი ინფორმაციისთვის იხილეთ რჩევები ანტისხეულების მოვლის შესახებ
        • გამოიყენეთ სამიზნე ცილის სხვა წყარო
        • ექსპერიმენტში ჩართეთ დადებითი კონტროლი (ყველა PrecisionAb ანტისხეული შეიცავს პოსტიურ საკონტროლო ლიზატს)
        • შეამოწმეთ ცილის ნიმუშების კონცენტრაცია (მაგ., ბრედფორდის ან ლოურის ცილის ანალიზის გამოყენებით)
        • ნიმუშის ჩატვირთვის ოპტიმიზაცია იხილეთ Western Blots პროტოკოლისთვის შესაბამისი ნიმუშის დატვირთვის განსაზღვრა
        • გაზარდეთ საწყისი მასალის რაოდენობა
        • ნიმუშის ფრაქციები ან კონცენტრირება ამ ტექნიკიდან ერთი ან მეტის გამოყენებით:

        02/28/23 09:32 AM AE,AI,AL,AM,AR,AT,AU,AZ,BA,BD,BE,BF,BG,BH,BN,BO,BR,BW,CA,CH,CL ,CM,CN,CO,CR,CY,CZ,DE,DK,DO,DZ,EC,EE,EG,EH,ER,ES,ET,FI,FM,FO,FR,GA,GE,GF,GH ,GP,GR,GT,GU,HK,HN,HR,HT,HU,ID,IE,IL,IN,IS,IT,JM,JO,JP,KE,KH,KR,KW,KZ,LB,LI ,LK,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,ML,MO,MQ,MS,MT,MU,MX,MY,NG,NI,NL,NO,NP,NZ,OM,PA,PE ,PF,PG,PH,PK,PL,PR,PS,PT,PW,PY,QA,RO,RS,RU,SA,SB,SE,SG,SI,SK,SN,ST,SV,TG,TH ,TN,TO,TR,TT,TW,TZ,UA,UG,UK,US,UY,UZ,VA,VE,VU,XK,YE,ZA,VN en LSR /LSR/Technologies/Western_Blotting N 0


        SACK #10: შემდგომი თანმიმდევრობის რეაქცია

        როგორ გავწმინდო ჩემი თანმიმდევრული შაბლონები?

        თანმიმდევრობის მონაცემების 10-20 bp, მაგრამ ასევე ართულებს საბაზისო გამოძახების პროგრამულ უზრუნველყოფას პოსტ-„blob“ პიკების ინტერპრეტაცია.

        ა) ეთანოლის ნალექი: იაფი, მარტივი და აწარმოებს კარგი ხარისხის მონაცემებს (Protocol_A [plates].docx) (Protocol_B [tubes].docx დააწკაპუნეთ Foil cap.jpg და 96-place racks.jpg ამ პროტოკოლებში გამოყენებული ორი ხელსაწყოს სანახავად. დამატებითი ინფორმაციისთვის ინფორმაცია, დააწკაპუნეთ EDTA წინააღმდეგ ნატრიუმის აცეტატის წინააღმდეგ დნმ-ის ნალექისთვის? და დააწკაპუნეთ 'Dump-&-Blot', პიპეტი, თუ 'spin-out' ეთანოლი?.

        ბ) ZR DNA Sequencing Clean-up Kit (ხელმისაწვდომია უშუალოდ Zymo Research-დან ან მისი დისტრიბუტორიდან, Genesee Scientific): მათთვის, ვინც უპირატესობას ანიჭებს სვეტის ტექნოლოგიებს ეთანოლით გაწმენდას, ეს Zymo პროდუქტი შეიძლება იყოს მისაღები ალტერნატივა და მწარმოებელი აცხადებს, რომ სვეტების რეგენერაცია შესაძლებელია 10X-მდე 0,1% HCl-ით. . თუმცა, ჩვენს ხელში, გაყოფილი რეაქციების პარალელურმა გასუფთავებამ გამოიწვია სიგნალის გაცილებით დაბალი ინტენსივობა Zymo სვეტიდან (ჩვენი ეთანოლ-EDTA პროტოკოლის წინააღმდეგ), რამაც შეიძლება გამოიწვიოს პრობლემები სუსტი თანმიმდევრობის რეაქციების საბაზისო გამოძახებასთან დაკავშირებით. გარდა ამისა, მიუხედავად იმისა, რომ პროტოკოლი ამტკიცებს, რომ ნიმუშები შეიძლება გამოირეცხოს 20% ფორმამიდში და ჩატარდეს პირდაპირ სეკვენსერზე, ჩვენ კატეგორიულად უარვყოფთ იმას, რომ ფორმამიდში წყალი იწვევს იონების წარმოქმნას, რომლებიც კონკურენციას უწევენ კაპილარებზე ინექციისთვის. სამაგიეროდ, გამორეცხვის შემდეგ, ნიმუშები უნდა გაშრეს და ხელახლა შეჩერდეს სუფთა HiDi ფორმამიდში. ალტერნატიულად, ზოგიერთ შემთხვევაში, ნიმუშები შეიძლება დარჩეს წყალში, იხილეთ როდის ხელახლა შეჩერდეს წყალში ფორმამიდის წინააღმდეგ? დამატებითი ინფორმაციისათვის.

        გ) კომერციული "გელ-ფილტრაციის" სვეტები: უფრო ძვირი. ზოგიერთი ადამიანი ცდილობს (როგორც ჩვენ გავაკეთეთ ერთ დროს) შეამციროს ხარჯები ამ სვეტების ხელახლა გამოყენებით მათი „გარეცხვის“ და ახალი „ბუფერით“ შენახვით. თუმცა, მიუხედავად იმისა, რომ ეს პროცესი შეიძლება განხორციელდეს თანმიმდევრობის გადატანის გარეშე ერთი გამოყენებადან მეორეზე, სვეტების ხელახალი გამოყენება იწვევს საღებავის ტერმინატორის არაინკორპორირებულ პიკებს.

        70 bp შევიდა დნმ-ის თანმიმდევრობაში. გარდა ამისა, პირველი გამოყენების შემდეგ, „გელის“ მცირე რაოდენობამ შეიძლება გადალახოს მემბრანა თეფშზე და დასრულდეს ნიმუშში, ეს გელი დააკავშირებს საღებავებით მონიშნულ პროდუქტებს, რაც გამოიწვევს სიგნალის ცუდ ინტენსივობას, გარდა იმ შემთხვევისა, როდესაც „გასუფთავებული“ ნიმუშები ნებადართულია ხელახლა შეჩერება რამდენიმე საათის განმავლობაში 4 o C-ზე. ამგვარად, ჩვენ საერთოდ შევწყვიტეთ კომერციული ფირფიტების გამოყენება, ნაცვლად იმისა, რომ გამოვიყენოთ იაფი და მაღალეფექტური EtOH-EDTA ვარიანტი.

        დ) CleanSEQ Agencourt-ის მიერ: ღირს

        SACK #12: მონაცემთა ანალიზი

        რამდენი დრო სჭირდება ჩემი თანმიმდევრობის მონაცემების მიღებას?

        2 სთ ერთი გაშვებისთვის (16 ნიმუში)

        6 სთ ნახევარი თეფშისთვის (48 ნიმუში) და,

        12 სთ სავსე ფირფიტაზე (96 ნიმუში).

        ბ) შეცვლილი გაშვების მოდულები: როგორც პატარა

        6 სთ სავსე ფირფიტაზე (მაგ., „M.L.=400“-ის არჩევისას -- რომელიც, როგორც წესი, წარმოქმნის

        500 bp მონაცემები). დამატებითი ინფორმაციისთვის იხილეთ „გაშვების დრო“ სექციაში რატომ აქვს მნიშვნელობა ჩემი ნიმუშების მდებარეობას 96 ჭაბურღილში?

        გ) შემობრუნების დრო: როგორც წესი, შედეგები ხელმისაწვდომია წარდგენიდან 1-3 სამუშაო დღის განმავლობაში.

        როგორ მივიღო ჩემი თანმიმდევრობის მონაცემები?

        ა) Genomic Facility ვებსაიტზე: როდესაც თქვენი თანმიმდევრობები მზად იქნება, თქვენ მიიღებთ ავტომატურ ელფოსტას, რომელიც მოგმართავთ „შესვლაზე“, დააწკაპუნეთ „ტესტის შედეგებზე“ და შემდეგ დააწკაპუნეთ თქვენი „მონაცემების“ ფაილის ბმულზე.

        ბ) "მონაცემების" ფაილები: "zipped", შემცირება

        30 Mb მონაცემები სრული ფირფიტიდან (96 ნიმუში) მდე

        10 Mb 60 დღის შემდეგ, ყველა ფაილი არქივდება.

        როგორ გავაანალიზო ჩემი მონაცემები?

        ა) ფორმატი: შედეგები ხელმისაწვდომია ტექსტური ფაილების და ელექტროფეროგრამების სახით.

        ი) ტექსტური ფაილები, ხელმისაწვდომი DNAStar-ის, BioEdit-ის ან Notepad-ის მეშვეობით.

        ii) ელექტროფეროგრამები, ხელმისაწვდომი უფასოდ (პროგრამული ბმულები):

        (1) Sequence Scanner v1.0 – ხარისხის კონტროლის შესანიშნავი ინსტრუმენტი
        (2) BioEdit - შესანიშნავი გასწორების ინსტრუმენტი და,
        (3) Chromas LITE.

        ბ) ხელახალი ანალიზი: 3130XL-ის თანმიმდევრობის ანალიზის პროგრამას ზოგჯერ შეუძლია გააუმჯობესოს თქვენი შედეგები, თუმცა, ასეთი ანალიზები ტარდება მხოლოდ კონკრეტული მოთხოვნის შემდეგ. გამოიყენეთ Sequence Scanner, რათა დაადგინოთ რომელი თანმიმდევრობების ხელახალი ანალიზი ღირს.

        რატომ გავაანალიზოთ მონაცემები Sequence Scanner-ით?

        თქვენი კვლევის კითხვებზე პასუხის გასაცემად, თქვენ შეგიძლიათ გააანალიზოთ თქვენი ელექტროფეროგრამები თქვენი არჩევანის ნებისმიერი პროგრამული უზრუნველყოფით. ფაქტობრივად, მრავალი სხვა პროგრამა სჯობს Sequence Scanner-ს თანმიმდევრობის მონაცემების მანიპულირების თვალსაზრისით. თუმცა, რამდენიმე &ndash თუ რომელიმე &ndash შეიძლება ემთხვეოდეს Sequence Scanner-ს (უფასოდ) თქვენი თანმიმდევრობის მონაცემების ხარისხის გამოსაკვლევად და თანმიმდევრობის პრობლემების გადაჭრაში დასახმარებლად. გადადით "ბმულებზე" Sequence Scanner ან სხვა დნმ ანალიზის პროგრამული უზრუნველყოფის ჩამოსატვირთად.

        როდის უნდა მოხდეს ჩემი მონაცემების ხელახალი ანალიზი Sequencing Analysis v5.2-ით?

        .70/ნიმუში, მაგრამ იძლევა უკიდურესად სუფთა დნმ-ს და განსაკუთრებული თანმიმდევრობის წაკითხვას. გთხოვთ, გვეწვიოთ ამ მეთოდის გამოყენებამდე. ახლა არის სხვა მსგავსი პროდუქტები, რომლებიც, როგორც ცნობილია, ისეთივე ეფექტურია, მაგრამ ბევრად უფრო იაფი.

        ე) BigDye® XTerminator™ გამწმენდი ნაკრები (ThermoFisher Part #s 4376484-4376486): 2021 წლის ივნისის მდგომარეობით, ჩამონათვალის ფასი მერყეობს $2,35/rxn-დან (1000 rxn ნაკრები) 1,53/rxn-მდე (2500 rxn ნაკრები). გამყიდველი ამტკიცებს, რომ საღებავის ლაქების სრული მოცილება და უკეთესი თანმიმდევრობის შედეგების საერთო მეთოდი მოითხოვს მხოლოდ ორი რეაგენტის დამატებას (თანმიმდევრობით ან წინასწარ შერეული), რასაც მოჰყვება მორევა 30 წუთის განმავლობაში.

        ჩვენს ტესტებში, XTerminator კარგად მუშაობდა და იყო ძალიან მარტივი გამოსაყენებლად (ნიმუშები არასოდეს იშლება და არ ჩერდება). თუმცა, ჩვენმა EtOH-ნალექის გასუფთავებამ მისცა თანმიმდევრობის იგივე ხარისხი და დამატებითი 70-100 bp მიმდევრობა (>900 bp vs.

        830 bp BDx-სთვის). მიუხედავად ამისა, იმის გათვალისწინებით, რომ თანმიმდევრული პროდუქტის ან სიგნალის სიძლიერის აბსოლუტურად არანაირი დანაკარგი არ არის, ეს მეთოდი შეიძლება იყოს შესანიშნავი არჩევანი, თუ თქვენს რეაქციებს, როგორც წესი, აქვს დაბალი სიგნალის სიძლიერე.

        გაფრთხილება: BDx-ის გამოყენება მოითხოვს სპეციალურ გაშვების მოდულს 3130xl-ზე, რათა არ მოხდეს მასივის დაზიანება, ასევე, გარკვეული სიფრთხილის ზომები უნდა იქნას დაცული თავად გაწმენდის დროს. გთხოვთ, გვეწვიოთ ამ მეთოდის გამოყენებამდე.

        EDTA ნატრიუმის აცეტატის წინააღმდეგ დნმ-ის ნალექისთვის?

        მიუხედავად იმისა, რომ ჩვენ გირჩევთ გამოიყენოთ EDTA, შეგიძლიათ გამოიყენოთ ნატრიუმის აცეტატი თქვენი თანმიმდევრული დნმ-ის დასალექად. თუმცა, ჩვენი გამოცდილებით, ლაბორატორიებს, რომლებიც იყენებენ ნატრიუმის აცეტატს, უფრო დიდი პრობლემები აქვთ არაინკორპორირებული საღებავის ტერმინატორების ამოღებისას, ვიდრე ლაბორატორიებს, რომლებიც იყენებენ EDTA-ს.

        შედეგად, ნატრიუმის აცეტატის გამოყენებით ლაბორატორიული ნიმუშები, როგორც წესი, აქვთ მასიური პიკი ყოველი ელექტროფეროგრამის პირველ 50-80 bp-ში, რაც ანადგურებს.

        10-20 bp მონაცემები. გარდა ამისა, იმის გამო, რომ საბაზისო გამოძახების პროგრამული უზრუნველყოფა ასწორებს ყველა მწვერვალს უმაღლეს დაფიქსირებულ მწვერვალებამდე, საღებავის ტერმინატორის ეს პიკი ასევე იწვევს რეალური მწვერვალების „დაშლას“ და ართულებს პროგრამულ უზრუნველყოფას კვალის მონაცემების გაშიფვრას.

        ABI-ს პროდუქტის ჩანართში (pdf) BigDye Terminator Mix v3.1 (cms_041329.pdf) ჩამოთვლილია ეთანოლის დალექვის ორი მეთოდი: EtOH&ndashEDTA და, EtOH & ndashEDTA & ნატრიუმის აცეტატი. ორივე მეთოდს აქვს სარგებელი და ზიანი და არცერთი არ იყენებს ნატრიუმის აცეტატს EDTA-ს გარეშე.

        'Dump-&-Blot', პიპეტი, თუ 'spin-out' ეთანოლი?

        10-20 bp მონაცემები. განსაკუთრებით მაღალი UDT დონეებით, მეორადი მწვერვალები ჩნდება დაახლოებით 40 bp მოგვიანებით და ზოგჯერ ჩნდება მესამეული მწვერვალებიც კი. მეორე, პროგრამული უზრუნველყოფა ასწორებს ყველა მწვერვალს უმაღლეს დაფიქსირებულ მწვერვალებამდე, ამდენად, თქვენი რეალური მწვერვალები "დაიჩეხება", რაც ართულებს პროგრამულ უზრუნველყოფას კვალის მონაცემების გაშიფვრას და განსაკუთრებით თქვენი თანმიმდევრობის ბოლოსკენ. ქვემოთ მოყვანილი მეთოდები დალაგებულია UDT-ების სრულად ამოღების შესაძლებლობის მიხედვით.

        როგორ გავაჩეროთ გასუფთავებული, თანმიმდევრული შაბლონები?

        ა) მშრალი: დარწმუნდით, რომ ნიმუშები მთლიანად მშრალია (ანუ მთელი წყალი და ეთანოლი ამოღებულია). თუ იყენებთ თერმოციკლერს ნიმუშების გასაშრობად და მშრალი ციკლის „შეკავებით“ დასრულებას, დარწმუნდით, რომ „შეკავების“ ტემპერატურა არის &g25 o C (ანუ ოთახის ტემპერატურაზე რამდენიმე გრადუსი უნდა იყოს) დაბალ ტემპერატურაზე შენარჩუნებამ შეიძლება გამოიწვიოს ოთახის ტენიანობა ნიმუშებში კონდენსირებულია, რამაც შეიძლება დააქვეითოს BigDye. განსაკუთრებით G-nts.

        ბ) ხელახლა შეჩერება: ნიმუშებთან ერთად ჭებში დაამატეთ 15 მკლ Hi-Di ფორმამიდი. დამატებითი ინფორმაციისთვის იხილეთ რა სახის ფორმამიდი უნდა გამოვიყენო? და რატომ შევინარჩუნოთ ფორმამიდი "მშრალად"?.

        ი) არ შექმნათ „16-იანი ნაკრები“ ფორმამიდის ცარიელ ჭებში ჩასვით, შესაძლოა დაგვჭირდეს ისინი!
        ii) ნიმუშები დალუქეთ მსუბუქად მორევით (სურვილისამებრ, გააკეთეთ ეს მხოლოდ იმ შემთხვევაში, თუ ლუქის მთლიანობა ნამდვილად არის უზრუნველყოფილი) და, მოკლედ, ცენტრიფუგა (შენახვა 4 o C ტემპერატურაზე ან გაყინვა).

        გ) Პარამეტრები: იხილეთ როდის ხელახლა შეჩერდეს წყალში ფორმამიდის წინააღმდეგ? დამატებითი ინფორმაციისათვის.

        როდის ხელახლა შეჩერდეს წყალში ფორმამიდის წინააღმდეგ?

        კარგი ტექნიკით, სიგნალის სიძლიერე უნდა იყოს მინიმალურ ზღვარზე მაღლა, როდესაც ნიმუშები ხელახლა შეჩერებულია ფორმამიდში. თუმცა, თუ სიგნალის სიძლიერე პრობლემას წარმოადგენს თქვენი სიტუაციის საფუძვლიანად აღმოფხვრის შემდეგაც, განიხილეთ თქვენი ნიმუშების ხელახლა შეჩერება წყალში, რადგან ამან შეიძლება გაზარდოს სიგნალის სიძლიერე &ge10X-ით. მიუხედავად ამისა, გთხოვთ გაითვალისწინოთ ქვემოთ ჩამოთვლილი 'გაფრთხილება':

        სიფრთხილე 1: ნიმუშები უნდა დაიფაროს მინერალური ზეთით დაჟანგვის თავიდან ასაცილებლად და ნიმუშის აორთქლება. ზეთის გადაფარვის გარეშე, თქვენი ნიმუშები შეიძლება არსებითად დაქვეითდეს, თუ ისინი არ იქნა გამოყენებული გადაფარვით ხელახლა შეჩერების შემდეგ, თანმიმდევრული დნმ თითქმის ისეთივე სტაბილურია წყალში, როგორც ფორმამიდში. გარდა ამისა, თქვენი ხელახლა შეჩერებული ნიმუშების გაყინვა 3130XL ინსტრუმენტზე დაყენებამდე შეიძლება დაეხმაროს დეგრადაციის შეზღუდვას.

        სიფრთხილე 2: ზეთის გადაფარვის გამოტოვების შემთხვევაში, ხელახლა შეაჩერეთ &ge20-&მიკროლ წყალში, რათა მინიმუმამდე დაიყვანოთ იმის ალბათობა, რომ აორთქლება შეამცირებს ნიმუშის მოცულობას მინიმუმამდე, რაც საჭიროა კაპილარული მასივის ქინძისთავები ნიმუშებთან კარგი კონტაქტისთვის. ცუდი კონტაქტი გამოიწვევს სიგნალის შემცირებას, რა თქმა უნდა, კონტაქტი არ გამოიწვევს წარუმატებელ ინექციებს. ABI განსაზღვრავს მინიმუმ 7-µl-ს, მაგრამ აღნიშნავს, რომ ავტომატური შერჩევისას მცირედი დახრილობაც კი შეიძლება ნიშნავდეს, რომ >7-µl საჭირო იქნება ზოგიერთ ჭაბურღილში, შესაბამისად, ჭეშმარიტი მინიმუმი უფრო ჰგავს 10-µl-ს. არ იფიქროთ, რომ ნიმუშების დაფარვა სეპტა ხალიჩით გაუმკლავდება ამ პრობლემას, წყალი ადვილად აორთქლდება სეპტის ხალიჩის მეშვეობით, მაშინაც კი, როცა 3130xl სეკვენსერშია. აორთქლების სიხშირე განსხვავდება სეკვენსერებს შორის (შესაძლოა მათი მდებარეობის გამო ოთახის ჰაერის სადინარებთან მიმართებაში), თუმცა, ჩვენს დაწესებულებაში, მარტოხელა სრული 96 ჭაბურღილის ფირფიტა, საწყისი მოცულობა 20-& მიკროლი საკმარისი იყო. როგორც ამას სჭირდება

        12 საათის განმავლობაში სრული 96 ჭაბურღილის ფირფიტის გასაშვებად (სტანდარტული გაშვების მოდულის POP7-ისთვის და 50 სმ მასივის გამოყენებით), წყალში ხელახლა შეჩერებული ნიმუშები (ზეთის გადაფარვის გარეშე) ჯერ უნდა ჩატარდეს, თუ >1 ფირფიტა დატვირთულია ინსტრუმენტზე.

        სიფრთხილე 3: თუ განიხილავთ ამ ვარიანტს (ანუ წყლის ხელახალი შეჩერება), გთხოვთ, გაითვალისწინოთ, რომ ზედმეტად ძლიერი სიგნალი ამცირებს წაკითხვის ხანგრძლივობას.

        სიფრთხილე 4ფორმამიდში ნიმუშების ხელახალი შეჩერების ერთ-ერთი მიზანია დნმ-ის შენარჩუნება დენატურულ მდგომარეობაში. ჯერჯერობით, ჩვენ ვერ შევამჩნიეთ რაიმე პრობლემა ფორმამიდის ნაცვლად წყლის გამოყენებასთან დაკავშირებით, თუმცა, წყალში ხელახალი სუსპენზია შეიძლება იყოს შეუსაბამო, თუ თქვენს შაბლონებს შეუძლიათ შექმნან მნიშვნელოვანი მეორადი სტრუქტურა.

        რა სახის ფორმამიდი უნდა გამოვიყენო?

        როდესაც გამოიყენება დნმ-ის თანმიმდევრობის პროდუქტების ხელახლა შესაჩერებლად, მაღალი ხარისხის ფორმამიდი აუცილებელია რეპროდუცირებადი მონაცემებისთვის, ამიტომ ჩვენ გირჩევთ გამოიყენოთ ABI-ის Hi-Di ფორმამიდი. სხვა კომერციული მომწოდებლებისგან შეძენილი ფორმამიდი ხშირად დაბინძურებულია წყლით და არასასურველი ორგანული და არაორგანული იონებით. გარდა ამისა, ფორმამიდი ხშირად მიწოდებულია მინის ბოთლებში, რომელიც (გახსნისას) ავლენს ფორმამიდს ჰაერში და საშუალებას აძლევს ფორმამიდს შეიწოვოს წყალი. მინერალები ასევე შეიძლება ჩამოირეცხოს მინიდან ფორმამიდში.

        საჭირო სიწმინდის ხარისხის გასაგებად, აქ არის მოკლე აღწერა ნედლეული ფორმამიდის მომზადების პროცესის დნმ-ის თანმიმდევრობის გამოსაყენებლად. პირველ რიგში, ნედლი (დეიონიზაციამდე) ფორმამიდი უნდა იყოს &g99,5% სისუფთავე, ჰქონდეს დაბალი წყლის შემცველობა, შეფუთული იყოს ინერტული აირის ქვეშ და ჰქონდეს გამტარობა.

        100 µSiemens/სმ. მინარევები (როგორიცაა ამონიუმის და ფორმატის იონები) ამოღებულია ნედლი ფორმამიდის გავლის გზით შერეული ფენის ფისში, რომელიც შეიცავს სპეციფიკურ ძლიერ იონგაცვლის ფუნქციურ ჯგუფებს (კატიონური და ანიონური). საბოლოოდ, ტუტე EDTA (200 მმ, წყლის დამატების შესამცირებლად) ემატება დეიონიზებულ ფორმამიდს, რათა მოხდეს მისი სტაბილიზაცია და დნმ-ის ელექტროკინეტიკური ინექციის გასაადვილებლად. დამატებითი დეტალებისთვის იხილეთ რატომ უნდა შეინახოთ ფორმამიდი „მშრალად“? და მიმოხილვა ABI Publication 4315832C.

        რატომ ინახება ფორმამიდი "მშრალად"?

        ფორმამიდი შეინახეთ საყინულეში, რათა თავიდან აიცილოთ წყლის აბსორბცია, როდესაც ელოდებით ფორმამიდის განმეორებით გამოყენებას დღის განმავლობაში, შეგიძლიათ შეინახოთ მცირე რაოდენობა მაცივარში. წყალი ნელა რეაგირებს ფორმამიდთან და წარმოქმნის ჭიანჭველას (მეთანომჟავას) და ამიაკას. როგორც Formamide_water.jpg-შია ნაჩვენები, ამ რეაქციის იონური პროდუქტები იწვევს ორ პრობლემას:

        რატომ ზღუდავს ფორმამიდის გაყინვა-დათბობის ციკლებს?

        ფორმამიდი შეინახეთ საყინულეში, რათა თავიდან აიცილოთ წყლის აბსორბცია, როდესაც ელოდებით ფორმამიდის განმეორებით გამოყენებას დღის განმავლობაში, შეგიძლიათ შეინახოთ მცირე რაოდენობა მაცივარში. წყალი ნელა რეაგირებს ფორმამიდთან და წარმოქმნის ჭიანჭველას (მეთანომჟავას) და ამიაკას.

        ამონაწერი დნმ-ის ფრაგმენტების ანალიზის 82-ე გვერდიდან CE Chemistry Guide.pdf (PN 4474504, Revision B):


        ცნობები

        ფრიდ, M. & amp Crothers, D.M. Lac რეპრესორ-ოპერატორის ურთიერთქმედების წონასწორობა და კინეტიკა პოლიაკრილამიდის გელის ელექტროფორეზით. Nucleic Acids Res. 9, 6505–6525 (1981).

        გარნერი, მ.მ. & Revzin, A.გელ-ელექტროფორეზის მეთოდი ცილების დაკავშირების რაოდენობრივად განსაზღვრისთვის დნმ-ის კონკრეტულ რეგიონებთან: გამოყენება დნმ-ის კომპონენტებზე ეშერიხია კოლი ლაქტოზას ოპერონის მარეგულირებელი სისტემა. Nucleic Acids Res. 9, 3047–3060 (1981).

        ფრიდმა, მ.გ. ცილა-დნმ ურთიერთქმედების პარამეტრების გაზომვა ელექტროფორეზის მობილურობის ცვლის ანალიზით. ელექტროფორეზი 10, 366–376 (1989).

        გარნერი, მ.მ. & Revzin, A. გელ-ელექტროფორეზის გამოყენება ნუკლეინის მჟავა-ცილის ურთიერთქმედების აღმოსაჩენად და შესასწავლად. ტენდენციები ბიოქიმია. მეცნიერება. 11, 395–396 (1986).

        ფრიდმა, მ.გ. & Crothers, D.M. ციკლური-AMP რეცეპტორის ცილა-დნმ ურთიერთქმედების წონასწორული კვლევები. ჯ.მოლი. ბიოლ. 172, 241–262 (1984).

        Lohman, T.M., Dehaseth, P.L. & Record, M.T. პენტალიზინ-დეოქსირიბონუკლეინის მჟავას ურთიერთქმედება: იონის კონცენტრაციის ზოგადი ზემოქმედების მოდელი ნუკლეინის მჟავებთან ცილების ურთიერთქმედებებზე. ბიოქიმია 19, 3522–3530 (1980).

        Lohman, T.M., DeHaseth, P.L. & Record, M.T. იონების კონცენტრაციის ზემოქმედების ანალიზი ცილა-ნუკლეინის მჟავას ურთიერთქმედების კინეტიკაზე. გამოყენება Lac-ის რეპრესორ-ოპერატორის ურთიერთქმედებებზე. ბიოფისი. ქიმ. 8, 281–294 (1978).

        ფრიდმა, მ.გ. & Crothers, D.M. კინეტიკა და მექანიზმი გენის მარეგულირებელი ცილების რეაქციაში დნმ-თან. ჯ.მოლი. ბიოლ. 172, 263–282 (1984).

        Gadgil, H., Jurado, L.A. & Jarrett, H.W. ტრანსკრიფციის ფაქტორების დნმ-ის აფინურობის ქრომატოგრაფია. ანალური. ბიოქიმი. 290, 147–178 (2001).

        მოქსლი, რ.ა., ჯარეტი, ჰ.ვ. & Mitra, S. ტრანსკრიფციის ფაქტორის გამოყოფის მეთოდები. J. ქრომატოგრ. ბ ანალიტი. ტექნოლ. ბიომედი. Life Sci. 797, 269–288 (2003).

        პინოლომა, ს., ჩოი, ი.დ. & Dreyfuss, G. ჰეტეროგენული ბირთვული რიბონუკლეოპროტეინის ნაწილაკების გაწმენდისა და დახასიათების იმუნოლოგიური მეთოდები. მეთოდები Enzymol. 181, 317–325 (1990).

        ნორდჰოფი, ე. და სხვ. დნმ-ის დამაკავშირებელი ცილების სწრაფი იდენტიფიკაცია მას-სპექტრომეტრიით. ნატ. ბიოტექნოლოგი. 17, 884–888 (1999).

        იანევა, მ. ანალური. ქიმ. 75, 6437–6448 (2003).

        Woo, A.J., Dods, J.S., Susanto, E., Ulgiati, D. & Abraham, L.J. პროტეომიკის მიდგომა დნმ-ის დამაკავშირებელი აქტივობების იდენტიფიკაციისთვის, რომელიც დაფიქსირდა ელექტროფორეზული მობილობის ცვლის ანალიზში. მოლ. უჯრედი. პროტეომიკა 1, 472–478 (2002).

        სტედი, J.A., Keen, J.N. & amp McDowall, K.J. ნუკლეინის მჟავას ურთიერთქმედების პროტეინების იდენტიფიკაცია მარტივი პროტეომიკაზე დაფუძნებული მიდგომის გამოყენებით, რომელიც პირდაპირ აერთიანებს ელექტროფორეზული მობილობის ცვლის ანალიზს. მოლ. უჯრედი. პროტეომიკა 5, 1697–1702 (2006).

        იმედი, ი.ა. & Struhl, K. ევკარიოტული ტრანსკრიპციული აქტივატორი ცილის ფუნქციური დისექცია, საფუარის GCN4. უჯრედი 46, 885–894 (1986).

        Bremer, H. & Dennis, P. ქიმიური შემადგენლობის და უჯრედის სხვა პარამეტრების მოდულაცია ზრდის ტემპით. in Escherichia coli და Salmonella: უჯრედული და მოლეკულური ბიოლოგია (რედ. Neidhardt, F.C.) 1553–1569 (ASM Press, Washington D.C., 1996).

        Sherman, F. საფუარის დაწყება. in სახელმძღვანელო საფუარის გენეტიკასა და მოლეკულურ და უჯრედულ ბიოლოგიაში, ნაწილი B (eds. Guthrie, C. and Fink, G.R.) 3–41 (Academic Press, San Diego, 2002).

        Jackson, S.P. & Tjian, R. რნმ პოლიმერაზა II ტრანსკრიფციის ფაქტორების გაწმენდა და ანალიზი ხორბლის ჩანასახ-აგლუტინინის აფინური ქრომატოგრაფიის გამოყენებით. პროკ. ნატლ. აკად. მეცნიერება. აშშ 86, 1781–1785 (1989).

        ღაემმაღამი, ს. და სხვ. ცილის გამოხატვის გლობალური ანალიზი საფუარში. Ბუნება 425, 737–741 (2003).

        უგურუ, გ. და სხვ. აქტინორჰოდინის ბიოსინთეზური გენების გზის სპეციფიკური რეგულატორის ტრანსკრიპციული გააქტიურება Streptomyces coelicolor. მოლ. მიკრობიოლი. 58, 131–150 (2005).

        ალენი, ს.ვ. & ამპერ მილერი, ე.ს. რნმ-ის დამაკავშირებელი თვისებები ინ ვიტრო გამოხატული ჰისტიდინით მონიშნული RB69 RegA მთარგმნელობითი რეპრესორული ცილა. ანალური. ბიოქიმი. 269, 32–37 (1999).

        კალაგანი, ა.ჯ. და სხვ. სტრუქტურა ეშერიხია კოლი RNase E კატალიზური დომენი და გავლენა რნმ-ის ბრუნვაზე. Ბუნება 437, 1187–1191 (2005).

        Jiao, X., Trifillis, P. & Kiledjian, M. სამიზნე მესინჯერის რნმ სუბსტრატების იდენტიფიკაცია აზოოსპერმიის მსგავს რნმ-შემაკავშირებელ ცილაში წაშლილი თაგვისთვის. ბიოლ. რეპროდ. 66, 475–485 (2002).

        Kaberdin, V.R., Chao, Y.H. & Sue, L.C. RNase E იშლება რნმ I-ის ღეროვანი მარყუჟების ბუშტულ რეგიონებში მრავალ ადგილას, რაც იძლევა ფერმენტისგან განსხვავებულად დისოციაციას. ჯ.ბიოლ. ქიმ. 271, 13103–13109 (1996).

        სენგუპტა, ტ.კ., გორდონი, ჯ. და ამპერ სპაისერი, ე.კ. RegA პროტეინებს ფაგის T4 და RB69 კონსერვაცია აქვთ სპირალის მარყუჟის რნმ-ის შემაკავშირებელ მოტივებს, მაგრამ განსხვავებული რნმ-ის დამაკავშირებელ სპეციფიკას. Nucleic Acids Res. 29, 1175–1184 (2001).

        Ta, M. & Vrati, S. Mov34 ცილა თაგვის ტვინიდან ურთიერთქმედებს იაპონური ენცეფალიტის ვირუსის მე-3 არაკოდირებულ რეგიონთან. ჯ.ვიროლი. 74, 5108–5115 (2000).

        გრუნვალდი, M.E., Yu, W.P., Yu, H.H. & Yau, K.W. დომენის იდენტიფიცირება როდ cGMP-შეზღუდული კათიონური არხის ბეტა-ქვეერთეულზე, რომელიც შუამავლობს კალციუმ-კალმოდულინის ინჰიბირებას. ჯ.ბიოლ. ქიმ. 273, 9148–9157 (1998).

        Dangerfield, J.A., Windbichler, N., Salmons, B., Gunzburg, W.H. & Schroder, R. StreptoTag მეთოდის გაძლიერება ენდოგენურად გამოხატული ცილების იზოლირებისთვის რთული რნმ-ის დამაკავშირებელი სამიზნეებით. ელექტროფორეზი 27, 1874–1877 (2006).

        Bachler, M., Schroeder, R. & von Ahsen, U. StreptoTag: ახალი მეთოდი რნმ-შემაკავშირებელი ცილების იზოლაციისთვის. რნმ 5, 1509–1516 (1999).

        მოქსლი, რ.ა. და ჯარეტი, ჰ.ვ. ოლიგონუკლეოტიდის დაჭერის მეთოდი ტრანსკრიფციის ფაქტორის გამწმენდის სისტემატური ოპტიმიზაციისთვის ელექტროფორეზული მობილობის ცვლის ანალიზის გამოყენებით. J. ქრომატოგრ. ა 1070, 23–34 (2005).

        Gadgil, H. & amp Jarrett, H.W. ტრანსკრიფციის ფაქტორების გასაწმენდად ოლიგონუკლეოტიდის დაჭერის მეთოდი. J. ქრომატოგრ. ა 966, 99–110 (2002).

        Buratowski, S. & Chodosh, L.A. მობილურობის ცვლის დნმ-ის შებოჭვის ანალიზი გელის ელექტროფორეზის გამოყენებით. in მიმდინარე პროტოკოლები მოლეკულურ ბიოლოგიაში (eds. Ausubel, F.M. et al.) 12.12.11–12.12.11 (John Wiley and Sons, New York, 1996).

        Lane, D., Prentki, P. & Chandler, M. გელის ჩამორჩენის გამოყენება ცილა-ნუკლეინის მჟავას ურთიერთქმედების გასაანალიზებლად. მიკრობიოლი. რევ. 56, 509–528 (1992).

        ფრიდმა, მ.გ. & Garner, M.M. ელექტროფორეზული მობილობის ცვლის ანალიზი (EMSA) ცილა-დნმ ურთიერთქმედების გამოვლენისა და ანალიზისთვის. in მოლეკულური ბიოლოგიის მეთოდები და აპლიკაციები (რედ. Tietz, D.) 239–271 (Elsevier, New York, 1998).

        კერი, ჯ. გელის ჩამორჩენა. მეთოდები Enzymol. 208, 103–117 (1991).

        Hellman, L.M. & Fried, M. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) ცილა-ნუკლეინის მჟავას ურთიერთქმედებისთვის. ნატ. პროტოკ. 2, 1849–1861 (2007).

        Li, Y., Jiang, Z.Z., Chen, H.X. & Ma, W.J. მოდიფიცირებული რაოდენობრივი EMSA და მისი გამოყენება რნმ-პროტეინის ურთიერთქმედების შესწავლაში. ჯ.ბიოქიმი. ბიოფისი. მეთოდები 60, 85–96 (2004).

        Kang, J., Lee, M.S. & გორენშტეინი, დ.გ. ქიმილუმინესცენციის სიგნალების რაოდენობრივი ანალიზი გაგრილებული მუხტით დაწყვილებული მოწყობილობის კამერის გამოყენებით. ანალური. ბიოქიმი. 345, 66–71 (2005).

        ფორვუდი, ჯ.კ. & Jans, D.A. დნმ-პროტეინის ურთიერთქმედების რაოდენობრივი ანალიზი ორმაგი მარკირებული გელის ელექტროფორეზისა და ფლუორესცენციის საფუძველზე გამოსახულების გამოყენებით. ელექტროფორეზი 27, 3166–3170 (2006).

        Jing, D., Agnew, J., Patton, W.F., Hendrickson, J. & Beechem, J.M. მგრძნობიარე ორი ფერის ელექტროფორეზული მობილურობის ცვლის ანალიზი გელებში ნუკლეინის მჟავების და პროტეინის გამოსავლენად. პროტეომიკა 3, 1172–1180 (2003).

        Vossen, K.M., Wolz, R., Daugherty, M.A. & Fried, M.G. მაკრომოლეკულური ჰიდრატაციის როლი შეკავშირებაში ეშერიხია კოლი ციკლური AMP რეცეპტორი დნმ-ზე. ბიოქიმია 36, 11640–11647 (1997).

        გარნერი, მ.მ. & Rau, D.C. წყლის გამოყოფა ასოცირებული გალის რეპრესორის სპეციფიკურ შეკავშირებასთან. EMBO ჯ. 14, 1257–1263 (1995).

        შევჩენკო, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J.V. & Mann, M. In-gel digestion ცილების და პროტეომების მასის სპექტრომეტრიული დახასიათებისთვის. ნატ. პროტოკ. 1, 2856–2860 (2006).

        Carrette, O., Burkhard, P., Sanchez, J.-C. & Hochstrasser, D. უახლესი ორგანზომილებიანი გელის ელექტროფორეზი: პროტეომიკის კვლევის ძირითადი ინსტრუმენტი. ნატ. პროტოკ. 1, 812–823 (2006).

        Chevallet, M., Luche, S. & Rabilloud, T. ცილების ვერცხლის შეღებვა პოლიაკრილამიდის გელებში. ნატ. პროტოკ. 1, 1852–1858 (2006).

        Havlis, J., Thomas, H., Sebela, M. & Shevchenko, A. სწრაფი რეაგირების პროტეომიკა ცილების დაჩქარებული გელში მონელებით. ანალური. ქიმ. 75, 1300–1306 (2003).

        კაბერდინი, ვ.რ. & amp McDowall, K.J. ზიმოგრაფიის გამოყენების გაფართოება მცირე, განსაზღვრული სუბსტრატების გელის მატრიქსთან ქიმიური შეერთებით. გენომის რეზ. 13, 1961–1965 (2003).


        Უყურე ვიდეოს: იზოლაციის პოვნა გემზე დავრდა 220 ვოლტის იზოლაცია (აგვისტო 2022).