ინფორმაცია

წითელი ტრანსკრიპციული რეპორტიორი Psudomonas putida-ში

წითელი ტრანსკრიპციული რეპორტიორი Psudomonas putida-ში



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

მე უნდა ავაშენო ტრანსკრიპციული რეპორტიორი პ.პუტიდა მაღალი აგზნების ტალღის სიგრძით, ფოტოტოქსიკურობის შესამცირებლად (აქამდე ვიყენებ mNeonGreen-ს და მინდა ვცადო რამე წითელი).

ჩემმა კოლეგებმა მითხრეს, რომ წინა მცდელობები mCherry-თან და mKate2-თან ვერ მოხერხდა, რადგან:

  • როგორც ჩანს, mCherry-ს აქვს ძალიან გრძელი მომწიფების დრო, რომელიც არ არის შესაფერისი ჩემი ექსპერიმენტებისთვის
  • mKate2 საერთოდ არ აჩვენა რაიმე გამოხატულება

ვინმეს აქვს გამოცდილება ტრანსკრიპციულ რეპორტიორებთან პ.პუტიდა? რაიმე იდეა? (DsRed? ხელახლა სცადეთ mKate-ით?)

მე ვზომავ PsrI (სიდეროფორის წარმოქმნის სიგმა ფაქტორი) რეგულირებული გენის ექსპრესიას.


ლანთანიდების ფუნქციური როლი ფერმენტულ აქტივობაში და PQQ-დამოკიდებული ალკოჰოლის დეჰიდროგენაზების ტრანსკრიპციულ რეგულირებაში Pseudomonas putida KT2440

ალკოჰოლებისა და ალდეჰიდების დაჟანგვა გადამწყვეტია სხვადასხვა აქროლადი ორგანული ნაერთების (VOCs) დეტოქსიკაციისა და ეფექტური კატაბოლიზმისთვის. ამრიგად, ბევრ გრამუარყოფით ბაქტერიას განუვითარდა პერიპლაზმური დაჟანგვის სისტემები, რომლებიც დაფუძნებულია პიროლოქინოლინ ქინონზე დამოკიდებულ ალკოჰოლის დეჰიდროგენაზებზე (PQQ-ADHs), რომლებიც ხშირად ფუნქციურად ზედმეტია. ნიადაგში მცხოვრები მოდელის ორგანიზმიდან გასუფთავებული ფერმენტების გამოყენება Pseudomonas putida KT2440, წინამდებარე კვლევა იუწყება ლანთანიდზე დამოკიდებული PQQ-ADH (PedH) პირველი აღწერა და დახასიათება არამეთილოტროფულ ბაქტერიაში. PedH ავლენს ფერმენტულ აქტივობას სუბსტრატის მსგავს დიაპაზონში, როგორც მისი Ca 2+ დამოკიდებულ კოლეგა PedE, მათ შორის ხაზოვანი და არომატული პირველადი და მეორადი სპირტები, ასევე ალდეჰიდები, თუმცა, მხოლოდ ლანთანიდის იონების თანდასწრებით, მათ შორის La 3+, Ce 3+. Pr 3+, Sm 3+ ან Nd 3+. რეპორტიორთა ანალიზებმა აჩვენა, რომ PedH-ს არა მხოლოდ აქვს კატალიზური ფუნქცია, არამედ მონაწილეობს ტრანსკრიპციულ რეგულირებაში. პედE და pedH, სავარაუდოდ მოქმედებს როგორც სენსორული მოდული. აღსანიშნავია, რომ ძირითადი მარეგულირებელი ქსელი რეაგირებს ლანთანუმზე სულ მცირე 1-10 ნმ, კონცენტრაცია, რომელიც ითვლება ეკოლოგიურად მნიშვნელოვანი. წინამდებარე კვლევა ასევე აჩვენებს, რომ PQQ-დამოკიდებული დაჟანგვის სისტემა გადამწყვეტია ეფექტური ზრდისთვის სხვადასხვა აქროლად ალკოჰოლთან ერთად. ამ შედეგებიდან ჩვენ დავასკვნათ, რომ PedE-სა და PedH-ის ფუნქციური ჭარბი და ინვერსიული რეგულირება წარმოადგენს ადაპტირებულ სტრატეგიას პ.პუტიდა KT2440 ზრდის ოპტიმიზაციას არასტაბილურ სპირტებთან ერთად ლანთანიდის სხვადასხვა ხელმისაწვდომობის საპასუხოდ.

მნიშვნელობა მათი დაბალი ბიოშეღწევადობის გამო, ლანთანიდები დიდი ხანია განიხილება, როგორც ბიოლოგიურად ინერტული. თუმცა, ბოლო წლებში ლანთანიდების, როგორც მეთილოტროფული ბაქტერიების კოფაქტორის იდენტიფიცირებამ დიდი ინტერესი გამოიწვია სხვადასხვა ბიოლოგიურ სფეროებში. წინამდებარე კვლევა ცხადყოფს, რომ მოდელი ორგანიზმის მიერ წარმოებული ორი PQQ-ADH-დან ერთ-ერთი პ.პუტიდა KT2440 ასევე იყენებს ლანთანიდებს, როგორც კოფაქტორს, რითაც აფართოებს ლანთანიდის ფარგლებს, რომლებიც იყენებს ბაქტერიებს მეთილოტროფების მიღმა. მეთილოტროფული ბაქტერიების მსგავსად, კომპლექსური მარეგულირებელი ქსელი ჩართულია ლანთანიდზე პასუხისმგებელ გადამრთველში ორ PQQ-ADH-ს შორის, რომლებიც კოდირებულია პ.პუტიდა KT2440. ჩვენ ასევე ვაჩვენებთ, რომ მინიმუმ ერთი ფერმენტის ფუნქციური წარმოება გადამწყვეტია ეფექტური ზრდისთვის რამდენიმე აქროლად ალკოჰოლთან ერთად. საერთო ჯამში, ჩვენი კვლევა იძლევა ახალ გაგებას PQQ-ADH-ების სიჭარბის შესახებ, რომელიც შეინიშნება ბევრ ორგანიზმში და კიდევ უფრო ხაზს უსვამს ლანთანიდების მნიშვნელობას ბაქტერიული მეტაბოლიზმისთვის, განსაკუთრებით ნიადაგის გარემოში.


წითელი ტრანსკრიპციული რეპორტიორი Psudomonas putida - ბიოლოგიაში

<div><p>მცენარის ზრდის ხელშემწყობი ბაქტერიების ფესვების კოლონიზაცია რთული მრავალსაფეხურიანი პროცესია, რომელზეც გავლენას ახდენს რამდენიმე ფაქტორი. მაგალითად, მცენარის ფესვებთან მიმაგრების დროს ბაქტერიებს უწევთ მცენარეების მიერ წარმოქმნილი რეაქტიული ჟანგბადის სახეობების (ROS) გაძლება. ამ კვლევაში ჩვენ ვატყობთ, რომ გლობალური ტრანსკრიპციის რეგულატორი Fis ჩართულია <i>Pseudomonas putida</i> ROS-ტოლერანტობის რეგულირებაში და ამით გავლენას ახდენს ქერის ფესვების კოლონიზაციაზე. <i>Fis</i> გადაჭარბებულმა გამოხატულებამ შეამცირა როგორც ROS-ის ტოლერანტობა, ასევე ქერის ფესვებისადმი მიდრეკილება და გაააქტიურა <i>nuoA-N</i> ოპერონის ტრანსკრიფცია, რომელიც აკოდირებს NADH დეჰიდროგენაზა I-ს, მემბრანასთან დაკავშირებული ჯაჭვის ელექტრონის პირველი ფერმენტი. <i>nuoA-N</i> ნოკაუტ მუტაციამ <i>fis</i>-ზედმეტ გამოხატვის ფონზე გაზარდა ROS-ტოლერანტობა და ქერის ფესვებისადმი ერთგულება. ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ <i>nuoA</i>-ს აქვს ორი ტრანსკრიპციის საწყისი ადგილი, რომლებიც განლაგებულია კოდირების მიმდევრობის ზემოთ 104 და 377 ნუკლეოტიდზე, რაც მიუთითებს ორი პრომოტორის არსებობაზე. DNase I ნაკვალევის ანალიზმა გამოავლინა Fis-ის შეკვრის ოთხი ადგილი: Fis-nuo1-დან Fis-nuo4-მდე, რომელიც მდებარეობს ამ ორ პრომოტორს შორის. ადგილზე მიმართული მუტაგენეზი პრომოტორ-lacZ რეპორტიორში და β-გალაქტოზიდაზას ანალიზში შემდგომში დადასტურდა Fis-ის პირდაპირი კავშირი Fis-nuo2-თან და ალბათ Fis-nuo4-თან, მაგრამ არა Fis-nuo1-თან და Fis-nuo3-თან. გარდა ამისა, შედეგები გულისხმობდა, რომ Fis-ის დაკავშირება Fis-nuo4-თან შეიძლება გავლენა მოახდინოს <i>nuoA-N</i> ოპერონის ტრანსკრიფციაზე ზემოთ დნმ-ის ტოპოლოგიის მოდიფიკაციით. გარდა ამისა, ტრანსპოზონის ჩვენმა მუტაგენეზის შედეგებმა აჩვენა, რომ Fis შესაძლოა ჩართული იყოს ROS-ის დეტოქსიკაციის რამდენიმე ალტერნატიული პროცესის რეგულირებაში NADH-ის გამოყენებით.</p></div.


შესავალი

Pseudomonas putida KT2440 არის გრამუარყოფითი ნიადაგის ბაქტერია, რომელიც კლასიფიცირებულია, როგორც ზოგადად მიჩნეული უსაფრთხო (GRAS) სერტიფიცირებული შტამი (Loeschcke and Thies, 2015 Nikel and de Lorenzo, 2018). ამ შტამმა მნიშვნელოვანი ყურადღება მიიპყრო სამრეწველო გამოყენებისთვის მისი სწრაფი ზრდის, ბუნებრივი მეტაბოლური მრავალფეროვნებისა და მაღალი გამძლეობის გამო მკაცრი გარემო პირობებში, რაც განსაკუთრებით შესაფერისია გარემოს დაბინძურების ბიო-აღდგენისთვის და მეტაბოლური ინჟინერიისთვის (Nikel და სხვ., 2016 ნიკელი და დე ლორენცო, 2018). გარდა ამისა, გენომის მასშტაბის მეტაბოლური მოდელები პ.პუტიდა KT2440 შეიქმნა შტამის მრავალმხრივი მეტაბოლიზმის უკეთ გასაგებად სისტემურ დონეზე, რომელიც გამოიყენებოდა ფენოტიპის რეპროგრამისთვის ბიოტექნოლოგიური დანერგვისთვის (Nogales და სხვ., 2008 სონ და სხვ., 2010 Hintermayer and Weuster-Botz, 2017). მართლაც, კარგად დამკვიდრებული მოლეკულური ბიოლოგიური ხელსაწყოები, მათ შორის გენის გამოხატვისა და გენომის ინჟინერიის სისტემები, გამოყენებულია პ.პუტიდა KT2440 ბიოსაწვავის და ფარმაცევტული პროდუქტების წარმოებისთვის მეტაბოლური ინჟინერიით (Martínez-García and de Lorenzo, 2011 Cook და სხვ., 2018 ).

მიუხედავად იმისა პ.პუტიდა KT2440 ფართოდ გამოიყენებოდა, როგორც შასი მეტაბოლური ინჟინერიისთვის, სინთეზური ბიოლოგიისა და ბიორემედიაციისთვის, არ არსებობს სანდო და სტანდარტიზებული მეთოდი საინტერესო გენების თანმიმდევრობით სპეციფიკური რეგულირებისთვის. ცოტა ხნის წინ, კლასტერული რეგულარულად ურთიერთშორის პალინდრომული გამეორებები (CRISPR) და CRISPR-თან ასოცირებული (Cas) პროტეინი წარმოიშვა, როგორც გენომის რედაქტირების მრავალმხრივი ხელსაწყოები სხვადასხვა ორგანიზმებისთვის, მათ შორის ბაქტერიებისთვის (Cho). და სხვ., 2018), ძუძუმწოვრების უჯრედები (კომორი და სხვ., 2017) და მცენარეები (მა და სხვ., 2016). გენომის რედაქტირების გარდა, CRISPR-Cas სისტემა ხელახლა იქნა გამოყენებული გენის ექსპრესიის გასაკონტროლებლად მეთოდით, რომელსაც მოიხსენიებენ როგორც CRISPR ინტერფერენციას (CRISPRi) (Qi და სხვ., 2013). CRISPR-Cas სისტემების მსგავსად, CRISPRi ასევე საჭიროებს ნუკლეაზას დეფიციტს Cas9 (dCas9) პროტეინს და სპეციალურად შემუშავებულ ერთ სახელმძღვანელო რნმ-ს (sgRNA), რომელიც შეიცავს 20-ნუკლეოტიდურ (nt) დისპერსიის თანმიმდევრობას, რომელიც ავსებს სამიზნე დნმ-ის თანმიმდევრობას. შემდეგ dCas9-sgRNA კომპლექსი აკავშირებს სამიზნე დნმ-ის ჯაჭვს, რომელიც აფერხებს ტრანსკრიფციის დაწყებას ან გახანგრძლივებას რნმ პოლიმერაზას დაკავშირების ბლოკირებით (Qi და სხვ., 2013). CRISPRi სისტემა ასევე ფართოდ გამოიყენებოდა, როგორც უაღრესად მარტივი და ეფექტური ინსტრუმენტი სამიზნე გენების თანმიმდევრობით სპეციფიკური რეგულირებისთვის რიგ ორგანიზმებში, მათ შორის ეშერიხია კოლი (ქი და სხვ., 2013 ), ბაცილუს სუბტილისი (პეტერს და სხვ., 2016) და ძუძუმწოვრების უჯრედები (გილბერტი და სხვ., 2013 ).

ზოგიერთისთვის ასევე დაფიქსირდა CRISPRi-ზე დაფუძნებული გენის რეგულირება ფსევდომონასი spp. თან და სხვ. (2018) შეიმუშავა რეგულირებადი CRISPRi სისტემა დინამიური გენის რეპრესიის განსახორციელებლად Pseudomonas aeruginosa II ტიპის dCas9 ჰომოლოგის გამოყენებით სტრეპტოკოკი პასტურიანუსი. კერძოდ, მათ შექმნეს ორი პლაზმიდი, რათა გამოესახათ dCas9 გენი და sgRNA P-დანლაქი და პტეტ პრომოუტერი შესაბამისად. თუმცა, განვითარებულმა ორპლაზმიდურმა CRISPRi სისტემამ აჩვენა გაჟონვის გამოხატულება dCas9 გენი შიგნით P. aeruginosa, რამაც გამოიწვია სამიზნე გენის რეპრესია ინდუქტორის არარსებობის შემთხვევაში. უფრო მეტიც, I ტიპის CRISPR-dCas სისტემა მიღებულ იქნა, როგორც ტრანსკრიპციული რეპრესორი P. aeruginosa PA14, რომელიც მოითხოვს წაშლას Cas3 გენი საწყისი P. aeruginosa ან ანტი-CRISPR ცილების გამოხატულება პროფაგიდან (Bondy-Denomy და სხვ., 2015). ცოტა ხნის წინ, CRISPRi ტექნიკა შეიქმნა dCas9 of-ის გამოყენებით Streptococcus pyogenes (სპdCas9), რომელმაც აჩვენა ფუნქციონირება გაძლიერებული მწვანე ფლუორესცენტური პროტეინის (eGFP) გამოყენებით პ.პუტიდა KT2440 (მზე და სხვ., 2018). თუმცა, ამ კვლევას აკლდა CRISPRi აპლიკაციები მეტაბოლურ ინჟინერიაში ან სინთეზურ ბიოლოგიაში პ.პუტიდა KT2440.

აქ წარმოგიდგენთ l-რამნოზის ინდუცირებად ერთ პლაზმიდურ CRISPRi სისტემას სამიზნე გენების მარტივი და ეფექტური რეგულირების მისაღწევად პ.პუტიდა KT2440. ამ რეგულირებადმა CRISPRi სისტემამ შეძლო ეკონტროლებინა ეგზოგენური და ენდოგენური გენების ექსპრესია პ.პუტიდა KT2440. ჩვენ ასევე გთავაზობთ მისი გამოყენების მაგალითებს მეტაბოლური ნაკადის ცვლილებისთვის მევალონატის (MVA) წარმოების გასაძლიერებლად, ძირითადი შუალედური მეტაბოლიტი უამრავი ტერპენოიდის ბიოსინთეზისთვის. Pseudomonas putida KT2440 გვიჩვენებს გლიცეროლზე, როგორც ნახშირბადის ერთადერთ წყაროს გახანგრძლივებულ ჩამორჩენის ფაზას, ამდენად, ამ ჩამორჩენის ფაზის შემცირების სტრატეგიები შეიძლება დაეხმაროს შტამის ამ შეზღუდვის დაძლევას ტერპენოიდების მიკრობული წარმოებისთვის ეკონომიური განახლებადი რესურსის გამოყენებისას. გლიცეროლის მეტაბოლიზმში ჩართული ძირითადი რეგულატორის გამოყენება პ.პუტიდა KT2440, როგორც სამიზნე გენი ერთი პლაზმიდური CRISPRi სისტემისთვის, აღმოჩნდა ძლიერი პლატფორმა ენდოგენური გენის ექსპრესიის მოდულაციისთვის. ამრიგად, ამ სისტემას შეუძლია დააჩქაროს მეტაბოლური ინჟინერია პ.პუტიდა KT2440 მიკრობული უჯრედების ქარხნების განვითარებისთვის, რომლებსაც მომავალში შეუძლიათ სამრეწველო ღირებული პროდუქტების წარმოება.


დისკუსია

მიკროორგანიზმებში დამატებითი ღირებულების იზოპრენოიდების ბიოტექნოლოგიური წარმოებისთვის IPP და DMAPP მიწოდების გაუმჯობესება მრავალი კვლევის სამიზნე იყო. თუმცა, მრავალი სხვა ფაქტორის გათვალისწინებაა საჭირო, რათა მივაღწიოთ იზოპრენოიდების ეფექტური წარმოებას უჯრედის ფიტნესზე გავლენის გარეშე. ისინი მოიცავს (A) მეტაბოლური სუბსტრატების ამოწურვას, (B) დაგროვილი შუალედური ნივთიერებების ან საბოლოო პროდუქტების ტოქსიკურობას და (C) უჯრედის შენახვის შესაძლებლობების გაჯერებას. ბოლო ორი პრობლემის გადასაჭრელად სტრატეგიები უხვადაა, მაგრამ ნაკლები ყურადღება დაეთმო პირველს, მიუხედავად ცენტრალური მეტაბოლიტების აუზების, როგორიცაა პირუვატი და GAP, IPP და DMAPP სინთეზზე გადამისამართების უარყოფითი ზრდის ზემოქმედებისა. მიუხედავად იმისა, რომ კვლევების უმეტესობა მიზნად ისახავს IPP და DMAPP მიწოდების გაუმჯობესებას, ჩატარებულია კარგად დახასიათებული ორგანიზმებით, როგორიცაა E. coli (მოდელი ბაქტერიებისთვის, რომლებიც იყენებენ MEP გზას) და S. cerevisiae (საფუარის მოდელი, რომელიც იყენებს მხოლოდ MVA გზას), სხვა მიკროორგანიზმები, რომლებიც აჩვენებენ დამატებით უპირატესობებს მაღალი იზოპრენოიდული ტიტრების წარმოებისა და დაგროვებისთვის, ძნელად შესწავლილი რჩება. ეს ასეა პ.პუტიდა, ბაქტერია, რომელიც ავლენს ძალიან მაღალ ტოლერანტობას ტოქსიკური ნაერთების მიმართ, როგორიცაა მონოტერპენები [4, 5]. დამატებითი უპირატესობა პ.პუტიდა არის ის, რომ გლუკოზა მეტაბოლიზდება MEP გზის სუბსტრატების პირუვატის და GAP-ის დაბალანსებული რაოდენობით წარმოქმნით [6, 10, 23]. ეს ცენტრალური მეტაბოლური სუბსტრატები წარმოიქმნება არაექვივალენტური რაოდენობით სხვა ბაქტერიებში, როგორიცაა E. coli, სადაც პირუვატის და GAP-ის დაუბალანსებელმა ხელმისაწვდომობამ შეიძლება შეზღუდოს MEP ბილიკის აქტივობა [24]. როგორც პირუვატის, ასევე GAP-ის დონის გაზრდა პ.პუტიდა რეალურად გამოიწვია კაროტინოიდების (β-კაროტინის) წარმოების (1,3-ჯერ) ზრდა [10], რაც ვარაუდობს, რომ მეტაბოლური სუბსტრატების მიწოდება ზღუდავს MEP გზის ნაკადს. აქ მოხსენებული ჩვენი მონაცემები მხარს უჭერს დასკვნას, რომ პირუვატისა და GAP-ის სათანადო მიწოდების უზრუნველყოფა ასევე მნიშვნელოვანია იზოპრენოიდების წარმოების ზერეგულაციისთვის, ხოლო მთლიან მიკრობული მეტაბოლიზმში ძირითადი ჩარევის თავიდან ასაცილებლად, რაც იწვევს დეფექტურ ზრდას.

მეტაბოლური ნაკადის სტიმულირების სხვადასხვა გზების გამოსაკვლევად ენდოგენური MEP გზის მეშვეობით იზოპრენოიდული წინამორბედებისკენ, ჩვენ შევქმენით პ.პუტიდა შტამი (KTLYC) ეგზოგენური 3-გენიანი ოპერონით, რათა გამოიმუშაოს ლიკოპენი წაკითხვის სახით. ამ შტამის პლაზმიდებით ტრანსფორმირებით ენდოგენური MEP ბილიკის გენების ზედმეტად გამოხატვით ან ალტერნატიული შუნტის გზების ჩართვისთვის, ჩვენ შეგვიძლია გავამრავლოთ ლიკოპენის წარმოება (ანუ IPP და DMAPP მიწოდება) 3-ზე (nDXS სურ. 8), 7-ზე (MVA გზის ნახ. 3). ), 25 (DXS-ით სურ. 4) და 50 (DXS-ით და DXR-ით სურ. 10). თუმცა, დიდი ალბათობით, ამ სტრატეგიებიდან ზოგიერთის შემდგომმა ოპტიმიზაციამ ან რამდენიმე სტრატეგიის კომბინაციამ შეიძლება გამოიწვიოს კიდევ უფრო მაღალი ზრდა. დანამატი და სინერგიული ეფექტები ასევე შეიძლება მიღწეული იყოს MEP ბილიკის სუბსტრატების მიწოდების გაუმჯობესებით. ბოლო მაგალითია ხელახალი გაყვანილობა პ.პუტიდა ძირითადი მეტაბოლიზმი გლუკოზის ასიმილაციისთვის მშობლიური Entner-Doudoroff-დან ხაზოვან ემბდენ-მეიერჰოფ-პარნასის გლიკოლიზამდე, რამაც გააუმჯობესა როგორც პირუვატის, ასევე GAP-ის წარმოება [10]. მეტაბოლური პლასტიურობა ნაჩვენებია მიერ პ.პუტიდა, რომელსაც შეუძლია ნახშირბადის სხვადასხვა წყაროების მეტაბოლიზება, მათ შორის ცხიმოვანი მჟავები, გლიცეროლი და არომატული ნაერთები [25], იძლევა დამატებით შესაძლებლობას, გადააკეთოს IPP-ისა და DMAPP-ის სინთეზისთვის საჭირო სუბსტრატების აუზები. ნახშირბადის სხვადასხვა წყაროებით ბაქტერიების კვებამ შესაძლოა ხელი შეუწყოს პირუვატის, GAP-ის (მაგ. გლუკოზის) ან აცეტილ-CoA-ს (მაგ. ცხიმოვანი მჟავების) დაგროვებას და ნახშირბადის სხვადასხვა წყაროების კომბინაციამ შეიძლება ხელი შეუწყოს პროდუქტიული (ეგზოგენური) გზების კონკურენციის განთავისუფლებას. საყოფაცხოვრებო (ენდოგენური) მეტაბოლიზმი. ნახშირბადის სხვადასხვა წყაროების იერარქიულმა გამოყენებამ [26] შესაძლოა შეზღუდოს ჩვენი უნარი, გავაერთიანოთ სრულად აქტიური მეტაბოლური გზები უჯრედში პროდუქტიული და საყოფაცხოვრებო გზების ერთდროულად გამოსაკვებად. თუმცა, ჩვენი ცოდნა ამ იერარქიის მაკონტროლებელი მექანიზმების შესახებ მუდმივად იხვეწება [27, 28], რაც უზრუნველყოფს ახალ საინჟინრო შესაძლებლობებს.

აქ შემოწმებულ ახალ სტრატეგიებს შორის, nDXS-ის გამოყენება Ru5P-დან DXP-ის წარმოებისთვის იყო ყველაზე წარმატებული, რადგან მან გააუმჯობესა ლიკოპენის დაგროვება სამჯერ, უჯრედების ზრდაზე ნეგატიური ზემოქმედების გარეშე (ნახ. 8). მიუხედავად იმისა, რომ ეს ზრდა ჯერ კიდევ შორს არის კანონიკური DXS ფერმენტით მიღწეულისგან (ნახ. 4), მნიშვნელოვანია გვახსოვდეს, რომ nDXS იყო იდენტიფიცირებული, როგორც მუტანტის ფერმენტი, რომელმაც შეიძინა DXP-ის გამომუშავების უნარი წერტილის მუტაციის და შედეგად. ის არ არის ოპტიმიზებული DXP სინთეზისთვის. ჩვენი შეფასებით, Ru5P სუბსტრატის მხოლოდ 10% გარდაიქმნება DXP-ად nDXS-ის მიერ. მუტანტის ფერმენტის DXS აქტივობის გაზრდა შესაძლებელი და სწრაფიც კი უნდა იყოს, თუ გამოიყენებთ ახალ ავტომატიზებულ პლატფორმებს, რომლებიც ხელმისაწვდომია ადაპტური ლაბორატორიული ევოლუციის მიდგომებისთვის [29, 30]. ოპტიმიზებული nDXS საშუალებას მისცემს დამატებით სტრატეგიას კანონიკური DXS-ის გამოყენებით, რათა MEP გზა აიწიოს პირუვატისა და GAP-ის გამოყენებით იმ ზღვრებამდე, რომელიც არ აჩვენებს გავლენას ზრდაზე დამატებითი DXP შეყვანით, რომელიც მიღებულია Ru5P-ის nDXS-ით ტრანსფორმაციის შედეგად. ველური ტიპის ribB პროტეინის [31] კრისტალური სტრუქტურის ხელმისაწვდომობამ უნდა დაასკვნოს, თუ როგორ შეიძლება გავლენა იქონიოს ახლად შერჩეულმა მუტაციებმა nDXS-ის DXS აქტივობაზე, ინფორმაცია, რომელიც შეიძლება იყოს ძალიან ღირებული, რათა საბოლოოდ შეიქმნას სინთეზური ფერმენტები, რომლებსაც შეუძლიათ DXP-ს წარმოქმნა. Ru5P ან სუბსტრატებიდან, რომლებიც არ აფერხებენ ენდოგენურ MEP გზას ან სხვა არსებით მეტაბოლურ პროცესებს ბაქტერიებში. როგორც დამატებითი სტრატეგია, Ru5P-ის მიწოდება შეიძლება გაიზარდოს პენტოზა ფოსფატის გზის გადატვირთვის გზით. Ru5P არის C5 სუბსტრატი და, შესაბამისად, ის გარდაიქმნება DXP-ად nDXS-ით ნახშირბადის დაკარგვის გარეშე (გარდა იმ შემთხვევისა, როდესაც რეაქცია კატალიზებულია DXS-ით, რომელიც იწყება ორი C3 წინამორბედით და მოიცავს დეკარბოქსილირებას). ერთად, nDXS-ის ოპტიმიზებული ვერსიების გამოყენებამ ცალკე ან სხვა სტრატეგიებთან ერთად შეიძლება გაზარდოს IPP და DMAPP წარმოება ახალ მაღალ დონეზე.

კიდევ ერთი ახალი სტრატეგია, რომელიც ჩვენ გამოვცადეთ, იყო DXS ექსპრესიის მშვენიერი რეგულირება ენდოგენური პრომოტორის გამოყენებით, რომელიც პასუხობდა უჯრედების ზრდის სტრესს (ნახ. 6). Გამოყენებით პკატა პრომოტორს ჩვენ მივაღწიეთ ლიკოპენის დაგროვების მხოლოდ ოთხჯერ ზრდას ცარიელ პლაზმიდურ კონტროლთან შედარებით, რაც ვარაუდობს, რომ ამ პრომოტორის ტრანსკრიპციული აქტივობა ტესტირებულ პირობებში ძალიან დაბალია იმისთვის, რომ ეფექტურად გაზარდოს MEP გზა და, შესაბამისად, მიაღწიოს სტრესულ პირობებს, რამაც შეიძლება საბოლოოდ დათრგუნოს ტრანსკრიფცია. სავარაუდოა, რომ უფრო ძლიერი, მაგრამ მაინც სტრესზე პასუხისმგებელი პრომოტორების გამოყენებამ შეიძლება უკეთ იმუშაოს. The პკატა პრომოტორი შეიძლება იყოს შემუშავებული, რათა გაზარდოს მისი ტრანსკრიპციული აქტივობა და შეინარჩუნოს მისი მარეგულირებელი თვისებები. ალტერნატიულად, IPTG-ის სხვადასხვა კონცენტრაციის თანდასწრებით გაზრდილი KTLYC(p424-DXS) უჯრედების ტრანსკრიპტომის ანალიზმა უნდა დაუშვას გენების იდენტიფიცირება, რომლებიც ძალიან გამოხატულია უჯრედების ნორმალურად ზრდისას, მაგრამ რეპრესირებულნი არიან, როდესაც უჯრედების ზრდა კომპრომეტირებულია IPTG-დამოკიდებული გზით. (ანუ როცა DXS აქტივობა ძალიან მაღალია). ასეთი გენების პრომოტორები შეიძლება გამოყენებულ იქნას სინთეზურ ოპერონებში DXS-ის (და IDI, DXR, nDXS და ა.შ.) მიწოდების გასაზრდელად და, შესაბამისად, იზოპრენოიდული წინამორბედების ხელმისაწვდომობა ზრდის ოპტიმალურ პირობებში, მაგრამ ამცირებენ მათ ზრდას დამთრგუნველ ეფექტებს. გამოჩნდება. ეს მისცემს დროს უჯრედებს, რათა მოახდინონ თავიანთი მეტაბოლიზმი და აღადგინონ იზოპრენოიდების ჭარბი წარმოება.

უფრო „კლასიკურმა“ მიდგომებმა, რომლებიც ჩვენ გამოვცადეთ, ანუ ეგზოგენური MVA გზის გამოყენებამ აცეტილ-coA-დან IPP და DMAPP-ის წარმოებისთვის და MEP გენების ზედმეტად გამოხატვამ, მიგვიყვანა დასკვნამდე, რომ ერთ ბაქტერიასთან მიღებულ შედეგებს პირდაპირ არ შეგვიძლია ექსტრაპოლაცია. (მაგალითად E. coli) სხვა ბაქტერიის ინჟინერიისთვის (მაგ. პ.პუტიდა). მაგალითად, MVA გზის გამოყენება, როგორც წესი, უკეთ მუშაობს, ვიდრე DXS-ის რეგულირება E. coli [32,33,34] მაგრამ ჩვენ დავაკვირდით საპირისპირო ქცევას პ.პუტიდა. მსგავსი დაკვირვება ადრე იყო მოხსენებული ციანობაქტერიებში, რომლებიც იზრდებიან ფოტოაუტოტროფულ პირობებში იზოპრენის წარმოქმნით [35]. ბაქტერიული MVA გზის ოპერონის არსებობამ გააუმჯობესა ლიკოპენის დაგროვება შვიდჯერ (ნახ. 3), ისევე როგორც ათჯერადი ზრდა, რომელიც იწვევდა იმავე ოპერონის მონოტერპენის წარმოებას პ.პუტიდა DSM 12264 უჯრედები [4]. ამის საპირისპიროდ, DXS შემცველი პლაზმიდის არსებობამ შეძლო ლიკოპენის დაგროვების ხელშეწყობა KTLYC უჯრედებში 15-ჯერ ყოველგვარი ინდუქციის არარსებობის შემთხვევაში (ნახ. 4b). IDI ჭარბი წარმოების ეფექტის თითქმის სრული ნაკლებობა ლიკოპენის სინთეზზე, როდესაც DXS-ის შემზღუდველი როლი თავისუფლდება პ.პუტიდა (ნახ. 4d) ასევე განსხვავდება იმისგან, რაც დაფიქსირდა E. coli [29].


დისკუსია

ფესვების კოლონიზაციაზე გავლენას ახდენს როგორც აბიოტიკური, ისე ბიოტური ფაქტორები მცენარის ფესვებთან ახლოს, რომლებსაც შეუძლიათ მავნე ან პირიქით, სასარგებლო ეფექტები. წარმატებული კოლონიზაციისთვის ბაქტერიებმა უნდა აღიარონ მცენარის არსებობა, გაუმკლავდნენ მავნე ფაქტორების უარყოფით გავლენას და წარმატებით მიამაგრონ მცენარის ფესვის ზედაპირზე.

ჩვენ ეს ადრე აღვწერეთ ფისი- გადაჭარბებული ექსპრესია ზრდის როგორც ბიოფილმის ფორმირებას, ასევე ექსპრესიას lapA in . პუტიდა [22,23,31]. LapA არის უჯრედის ზედაპირის ცილა, რომელიც აუცილებელია . პუტიდა მიმაგრება ბიოტურ და აბიოტურ ზედაპირებზე [23,45]. ამრიგად, ფისი- გადაჭარბებული გამოხატვა . პუტიდა უნდა გაზარდოს ბაქტერიების მიმაგრება ქერის ფესვებთან და არ შემცირდეს კოლონიზაციის პირველი ეტაპები, როგორც ეს იყო აღწერილი ადრე [31]. ჩვენ ვივარაუდეთ, რომ Fis შეიძლება იყოს ჩართული ROS-ტოლერანტობის რეგულირებაში . პუტიდა და შემცირებული ერთგულება ფისი-გადაჭარბებული გამოხატვის შტამი F15 კოლონიზაციის პირველ საფეხურებზე შეიძლება იყოს ეგზოგენური ROS-ის მიმართ გაზრდილი მგრძნობელობის შედეგი.

მართლაც, ზედმეტად გამოხატვა ფისი in . პუტიდა შეამცირა H22- უჯრედების ტოლერანტობა და, როგორც მოსალოდნელი იყო, დამატებით კატალაზას გენის დამატება katA შეამსუბუქა მგრძნობელობა ფისი-გადაჭარბებული გამოხატვის შტამი ROS-ზე (ნახ 1B). უფრო მეტიც, გადაჭარბებული გამოხატვა ფისი in . პუტიდა გაზარდა ენდოგენური ROS-ის რაოდენობა და შეამცირა ქერის ფესვების კოლონიზაციის უნარი, რაც კიდევ უფრო შემცირდა, როდესაც ROS-ის უჯრედგარე რაოდენობა გაიზარდა გალის მჟავას დამატებით (ნახ 2). ამავდროულად, ველური ტიპის შტამი არ იყო მგრძნობიარე გალის მჟავას გაზრდილი ROS ქერის ფესვებზე (ნახ 2C). ჩვენ ვარაუდობთ, რომ ROS-ის მიმართ მგრძნობელობა ქერის ფესვებზე შეიძლება დამოკიდებული იყოს ბაქტერიული უჯრედების ფიზიოლოგიურ პირობებზე. სავარაუდოდ, ველური ტიპის შტამმა შეძლო კომპენსატორული მექანიზმის გამოყენება ქერის ფესვებიდან გამოსხივებული ეგზოგენური ROS-ის დეტოქსიკაციისთვის და . პუტიდა ზედმეტად გამოხატულთან ერთად ფისი არ იყო. ამან გააჩინა კითხვა, შეეძლო თუ არა Fis-ს გავლენა ROS-ტოლერანტობაზე ზოგიერთი კონკრეტული გენის ტრანსკრიფციის რეგულირებით.

ჩვენ ჩავატარეთ ტრანსპოზონის მუტაგენეზი Fis-დამოკიდებული გენების იდენტიფიცირებისთვის, რომლებიც არეგულირებენ ბაქტერიების ROS ტოლერანტობას და გამოვავლინეთ 19 მინი-Tn5 ჩასმა F15-ში nuoA-N ოპერონის გენები. ეს დასკვნა მიუთითებს, რომ რეგულირება nuoA-N Fis-ის ოპერონი შეიძლება იყოს ჩართული ROS-ტოლერანტობაში, როგორც ალტერნატიული მექანიზმი ენდოგენური ROS-ის შესამცირებლად. მართლაც, წაშლა nuoA-N შემცირდა ენდოგენური ROS-ში ფისი- გადაჭარბებული გამოხატვის უჯრედები (ნახ. 2B) და გაიზარდა ტოლერანტობა ეგზოგენური ROS-ის მიმართ (ნახ 1B). გენები nuoA რომ nuoN კოდირებს NuoA-N ცილებს, რომლებიც იკრიბებიან NADH დეჰიდროგენაზა I-მდე ციტოპლაზმურ მემბრანაში [15,46,47]. ეს კომპლექსი არის რესპირატორული ჯაჭვის ფერმენტი, რომელიც კატალიზებს ორი ელექტრონის გადაცემას NADH-დან ქინონებში რეაქციაში, რომელიც დაკავშირებულია პროტონის გადაადგილებასთან მემბრანის გასწვრივ [48].

ორ ჰიპოთეზას შეუძლია ახსნას, თუ როგორ შეიძლება NADH დეჰიდროგენაზა I იმოქმედოს ენდოგენური ROS-ის რაოდენობაზე: თავად ROS-ის გენერირება ან NADH-ის რედუქციული აგენტის დაქვეითება. ნაჩვენებია, რომ ელექტრონების ტრანსპორტირებისას NADH დეჰიდროგენაზა I-მა შეიძლება გამოიმუშაოს ROS-ში ეშერიხია კოლი [16]. ამ შემთხვევაში, ROS შეიძლება წარმოიშვას NADH დაჟანგვისა და ელექტრონის ტრანსპორტირების დროს კოფაქტორის FMN-ის მეშვეობით [16]. ალტერნატიულად, შესაძლებელია, რომ NADH-ის, როგორც შემცირების აგენტის დაქვეითებამ შეიძლება გაზარდოს ენდოგენური ROS. მაგალითად, ანტიბიოტიკების არსებობა ზრდის გარემოში იწვევს ოქსიდაციური სტრესის ბევრ გენს, მაგ. NADH პეროქსიდაზა და გლუტათიონ რედუქტაზა [21] და, შესაბამისად, ბაქტერიებს სჭირდებათ NADH, რომ გამოიყენონ ის ROS დეტოქსიკაციისთვის. ამრიგად, იძულებითი გამოხატულება nuoA-N გენების მიერ ფისი- გადაჭარბებულმა გამოხატვამ შეიძლება გამოიწვიოს NADH-ის დეფიციტი, რაც გამორთავს ენდოგენური ROS-ის დეტოქსიკაციას. რომელი ჰიპოთეზაც არ უნდა იყოს ჭეშმარიტი, ენდოგენური და ეგზოგენური ROS-ების ჯამი F15ΔnuoA-N-ისთვის უფრო დაბალია, რაც იწვევს ბაქტერიების უფრო მაღალ ტოლერანტობას ეგზოგენური ROS-ის მიმართ და გაიზარდა კოლონიზაციის ეფექტურობა (ნახ. 1B, 2C და 2D). უფრო მეტიც, F15-ისგან განსხვავებით, F15ΔnuoA-N-ის კოლონიზაციის ეფექტურობა გაუმჯობესდა ფისი-გადაჭარბებული გამოხატვის ფონი (ნახ 2C). როგორც ჩანს, მიმაგრება . პუტიდა დამოკიდებულია ორ ფაქტორზე: ROS-ის დეტოქსიკაციაზე და მთავარი ადჰეზინის LapA-ს არსებობაზე, როგორც უკვე აღვნიშნეთ, რომ ფისი-გადაჭარბებული გამოხატვა ზრდის გამოხატულებას lapA [22,23]. ამრიგად, უჯრედების ზედაპირზე LapA-ს გაზრდილი რაოდენობა გააძლიერებს ფესვებთან მიმაგრებას, თუ ბაქტერიებს შეეძლოთ ROS-ის ეფექტური დეტოქსიკაცია.

მინი-თნ-ის იდენტიფიკაცია5 რამდენიმე სხვა გენში შეყვანა, რომლებიც პასუხისმგებელნი არიან რედუქციური ძალის შენარჩუნებაზე, მხარს უჭერს NAD(P)H-ის დაქვეითების ჰიპოთეზას. მიუხედავად იმისა, რომ მხოლოდ რამდენიმე მინი-ტონა5 შერჩეული იყო მეთიონინის ბიოსინთეზის გენებში ჩასმა, მინი-Tn5 ჩასმა PP_5275-ში და metR-1 (PP_1063) აღადგინა ჰ22- ველური ტიპის დონისადმი ტოლერანტობა მიუხედავად ფისიგადაჭარბებული გამოხატულება (S3 ცხრილი). ცნობილია, რომ ROS წარმოქმნის თიოლის სტრესს ბიომოლეკულებში თიოლის ნარჩენების დაჟანგვის გზით, განსაკუთრებით ცილებში, რაც ქმნის დისულფიდურ კავშირებს, რომლებსაც შეუძლიათ ფერმენტების ინაქტივაცია [49]. ამიტომ, ბაქტერიებს სჭირდებათ აღმდგენი ძალა, რათა შეამცირონ დისულფიდური ბმები ცილებში და NADPH, რომელიც გამოიყენება მეთიონინის ბიოსინთეზში, არის ძლიერი რედუქციური აგენტი ბაქტერიებში ROS-ის დეტოქსიკაციისთვის [50,51]. ამრიგად, Fis-ის გაზრდილმა რაოდენობამ შეიძლება გავლენა მოახდინოს ოქსიდირებული ბიომოლეკულების შემცირებაზე . პუტიდა რადგან ის ინარჩუნებს მეთიონინის ბიოსინთეზს, რომელიც დაქვეითებული იქნება ბუნებრივ პირობებში. იმის გამო, რომ მცენარის ფესვები გამოყოფს ამინომჟავებს მცენარეთა ზრდის ხელშემწყობი ბაქტერიების მოსაზიდად [52,53], უფრო სავარაუდოა, რომ ამინომჟავების ბიოსინთეზი დაქვეითებულია მცენარეთა ფესვებთან ახლოს მდებარე ბაქტერიებში. დაქვეითების მიზეზი, ალბათ, არის არა მხოლოდ ენერგიის დაზოგვა, არამედ ისეთი რედუქციული აგენტების ამოწურვის თავიდან აცილება, როგორიცაა NADPH.

გარდა ამისა, კეტომჟავებს შეუძლიათ გაანეიტრალონ ROS NADPH-ისგან დამოუკიდებელი გზით [54]. მაგალითად, ROS-ის ჭარბი რაოდენობა აძლიერებს ალფა-კეტოგლუტარატის, კრებსის ციკლის მეტაბოლიტის დაგროვებას, რომელიც გამოიყენება დისულფიდური ბმების შესამცირებლად. Pseudomonas fluorescens [54]. აქედან გამომდინარე, შესაძლებელია მინი-ტნ-ის ჩასმა5 მეთიონინის ბიოსინთეზის გენებში და ალფა-კეტოგლუტარატის მეტაბოლიზმის გენები ამსუბუქებს თიოლის სტრესს ფისიგადაჭარბებული გამოხატვის ფონი (S3 ცხრილი). ამრიგად, კოლონიზაციის პროცესის დროს ბაქტერიებს შეუძლიათ თავიანთი მეტაბოლიზმის რეგულირება, რათა გაუმკლავდნენ ეგზოგენური ROS-ის ტოქსიკურ ეფექტს, ამცირებენ გამოხატულებას. nuoA-N ოპერონი და რედუქციური ძალის გაზრდა NADH, NADPH და კეტომჟავების რაოდენობის მაღალი შენარჩუნებით.

როგორც ტრანსპოზონის მუტანტების მნიშვნელოვან რაოდენობას ჰქონდა ტრანსპოზონის ჩასმა ნუო ოპერონის გენები და ოთხი პოტენციური Fis-შემაკავშირებელი ადგილი იყო ნაწინასწარმეტყველები ზედა დინების მიმდევრობაში nuoA გენი, ჩვენ ღრმად შევისწავლეთ Fis-ის მიერ ამ ოპერონის რეგულირება. ორგანიზაცია nuoA-N გენები მსგავსია სხვადასხვა ბაქტერიებში: ისინი განლაგებულია ერთ ოპერონში და თანატრანსკრიბირებულია . coli, Salmonella enterica და . ფლუორესცენცია [15,55,56]. მსგავსის არსებობა ნუო ოპერონის სტრუქტურაში . პუტიდა გულისხმობს, რომ nuoA-N შესაძლებელია ოპერონის გენების თანატრანსკრიბირება . პუტიდა როგორც.

The nuoA-N ოპერონი შიგნით . პუტიდა აქვს ორი პრომოუტერი წინ nuoA გენი და ეს პრომოტორები ირიბად რეგულირდება RpoS-ით (ნახ. 4). Fis აკავშირებს Fis-დამოკიდებული პრომოტორის ზემო დინებაში რამდენიმე დამაკავშირებელ ადგილს (სურ. 5 და 6) და არეგულირებს ტრანსკრიფციას (ნახ 7). ეს შედეგები მიუთითებს იმაზე, რომ ტრანსკრიფცია ნუო- ოპერონი შევიდა . პუტიდა გაძლიერებულია ნუტრიენტების არსებობისას, როდესაც ბაქტერიებს აქვთ ენერგია ROS-ის გასანეიტრალებლად და რეგულირდება სტრესით, როდესაც მცირდება დამატებითი ROS-ის დეტოქსიკაციის ხელმისაწვდომობა. ჩვენმა შედეგებმა აჩვენა, რომ ორი Fis-შემაკავშირებელი ადგილი გავლენას ახდენს მისი ტრანსკრიფციაზე . putida nuoA დადებითად. Fis-ის პროქსიმალური შეკავშირების ადგილი Fis-nuo2 მდებარეობს დაახლოებით -70 bp 5' ბოლოდან. nuoA mRNA N-I (ნახ 3). ასეთი მანძილი დამახასიათებელია აქტივატორებისთვის, რომლებიც უშუალოდ ურთიერთქმედებენ რნმ პოლიმერაზასთან [57]. რეგიონი, მითითებული როგორც Fis-nuo4, როგორც ჩანს, ჩართულია ტრანსკრიპციულ რეგულაციაშიც, ალბათ დნმ-ის ტოპოლოგიის მოდულაციის გზით. Fis-nuo4 მდებარეობს -290 bp 5' ბოლოდან nuoA mRNA N-I (ნახ 3) და შეუძლია ტრანსკრიფციის გააქტიურება ამ მანძილიდან მხოლოდ დნმ მარყუჟის წარმოქმნით. ამიტომ, ჩვენ ვთავაზობთ, რომ Fis-ის დაკავშირება Fis-nuo4-თან შეიძლება შეცვალოს დნმ-ის ტოპოლოგია, რომელიც აძლიერებს დნმ-ის ტრანსკრიფციას. nuoA-N ოპერონი.

დასკვნის სახით, ამ კვლევაში ჩვენ აღვწერეთ გლობალური რეგულატორის Fis-ის ჩართულობა ROS ტოლერანტობაში და ქერის ფესვების კოლონიზაციაში. . პუტიდა. Fis-ის უარყოფითი ეფექტი ROS-ის ტოლერანტობაზე და, შესაბამისად, ფესვის კოლონიზაციის ეფექტურობაზე შეიძლება გამოჩნდეს ტრანსკრიპციული დონის გაზრდის გზით. nuoA-N ოპერონი და ენდოგენური ROS-ის დაგროვება. Fis უკავშირდება პრომოტორულ რეგიონს nuoA-N ოპერონი და აადვილებს მის ტრანსკრიფციას Fis-nuo2 და Fis-nuo4 უბნებთან შეკავშირებით ოპერონის პრომოტორის ზემოთ.


დიფერენციალური პასუხი პბენ პრომოუტერი პseudomonas putida mt-2 to BenR და XylS ხელს უშლის მეტაბოლურ კონფლიქტებს მ-ქსილენის ბიოდეგრადაცია

seudomonas putida mt-2 მოიცავს ბენზოატების მეტაბოლიზმის ორ ალტერნატიულ და პოტენციურად ურთიერთსაწინააღმდეგო გზას, ერთი მეტა ბილიკი, რომელიც კოდირებულია xyl pWW0 პლაზმიდის გენები და ათვისებული პრომოტორი და XylS, და ერთი ქრომოსომულად დაშიფრული ორთო მიერ ინიცირებული გზა ბენ და BenR ცილა. ნებისმიერი ჯვარედინი გააქტიურება ბენ XylS-ის პრომოუტერმა უნდა გამოიწვიოს მეტაბოლური კონფლიქტი დეგრადაციის დროს -ქსილენი, რადგან 3-მეთილბენზოატი (3 მბზ), რომელიც წარმოიქმნება შუალედში, შეიძლება არხული იყოს ორთო გზა და გამოიმუშავებს ტოქსიკურ ჩიხში მეტაბოლიტებს. -ის გააქტიურება ბენ by XylS ხელახლა იქნა მიმოხილული როგორც რეპორტიორის ტექნოლოგიის, ასევე კრამიტის მასივების გამოყენებით, რომლებიც მიზნად ისახავს ორივეს მესენჯერული რნმ-ის ინიცირების გარშემო საინტერესო თანმიმდევრობებს. ბენ და პრომოუტერები. ზემგრძნობიარეების ანალიზი luxCDABE შერწყმა, შემოწმება xylX წინააღმდეგ benA ტრანსკრიპტები და ზრდის ტესტები benR მუტანტები მიუთითებენ, რომ XylS-ის ბუნებრივი გამოხატვის დიაპაზონი სხვადასხვა პირობებში არასაკმარისია იმისათვის, რომ გამოიწვიოს მნიშვნელოვანი ჯვარედინი რეგულაცია. ბენ უჯრედებს აქვთ ენდოგენური თუ ეგზოგენური 3 მბზ. როგორც ჩანს, ეს გამომდინარეობს ოპერატორების ბუნებიდან, რომლებიც დაკავშირებულია ტრანსკრიპციულ ფაქტორებთან, რაც ბენ პრომოუტერი . პუტიდა mt-2, როგორც ჩანს, განვითარდა XylS-თან ძლიერი ურთიერთქმედების თავიდან ასაცილებლად.


შინაარსი

ბაქტერიული გვარების უმეტესობის მსგავსად, ფსევდომონადაც [შენიშვნა 1] ბოლო საერთო წინაპარი ცხოვრობდა ასობით მილიონი წლის წინ. ისინი თავდაპირველად კლასიფიცირებული იყო მე -19 საუკუნის ბოლოს, როდესაც პირველად ამოიცნო ვალტერ მიგულამ. სახელის ეტიმოლოგია იმ დროს არ იყო მითითებული და პირველად გამოჩნდა მეშვიდე გამოცემაში. ბერგეის სისტემური ბაქტერიოლოგიის სახელმძღვანელო (ძირითადი ავტორიტეტი ბაქტერიების ნომენკლატურაში) როგორც ბერძნული ფსევდები (ψευδής) "ცრუ" და -მონასი (μονάς/μονάδος) "ერთი ერთეული", რაც შეიძლება ცრუ ერთეულს ნიშნავდეს, თუმცა, მიგულამ შესაძლოა ის მცდარი განზრახვა მიიღო მონას, ნანოფლაგელირებული პროტისტი [7] (შემდგომში ტერმინი „მონადი“ გამოიყენებოდა მიკრობიოლოგიის ადრეულ ისტორიაში ერთუჯრედიანი ორგანიზმების აღსანიშნავად). მალე სხვა სახეობები, რომლებიც შეესაბამებოდა მიგულას გარკვეულწილად ბუნდოვან თავდაპირველ აღწერილობას, იზოლირებული იქნა მრავალი ბუნებრივი ნიშისგან და, იმ დროს, ბევრი მიენიჭა გვარს. თუმცა, ბევრი შტამი მას შემდეგ გადაკლასიფიცირდა, უახლესი მეთოდოლოგიისა და კონსერვატიული მაკრომოლეკულების შესწავლის მიდგომების გამოყენების საფუძველზე. [8]

ცოტა ხნის წინ, 16S rRNA თანმიმდევრობის ანალიზმა ხელახლა განსაზღვრა მრავალი ბაქტერიული სახეობის ტაქსონომია. [9] შედეგად, გვარი ფსევდომონასი მოიცავს შტამებს, რომლებიც ადრე კლასიფიცირდება გვარებში ქრიზეომონასი და ფლავიმონასი. [10] სხვა შტამები ადრე კლასიფიცირებული გვარში ფსევდომონასი ახლა კლასიფიცირებულია გვარებში ბურხოლდერია და რალსტონია. [11] [12]

2020 წელს დასრულდა 494 ფილოგენომიური ანალიზი ფსევდომონასი გენომებმა გამოავლინეს ორი კარგად განსაზღვრული სახეობა (P. aeruginosa და P. chlororaphis) და ოთხი უფრო ფართო ფილოგენეტიკური ჯგუფი (P. fluorescens, P. stutzeri, P. syringae, P. putida) საკმარისი რაოდენობის ხელმისაწვდომი პროტეომებით. [13] ოთხი ფართო ევოლუციური ჯგუფი მოიცავს ერთზე მეტ სახეობას, რომელიც ეფუძნება სახეობების განსაზღვრას საშუალო ნუკლეოტიდის იდენტობის დონეებით. [14] გარდა ამისა, ფილოგენომიურმა ანალიზმა გამოავლინა რამდენიმე შტამი, რომლებიც არასწორად იყო მიჩნეული არასწორ სახეობებში ან ევოლუციურ ჯგუფში. [13] ეს არასწორი ანოტაციის პრობლემა მოხსენებულია სხვა ანალიზებითაც. [15]

2000 წელს სრული გენომის თანმიმდევრობა ა ფსევდომონასი სახეობა დადგინდა სულ ცოტა ხნის წინ, დადგინდა სხვა შტამების თანმიმდევრობა, მათ შორის P. aeruginosa შტამები PAO1 (2000), პ.პუტიდა KT2440 (2002), P. პროტეგენები Pf-5 (2005), P. syringae პათოვარი პომიდორი DC3000 (2003), P. syringae pathovar syringae B728a (2005), P. syringae pathovarphasolica 1448A (2005), P. fluorescens Pf0-1 და P. entomophila L48. [8]

2016 წლისთვის 400-ზე მეტი შტამი ფსევდომონასი თანმიმდევრული იყო. [16] ასობით შტამების გენომის თანმიმდევრობამ გამოავლინა ძალიან განსხვავებული სახეობები გვარში. სინამდვილეში, ბევრი გენომი ფსევდომონასი იზიარებენ მათი გენების მხოლოდ 50-60%-ს, მაგ. P. aeruginosa და პ.პუტიდა იზიარებს მხოლოდ 2971 ცილას 5350-დან (ან

2020 წლისთვის 500-ზე მეტი დასრულებულია ფსევდომონასი გენომები ხელმისაწვდომი იყო Genebank-ში. ფილოგენომიურმა ანალიზმა გამოიყენა 494 სრული პროტეომი და გამოავლინა 297 ძირითადი ორთოლოგი, რომლებიც იზიარებენ ყველა შტამს. [13] გვარის დონეზე ძირითადი ორთოლოგების ეს ნაკრები გამდიდრებული იყო მეტაბოლიზმში, ტრანსლაციასა და ტრანსკრიფციაში ჩართული ცილებით და გამოიყენებოდა მთელი გვარის ფილოგენომიური ხის წარმოქმნისთვის, რათა გამოეკვეთა ურთიერთობათა შორის. ფსევდომონასი ძირითადი ევოლუციური ჯგუფები. [13] In addition, group-specific core proteins were identified for most evolutionary groups, meaning that they were present in all members of the specific group, but absent in other ფსევდომონადები. For example, several P. aeruginosa-specific core proteins were identified that are known to play an important role in this species' pathogenicity, such as CntL, CntM, PlcB, Acp1, MucE, SrfA, Tse1, Tsi2, Tse3, და EsrC. [13]

Members of the genus display these defining characteristics: [17]

Other characteristics that tend to be associated with ფსევდომონასი species (with some exceptions) include secretion of pyoverdine, a fluorescent yellow-green siderophore [18] under iron-limiting conditions. Certain ფსევდომონასი species may also produce additional types of siderophore, such as pyocyanin by Pseudomonas aeruginosa [19] and thioquinolobactin by Pseudomonas fluorescens,. [20] ფსევდომონასი species also typically give a positive result to the oxidase test, the absence of gas formation from glucose, glucose is oxidised in oxidation/fermentation test using Hugh and Leifson O/F test, beta hemolytic (on blood agar), indole negative, methyl red negative, Voges–Proskauer test negative, and citrate positive.

ფსევდომონასი may be the most common nucleator of ice crystals in clouds, thereby being of utmost importance to the formation of snow and rain around the world. [21]

Biofilm formation Edit

All species and strains of ფსევდომონასი have historically been classified as strict aerobes. Exceptions to this classification have recently been discovered in ფსევდომონასი ბიოფილმები. [22] A significant number of cells can produce exopolysaccharides associated with biofilm formation. Secretion of exopolysaccharides such as alginate makes it difficult for pseudomonads to be phagocytosed by mammalian white blood cells. [23] Exopolysaccharide production also contributes to surface-colonising biofilms that are difficult to remove from food preparation surfaces. Growth of pseudomonads on spoiling foods can generate a "fruity" odor.

ანტიბიოტიკების წინააღმდეგობა Edit

ყველაზე ფსევდომონასი spp. are naturally resistant to penicillin and the majority of related beta-lactam antibiotics, but a number are sensitive to piperacillin, imipenem, ticarcillin, or ciprofloxacin. [23] Aminoglycosides such as tobramycin, gentamicin, and amikacin are other choices for therapy.

This ability to thrive in harsh conditions is a result of their hardy cell walls that contain porins. Their resistance to most antibiotics is attributed to efflux pumps, which pump out some antibiotics before they are able to act.

Pseudomonas aeruginosa is increasingly recognized as an emerging opportunistic pathogen of clinical relevance. One of its most worrying characteristics is its low antibiotic susceptibility. [24] This low susceptibility is attributable to a concerted action of multidrug efflux pumps with chromosomally encoded antibiotic resistance genes (e.g., mexAB-oprM, mexXY, etc., [25] ) and the low permeability of the bacterial cellular envelopes. Besides intrinsic resistance, P. aeruginosa easily develops acquired resistance either by mutation in chromosomally encoded genes or by the horizontal gene transfer of antibiotic resistance determinants. Development of multidrug resistance by P. aeruginosa isolates requires several different genetic events that include acquisition of different mutations and/or horizontal transfer of antibiotic resistance genes. Hypermutation favours the selection of mutation-driven antibiotic resistance in P. aeruginosa strains producing chronic infections, whereas the clustering of several different antibiotic resistance genes in integrons favours the concerted acquisition of antibiotic resistance determinants. Some recent studies have shown phenotypic resistance associated to biofilm formation or to the emergence of small-colony-variants, which may be important in the response of P. aeruginosa populations to antibiotic treatment. [8]

Sensitivity to gallium Edit

Although gallium has no natural function in biology, gallium ions interact with cellular processes in a manner similar to iron(III). When gallium ions are mistakenly taken up in place of iron(III) by bacteria such as ფსევდომონასი, the ions interfere with respiration, and the bacteria die. This happens because iron is redox-active, allowing the transfer of electrons during respiration, while gallium is redox-inactive. [26] [27]

Animal pathogens Edit

Infectious species include P. aeruginosa, P. oryzihabitans, და P. plecoglossicida. P. aeruginosa flourishes in hospital environments, and is a particular problem in this environment, since it is the second-most common infection in hospitalized patients (nosocomial infections) [ საჭიროა ციტატა ] . This pathogenesis may in part be due to the proteins secreted by P. aeruginosa. The bacterium possesses a wide range of secretion systems, which export numerous proteins relevant to the pathogenesis of clinical strains. [28] Intriguingly, several genes involved in the pathogenesis of P.aeruginosa, როგორიცაა CntL, CntM, PlcB, Acp1, MucE, SrfA, Tse1, Tsi2, Tse3, და EsrC are core group-specific, [13] meaning that they are shared by the vast majority of P. aeruginosa strains, but they are not present in other ფსევდომონადები.

Plant pathogens Edit

P. syringae is a prolific plant pathogen. It exists as over 50 different pathovars, many of which demonstrate a high degree of host-plant specificity. Numerous other ფსევდომონასი species can act as plant pathogens, notably all of the other members of the P. syringae subgroup, but P. syringae is the most widespread and best-studied.

Although not strictly a plant pathogen, P. tolaasii can be a major agricultural problem, as it can cause bacterial blotch of cultivated mushrooms. [29] Similarly, P. agarici can cause drippy gill in cultivated mushrooms. [30]

Since the mid-1980s, certain members of the genus ფსევდომონასი have been applied to cereal seeds or applied directly to soils as a way of preventing the growth or establishment of crop pathogens. This practice is generically referred to as biocontrol. The biocontrol properties of P. fluorescens და P. protegens strains (CHA0 or Pf-5 for example) are currently best-understood, although it is not clear exactly how the plant growth-promoting properties of P. fluorescens are achieved. Theories include: the bacteria might induce systemic resistance in the host plant, so it can better resist attack by a true pathogen the bacteria might outcompete other (pathogenic) soil microbes, e.g. by siderophores giving a competitive advantage at scavenging for iron the bacteria might produce compounds antagonistic to other soil microbes, such as phenazine-type antibiotics or hydrogen cyanide. Experimental evidence supports all of these theories. [31]

Other notable ფსევდომონასი species with biocontrol properties include P. chlororaphis, which produces a phenazine-type antibiotic active agent against certain fungal plant pathogens, [32] and the closely related species P. aurantiaca, which produces di-2,4-diacetylfluoroglucylmethane, a compound antibiotically active against Gram-positive organisms. [33]

Some members of the genus are able to metabolise chemical pollutants in the environment, and as a result, can be used for bioremediation. Notable species demonstrated as suitable for use as bioremediation agents include:

  • P. alcaligenes, which can degrade polycyclic aromatic hydrocarbons. [34]
  • P. mendocina, which is able to degrade toluene. [35]
  • P. pseudoalcaligenes, which is able to use cyanide as a nitrogen source. [36]
  • P. resinovorans, which can degrade carbazole. [37]
  • P. veronii, which has been shown to degrade a variety of simple aromaticorganic compounds. [38][39]
  • პ.პუტიდა, which has the ability to degrade organic solvents such as toluene. [40] At least one strain of this bacterium is able to convert morphine in aqueous solution into the stronger and somewhat expensive to manufacture drug hydromorphone (Dilaudid).
  • Strain KC of P. stutzeri, which is able to degrade carbon tetrachloride. [41]

One way of identifying and categorizing multiple bacterial organisms in a sample is to use ribotyping. [42] In ribotyping, differing lengths of chromosomal DNA are isolated from samples containing bacterial species, and digested into fragments. [42] Similar types of fragments from differing organisms are visualized and their lengths compared to each other by Southern blotting or by the much faster method of polymerase chain reaction (PCR). [42] Fragments can then be matched with sequences found on bacterial species. [42] Ribotyping is shown to be a method to isolate bacteria capable of spoilage. [43] Around 51% of ფსევდომონასი bacteria found in dairy processing plants are P. fluorescens, with 69% of these isolates possessing proteases, lipases, and lecithinases which contribute to degradation of milk components and subsequent spoilage. [43] Other ფსევდომონასი species can possess any one of the proteases, lipases, or lecithinases, or none at all. [43] Similar enzymatic activity is performed by ფსევდომონასი of the same ribotype, with each ribotype showing various degrees of milk spoilage and effects on flavour. [43] The number of bacteria affects the intensity of spoilage, with non-enzymatic ფსევდომონასი species contributing to spoilage in high number. [43]

Food spoilage is detrimental to the food industry due to production of volatile compounds from organisms metabolizing the various nutrients found in the food product. [44] Contamination results in health hazards from toxic compound production as well as unpleasant odours and flavours. [44] Electronic nose technology allows fast and continuous measurement of microbial food spoilage by sensing odours produced by these volatile compounds. [44] Electronic nose technology can thus be applied to detect traces of ფსევდომონასი milk spoilage and isolate the responsible ფსევდომონასი სახეობა. [45] The gas sensor consists of a nose portion made of 14 modifiable polymer sensors that can detect specific milk degradation products produced by microorganisms. [45] Sensor data is produced by changes in electric resistance of the 14 polymers when in contact with its target compound, while four sensor parameters can be adjusted to further specify the response. [45] The responses can then be pre-processed by a neural network which can then differentiate between milk spoilage microorganisms such as P. fluorescens და P. aureofaciens. [45]

Recently, 16S rRNA sequence analysis redefined the taxonomy of many bacterial species previously classified as being in the genus ფსევდომონასი. [9] Species removed from ფსევდომონასი are listed below clicking on a species will show its new classification. The term 'pseudomonad' does not apply strictly to just the genus ფსევდომონასი, and can be used to also include previous members such as the genera ბურხოლდერია და Ralstonia.


მეთოდები

Mathematical modeling with piecewise-linear differential equations

Formalization of each of the regulatory components of the TOL system (Figure 1) as binary logic gates and the assembly of the complete network as a digital circuit has been described before [17]. The streamlined scheme of Figure 2c was used as a guide to the formulation of equations for each of the regulatory and metabolic steps of the network. To this end, we adopted piecewise-linear (PL) differential equations [45] for describing the circuit dynamics as described [21, 46]. The rationale of this approach is that production of metabolites in the model is determined by state equations, which define the metabolic reactions as the result of [i] the presence of substrates and [ii] the activation of a regulation function that encodes transcriptional and metabolic interactions. Under this scheme, a regulatory function accounts for the expression of a given gene and the production of the corresponding protein owing to the presence of an effector. Specific regulatory functions can thus be expressed as:

This equation indicates that the synthesis of product მე is a function of the presence of the effector . ამ განტოლებაში, + is a step function, a Boolean operator that is set to a value 1 if the concentration of (x ) is above a particular threshold ( ), and to a value 0 if the concentration is below . სინთეზი მე occurs at a rate determined by მე only when x > , and does not take place if x < . Ამ შემთხვევაში, is an activator of the synthesis of მე. By the same token, the effect of a repressor can be represented using a negative step function:

which is set to a value 1 when x < , and to a value 0 when x > . On this basis, the production of a given component of the network as a result of the combined influence of different effectors can be written as, e.g.:

where the appearance of product მე is regulated by the activator and the repressor . Such a component მე is synthesized only if is present and is absent. This is equivalent to a logic device (a logic gate) involving an AND/NOT operator (ANDN), taking და as inputs and producing მე as output. In this way, it is possible to model all possible transcriptional and metabolic interactions in the system as logic constructs, determining the production of particular compounds as a function of the presence or absence of some of the others [47]. Furthermore, it is possible to set different thresholds for the concentration of a particular compound when it controls different synthesis rates at different concentrations. For instance, if effector regulates the synthesis of A and B, we can set the constraint 1 < 2 , to indicate that synthesis of A is regulated by a lower concentration of than the synthesis of B. These constraints are known as threshold inequalities [21] and are described below for the TOL system. ასეთი threshold inequalities are related to the effective concentration of a given molecular species (e.g., a TF) above which it is able to have a regulatory effect on a target (e.g. promoter). In the case of TF-promoter pairs, inequalities are entered in the corresponding equations by means of a threshold value ( ) which represents the relative affinity of the TF under consideration for one or more target promoters. The active concentration of each of the components is then determined by its production rate (expressed by მე ), and its degradation rate ( მე * x მე ), which is a strictly positive function, proportional to the concentration of the compound. These simple expressions of positive and negative step functions were adopted for representing all possible regulatory interactions in the system. The resulting set of equations was then implemented with the GNA (Genetic Network Analyzer) software [21]. GNA models describe the evolution of the regulatory circuit by specifying qualitative constraints on the parameters of the system. This allows the model to be reliably run even if the actual threshold concentrations and the reaction rates at stake are not known. One set of constraints thus includes such threshold inequalities. A second type of constraints consists of the so-called focal inequalities that set the possible steady-state concentrations of the components in the system with respect to their threshold values, for instance:

This inequality indicates that when component მე is produced at rate მე and degraded with a rate constant მე , so that its concentration converges towards the level მე/g მე [45], it exceeds the threshold მე 1 , but not მე 2 . This allows an estimate of the concentration of the components in reference to their threshold values, even in absence of quantitative information on the parameters of the system. The inequalities for the TOL model were set as shown in Table 1.

It is possible to follow the dynamics of the regulatory network by computing a temporal progression of so-called qualitative states, each consisting of the levels of the concentration variables with respect to their thresholds. In each qualitative state the trend of the concentration variables (increasing/decreasing/steady) determines the possible transitions to successor states. The resulting directed graph of qualitative states and transitions between qualitative states is called a state transition graph (for a more detailed description, see [21, 46]. Note that the PL equations above and the associated transition graph describe the temporal order of signal propagation in the network when the first input signal is present and the system moves toward a steady state (where the concentrations of the components stop to change). The actual time interval during which the system remains in a state before reaching the next is not contained in these qualitative models. However, the representation reliably predicts the temporal ordering of states, and thus the consecutive changes in the levels of each of the components of the network.

Using the biological assumptions for known regulatory interactions (Figure 1) and the resulting logic operations (Figure 2c), we defined four PL equations describing XylR, XylS, ზედა და meta production (Table 1). The sole input for the system was -xylene, which was defined as an input variable i.e. one having a constant concentration along the simulations, [21]. For implementation of სილიკოში mutations, we changed threshold inequalities as follows. In one case პმ activation was simulated in the absence of the XylSh loop by setting the parameter 2 XylSh to be higher than the maximal concentration reachable upon ფს activation (No XylS hyper-expression condition, Table 1). Similarly, simulation of the პმ activation event in a scenario lacking XylSa, we set the ზედა pathway not to produce enough concentrations of 3 MBz for creating XylSa (No XylSa condition, Table 1). Consideration of different threshold inequalities in the TOL model allowed us to simulate the specific conditions as discussed in the Results section.

Strains, chemicals and growth conditions

E. coli CC118 strain [48] was used as the host for plasmid constructions and maintenance, while პ.პუტიდა mt-2 [41] was employed for the analysis of promoter activity with reporter constructs (see below). E. coli was grown in Luria-Bertani (LB) medium at 37°C. Unless indicated otherwise, პ.პუტიდა was cultured in a minimal medium M9 supplemented with MgSO4 (2.0 mM), citrate or succinate (0.2%) as the only carbon source and grown at 30°C. Plasmids were conjugally transferred from E. coli რომ პ.პუტიდა with a tripartite mating procedure [48] using E. coli HB101 (RK600) as the helper strain. When required, growth media was supplemented with kanamycin (Km, 50 μg/ml) or chloramphenicol (Cm, 30 m/ml). All chemicals and substrates, including aromatic effectors (-xylene, -xylene, 3-methylbenzyl alcohol and 3-methyl benzoate) were purchased from Sigma-Aldrich.

Construction of reporter gene fusions

The TOL promoters პუ, ფს და პმ were separately cloned in pSEVA226, a Km R broad host range vector (RK2 origin of replication) bearing a promoterless luxCDABE [49] operon downstream of the multiple cloning site of pUC (Silva-Rocha და სხვ., in preparation). To this end, each of the promoters of interest was amplified from პ.პუტიდა mt-2 DNA through PCR reactions with Pfu DNA polymerase (Promega) using primer pairs PUF (5'-GCG GAA TTC TTG ATC AAA TC GA CA GG TG GT TAT G-3') and PUR (5'-GCG CGG ATC CGT CTC GTA TAG CTA GCA ACC GCC-3') for პუ, PSF (5'-GGC CGA ATT CAT TCC ATC TGC CAC TTT AG-3') and PSR (5'-CGG CCG GAT CCC GGT TCT CTT ATT TTA ATG TGG-3') for ფს, and PMF (5'-CGG CCG AAT TCG GTT TGA TAG GGA TAA GTC C-3') and PMR (5'-CGG CCG GAT CCT CTG TTG CAT AAA GCC TAA-3') for პმ. These primers introduced in each case ეკოRI და ბამHI sequences in equivalent sites of the 5' and 3' regions of each promoter (underlined in the primer sequence). PCR products were purified, digested with ეკოRI და ბამHI (NewEngland BIolabs), ligated to pSEVA226 cleaved with the same enzymes and transformed in chemically competent E. coli CC118 cells. The resulting clones were named pSEVA226-პუ, pSEVA226-ფს and pSEVA226-პმ. Sequence fidelity of the cloned promoters was verified in all cases by DNA sequencing.

Promoter activity quantification and data processing

The activity of the TOL promoters in response to inducers was examined with different procedures depending on the nature of the specific chemical tested. In case of soluble inducers (3MBA and 3 MBz), overnight grown პ.პუტიდა cells harboring the reporter plasmid under examination were diluted 1:20 in fresh minimal media with the inducer of interest at a final concentration of 1 mM. 200 μl aliquots (with four replicates) of the thereby diluted cells were placed in 96-well Microplates (Optilux™, BD Falcon) and incubated in a Wallac Víctor II 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer) at 30°C, the optical density at 600 nm (OD600) and the bioluminescence being recorded every 30 min. Promoter activity was quantified by normalizing bioluminescence in respect to cell density (i.e. bioluminescence/OD600). For testing volatile inducers (-xylene and -xylene), single colonies of პ.პუტიდა clones bearing the reporter plasmids indicated were patched on M9/citrate agar plates, grown overnight an exposed to saturating vapors of a 1 M inducer solution in DMSO. Non-disruptive monitoring of promoter output was carried out with a VersaDoc™ Imaging System (BioRad) and the results processed with the ImageJ software (http://rsbweb.nih.gov/ij/). In either case, graphic representations of promoter activities were generated with MATLAB software (MathWorks).


დისკუსია

SQ is one of the most abundant organosulfur compounds in the biosphere, following glutathione, Cys, and Met, and the global production of SQ is estimated at 10 gigatons per year (2, 22). Although the biosynthesis of SQ and SQDG in plants, algae, cyanobacteria, and archaea has been studied in considerable detail (e.g., 23, 24), much less is known about the degradation reactions and the recycling of the carbon and sulfur bound in SQ and SQDG. The lipid can easily be hydrolyzed by plant acyl-hydrolases, which liberate SQ-glycerol (1), and glucosidases can liberate SQ in the next step (25) however, it is still unclear whether higher plants are capable of splitting the carbon/sulfur bond in SQ at significant rates. Indeed, inorganic sulfate is the predominant source of sulfur for growth of plants and algae, for example, and plant growth can become sulfur/sulfate-limited, for example, in soils that are sulfur-deficient due to intensive agriculture and to the effective measures to reduce sulfur emissions to the atmosphere in recent years (26, 27) phytoplankton growth in freshwater environments can also become sulfate/sulfur-limited (28). The recycling of the sulfur bound in SQ is catalyzed by heterotrophic bacteria, which can easily be enriched from soil (5, 7 ⇓ –9), and involves the degradation intermediates DHPS and SL, but no release of sulfate, if SQ-utilizing bacteria are grown in pure culture (10 ⇓ –12). Later work demonstrated that SQ can be degraded completely by two-member bacterial communities, that is, by a primary degrader with transient release of SL or DHPS and a secondary degrader with release of sulfate (11, 12). Pathways for the degradation of DHPS and SL, including desulfonation, have been described (13, 15, 29) where, briefly, DHPS is oxidized to SL and the SL is mineralized via one of three known pathways and desulfonative enzymes [i.e., SL sulfolyase (SuyAB EC 4.4.1.24), sulfoacetaldehyde acetyltransferase (Xsc EC 2.3.3.15), cysteate sulfolyase (CuyA EC 4.4.1.25)]. However, details on the pathways, enzymes, and genes for the conversion of SQ to DHPS and SL were missing. A first pathway, sulfoglycolysis leading to DHPS, was found in E. coli K-12, and this pathway seems to be widespread in Enterobacteria (12). A second pathway, leading to SL, in a typical soil and freshwater bacterium, an isolate of პ.პუტიდა, has been revealed in this study.

Strain SQ1 is able to access half of the carbon atoms of SQ for its heterotrophic aerobic growth through abstraction of a nonsulfonated C3-unit in the form of pyruvate, whereas the C3-organosulfonate half of the substrate is not dissimilated but excreted in the form of SL (Fig. 1 და ). Four organosulfonate intermediates were detected (SGL, SG, KDSG, and SLA), and five corresponding enzymes were identified [NAD + -dependent SQ dehydrogenase, SGL lactonase, SG dehydratase, KDSG aldolase, and NAD(P) + -dependent SLA dehydrogenase]. Hence, this primary degradation pathway for SQ in პ.პუტიდა SQ1 follows a catabolic route that resembles an Entner–Doudoroff pathway for SQ (Fig. 1 და ), as was obviously suspected previously (10).

It is striking that the enzymes that catalyze the analogous reactions in either the SQ or GP Entner–Doudoroff pathway in პ.პუტიდა SQ1 are encoded and regulated in different gene clusters (operons), as is the case with sulfoglycolysis and classical glycolysis in E. coli K-12 (12). It is even more surprising that most of these enzymes belong to different enzyme families. Only SG dehydratase and PG dehydratase belong to the same protein family [dihydroxy-acid/6-phosphogluconate dehydratases Cluster of Orthologous Groups (COG) 0129]. SQ dehydrogenase (0090) belongs to the NAD(P) + -dependent short-chain alcohol dehydrogenase family (COG1028), and thus to a different family than typical GP 1-dehydrogenases (COG0364). Further, the SGL lactonase (0091) is a sugar lactone hydrolase family protein (COG3386), whereas PGL lactonase is an archetypal glucosamine-6-phosphate isomerase/6-phosphogluconolactonase family protein (COG0363). The KDSG aldolase (0100) is a 2-keto-3-deoxyrhamnonate aldolase family protein (COG3836), and is most similar to 2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acid/4-hydroxy-2-oxovalerate aldolases of aromatic-ring cleavage pathways, whereas the KDPG aldolase is an archetypal KDPG/4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase family protein (COG0800). These phylogenetic differences are reflected in the observed substrate specificities of the enzymes of the SQ pathway, as far as tested in this study. It remains unclear which factors are responsible for the enzymes’ specificity for 6-deoxy-6-sulfo- (monoanionic) over 6-phospho-substituted (dianionic) substrate analogs, and thus for their recruitment into the pathway, but these questions can now be addressed.

The newly identified SQ degradation gene cluster of პ.პუტიდა SQ1 also contains other genes that are likely to be involved in SQ utilization. Gene 0097 is predicted to encode a sulfite/small organosulfonate exporter (TauE PF01925) (30, 31), and this gene was cotranscribed during growth with SQ (Fig. 3C). Hence, gene 0097 most likely encodes for an inducible SL exporter. Gene 0094 is predicted to encode an alpha-glucosidase (COG1501 family 31 glycosyl hydrolase), and this gene was also cotranscribed (Fig. 3C) and highly coexpressed (Fig. 3 და ), specifically during growth with SQ. Hence, we predict that gene 0094 encodes for hydrolysis of SQ-glyceride (e.g., for utilization of the whole sulfolipid SQDG as a growth substrate). Further, gene 0092 was cotranscribed (Fig. 3C) and is predicted to encode an aldose epimerase (COG2017), most likely for catalysis of the equilibrium of alpha- and beta-anomers of SQ such function would imply that the SQ Entner–Doudoroff pathway is anomer-specific. Finally, SQ transport might be encoded by the cotranscribed (Fig. 3C) predicted sodium/solute symporter (SSS) family transporter gene (0094) or by the predicted galactonate major facilitator superfamily (MFS) transporter gene (0098) the outer membrane porin (OMP) gene (0093) may be involved in degradation of SQDG.

Thirty genome sequences of პ.პუტიდა strains are available for genome-wide comparisons within the IMG search platform (as of April 2015), and in three of these genomes, syntenic SQ gene clusters were found, as illustrated in Fig. 5 (in პ.პუტიდა strains H8234, OUS82, and SJ3). Putative SQ-degradation gene clusters with homologs for the core genes identified in პ.პუტიდა SQ1 were found in other gamma-Proteobacteria, and in beta- and alpha-Proteobacteria, but as differently assembled (nonsyntenic) gene clusters, as illustrated in Fig. 5. For some of these clusters, a corresponding SLA dehydrogenase candidate gene (indicated in red in Fig. 5) was not found however, the predicted SL exporter (TauE gene 0097 in strain SQ1) and alpha-glucosidase gene (0094) appeared to be conserved in most of these candidate SQ-gene clusters (indicated in gray in Fig. 5). Such gene clusters were found in genomes of species of (gamma-Proteobacteria) ვიბრიო, აერომონასი, and Enterobacteria (სერრატია, Plesiomonas, Hafnia, Leminorella, და Edwardsiella) of (beta-Proteobacteria) ბურხოლდერია, Janthinobacterium, და Herbaspirillum and of (alpha-Proteobacteria) რიზობიუმი, Ensifer, Microvirga, Salinarimonas, და Acidocella (Fig. 5). Interestingly, some of these strains are isolated gut symbionts (e.g., the Enterobacteria strains Hafnia alvei ATCC51873, Leminorella grimontii DSM5078, სერრატია sp. Ag2) and/or potential pathogens (e.g., ვიბრიო, Plesiomonas, Halomonas), whereas other strains represent typical marine- or saline-associated bacteria (e.g., Halomonas, Salinarimonas) and typical freshwater-, soil-, and plant rhizosphere-associated bacteria (e.g., რიზობიუმი, Ensifer, Herbaspirillum, Microvirga). Whether these isolated strains are indeed able to use SQ for growth, and whether utilization of SQ is indeed a relevant trait in the habitats from which these strains originated, needs to be addressed.

Illustration of the SQ-degradation gene cluster in პ.პუტიდა SQ1 with its five identified core genes () and of homologous, predicted SQ-degradation gene clusters found in genomes of other პ.პუტიდა, other gamma-Proteobacteria (), and in beta- and alpha-Proteobacteria (C და , respectively). Homologous gene clusters in bacterial genomes were retrieved from the Joint Genome Institute’s IMG database by the Gene Cassette Search tool and the Gene Neighborhood viewer. Shown are gene clusters that contain gene homologs for at least four of the five core enzymes of the SQ Entner–Doudoroff pathway (genes are indicated by color coding). Also, candidate genes for SL export and for a predicted SQ-glyceride (SQG) alpha-glucosidase (main text) were frequently found to be conserved within these homolog clusters (gene symbols in gray). Note that other candidate genes in the clusters are not specified in this figure (gene symbols in white) for example, more variable genes were predicted for outer membrane porins, other transporters, or regulation (Fig. 1C).