ინფორმაცია

შთანთქმის კოეფიციენტები 260/280 და 260/230 რნმ-სთვის

შთანთქმის კოეფიციენტები 260/280 და 260/230 რნმ-სთვის



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

მე ამოვიღე რნმ სხვადასხვა უჯრედული ხაზიდან, მინდა ჩავატარო საპირისპირო ტრანსკრიფცია და შემდეგ PCR. კარგი შედეგების მისაღებად რომელ დიაპაზონში უნდა იყოს შთანთქმის კოეფიციენტები 260/280 ნმ და 260/230 ნმ? და რა არის იდეა ამ კოეფიციენტების გაზომვის უკან?

მე მივიღე მნიშვნელობები 260/280 თანაფარდობისთვის 2.1-დან 2.13-მდე და მნიშვნელობები 260/230 თანაფარდობისთვის 0.98-დან 2.01-მდე. მისაღებია თუ არა ეს ღირებულებები და რა ინფორმაციის მიღება შემიძლია მათგან?


დნმ და რნმ შთანთქავს 260 ნმ. ცილები შეიწოვება 280 ნმ. 260/280 თანაფარდობა არის კარგი შეფასება იმისა, თუ რამდენად სუფთაა თქვენი ნიმუში. რნმ-სთვის 260/280 უნდა იყოს დაახლოებით 2. თუ ის უფრო დაბალია, ეს შეიძლება იყოს თქვენი ნიმუშის დაბინძურების ან ცილების, ფენოლის ან სხვა დამაბინძურებლების ნიშანი. 260/230 თანაფარდობა არის ნიმუშის სისუფთავის მეორე საზომი, რადგან დამაბინძურებლები შთანთქავენ 230 ნმ-ზე (როგორც EDTA). 260/230 თანაფარდობა უფრო მაღალი უნდა იყოს ვიდრე 260/280, რადგან ის ჩვეულებრივ 2-დან 2.2-მდეა. დაბალი თანაფარდობა შეიძლება იყოს დაბინძურების მანიშნებელი.

თქვენს შემთხვევაში, მე მაწუხებს ნიმუშის სისუფთავე, რომელმაც მოგცათ 260/230 თანაფარდობა 0.98. თუ თქვენ იყენებთ ნანოდროპს, ნაკვეთის დათვალიერება ასევე შეიძლება კარგი მაჩვენებელი იყოს თქვენი ნიმუშის ხარისხზე. სუფთა ნიმუშისთვის, მოსალოდნელია კარგად განსაზღვრული პიკი (მხრების ან რხევის გარეშე) 260 ნმ.

მეტი ინფორმაციისთვის გადახედეთ NanoDrop სახელმძღვანელოს.


შთანთქმის კოეფიციენტები 260/280 და 260/230 რნმ-სთვის - ბიოლოგია

მაღალი ხარისხის დნმ-ის მოპოვება გოსიპიუმი (ბამბის) სახეობა აშკარად რთულია პოლისაქარიდების, ქინონების და პოლიფენოლების სხვა მეორადი მეტაბოლიტების მაღალი შემცველობის გამო. აქ ჩვენ აღვწერთ მარტივ, სწრაფ და შეცვლილ პროცედურას ბამბისგან მაღალი ხარისხის დნმ-ის ექსტრაქციისთვის, რომელიც ექვემდებარება ქვედა დინების ანალიზს. სხვა CTAB მეთოდებისგან განსხვავებით, აღწერილი პროცედურა არის სწრაფი, გამოტოვებს თხევადი აზოტის, ფენოლის, CsCl გრადიენტური ულტრაცენტრფუგაციის გამოყენებას, იყენებს იაფ და ნაკლებად საშიშ რეაგენტებს და მოითხოვს მხოლოდ ჩვეულებრივ ლაბორატორიულ აღჭურვილობას. პროცედურამ გამოიყენა NaCl-ის მაღალი კონცენტრაცია და PVP-10-ის გამოყენება პოლისაქარიდებთან და პოლიფენოლებთან დაკავშირებული პრობლემების აღმოსაფხვრელად. საშუალო მოსავლიანობა იყო დაახლოებით 10-15 მკგ კარგი ხარისხის დნმ-ის 100 მგ ქსოვილის წონისგან, რაც ადეკვატურია ისეთი პროექტებისთვის, როგორიცაა გენეტიკური რუქა ან მარკერების დახმარებით მცენარეთა მოშენება. ეს პროტოკოლი შეიძლება შესრულდეს სულ მცირე 3 საათში და შეიძლება ადაპტირებული იყოს მაღალი გამტარუნარიანობის დნმ-ის იზოლაციისთვის.

ბუფერები A და B იყო გადამუშავებული Paterson et al. (1993) და პორებსკი და სხვ. (1997), შესაბამისად.

რიბონუკლეაზა A დაემატა ქლოროფორმის მოპოვებამდე.

აღწერილია დნმ-ის ექსტრაქციის მარტივი, სწრაფი და იაფი მეთოდი.


ფონი

ციანობაქტერიები გრამუარყოფითი პროკარიოტებია, რომლებიც სინთეზირებენ ქლოროფილს და განახორციელოს წყლის ფოტოსინთეზური დაჟანგვა [1]. ვინაიდან მათ აქვთ მარტივი კვების მოთხოვნები, ესაჭიროებათ მხოლოდ ჰაერი, წყალი და მინერალური მარილები, სინათლის ერთადერთი ენერგიის წყაროა [2], მათი პოტენციური სამრეწველო გამოყენება მნიშვნელოვანია - მაგ. წყალბადის წარმოება [3, 4] სხვადასხვა ბიოტექნოლოგიური მიზნებისათვის [5].

ამ ბიოტექნოლოგიური პოტენციალის გასავითარებლად, მნიშვნელოვანია ციანობაქტერიული ფიზიოლოგიისა და მეტაბოლიზმის სხვადასხვა ასპექტების საფუძვლიანად გააზრება. როგორც ასეთი პროცესის ნაწილი, სასიცოცხლოდ მნიშვნელოვანია გენის ექსპრესიის სანდო მონაცემების მიღება. ასეთი მონაცემების მისაღებად რეგულარულად გამოიყენება რამდენიმე მეთოდი, ჩრდილოეთის ბლოტიდან მიკრომასივებამდე. მიღებული მონაცემების ვალიდობა და განმეორებადობა დამოკიდებულია მოპოვებული რნმ-ის ხარისხზე და გენომიური დნმ-ის დაბინძურების ხარისხზე. თუმცა, ციანობაქტერიები წარმოადგენენ განსაკუთრებულ გამოწვევებს, როდესაც საქმე ეხება ნუკლეინის მჟავას იზოლაციას - ამ ორგანიზმებს აქვთ მეორადი მეტაბოლიტების გაფართოებული მასივი [6], რომლებიც აზიანებენ მაგ. უჯრედების ლიზისი და ნუკლეინის მჟავის გაწმენდა [7].

რნმ-ის პრეპარატების ხარისხის შესაფასებლად ჩვეულებრივ გამოიყენება ორი სტრატეგია: სპექტროფოტომეტრიული ანალიზი და რიბოსომური მთლიანობის შემოწმება ელექტროფორეზით.

სპექტროფოტომეტრიული ანალიზიდან ჩვეულებრივ მხედველობაში მიიღება შთანთქმის სამი მნიშვნელობა - 230, 260 და 280 ნმ. თანაფარდობა შთანთქმას შორის 260 ნმ და 280 ნმ გამოიყენება ნუკლეინის მჟავის სისუფთავის შესაფასებლად - "სუფთა" რნმ-სთვის მოსალოდნელია თანაფარდობა დაახლოებით 2.0. უფრო დაბალი თანაფარდობა შეიძლება მიუთითებდეს ცილების და პეპტიდების არსებობაზე, რომლებიც შთანთქავენ დაახლოებით 280 ნმ. გარდა ამისა, თანაფარდობა შთანთქმას შორის 260 ნმ-სა და 230 ნმ-ზე მოსალოდნელია იყოს 2.2 "სუფთა" ნუკლეინის მჟავას ნიმუშებისთვის. უფრო დაბალი თანაფარდობა შეიძლება იყოს პეპტიდებით, ფენოლებით, არომატული ნაერთებით ან ნახშირწყლებით დაბინძურების შედეგი.

რიბოსომური რნმ-ის ქვეერთეულების მთლიანობა (23S, 16S და 5S პროკარიოტებისთვის), დაბალი წონის რნმ-ის დეგრადაციის პროდუქტების არსებობა/არარსებობა და გენომიური დნმ-ის დაბინძურების არსებობა/არარსებობა ჩვეულებრივ ვიზუალიზდება აგაროზის გელის ელექტროფორეზის გამოყენებით. იდეალურ შემთხვევაში, ყველა მოსალოდნელი რიბოსომური რნმ-ის ქვედანაყოფი უნდა იყოს დაკვირვებული, რნმ-ის დეგრადაციის პროდუქტების ან გენომიური დნმ-ის არსებობის ნიშნების გარეშე.

გუანიდინის თიოციანატ-ფენოლ-ქლოროფორმის ექსტრაქცია [8, 9], კომერციულად ხელმისაწვდომია როგორც TRIzol (Invitrogen-დან) ან TRI Reagent (მოლეკულური კვლევის ცენტრიდან), არის ხშირად გამოყენებული მეთოდი ციანობაქტერიული რნმ-ის ექსტრაქციისთვის. ეს მეთოდი, ამ წერტილიდან მოხსენიებული, როგორც ტრიზოლი, ჩვეულებრივ ასოცირდება მძივის ცემასთან, უჯრედების ფიზიკური დარღვევისთვის. წინამდებარე ნაშრომში ჩვენ წარმოგიდგენთ PGTX რეაგენტს, ტრიზოლის შემცირებული ღირებულების ალტერნატივას და ვაფასებთ მის გამოყენებას მოპოვების პროტოკოლის სხვადასხვა ვარიანტების შესწავლისას.


ნიმუშის მთლიანობა

გელის სურათი უნდა იყოს წარმოდგენილი დნმ-ის ყველა ნიმუშთან ერთად. გელი უნდა შეიცავდეს ზომის კიბეს, რომელსაც უნდა ჰქონდეს ზედა მარკერი 40 kbp-ზე მეტი ან ტოლი (მაგ. NEB 1 kb Extended DNA Ladder ან Invitrogen 1 Kb DNA Extension Ladder). გელის გამოყენება უნდა მოხდეს ნელა და საკმარისად ხანგრძლივად, რათა შესაძლებელი იყოს იმის დადგენა, არის თუ არა მოკვეთილი დნმ ნიმუშში. გახეხილი დნმ-ის არსებობა იმის მაჩვენებელია, რომ ნიმუშში HMW დნმ-იც კი შეიცავს ძალიან დიდ დაზიანებას, რომელიც არ გამოსწორდება ნიკის ფერმენტული შეკეთებით.


შთანთქმის კოეფიციენტები 260/280 და 260/230 რნმ-სთვის - ბიოლოგია

ბიოქიმია ყველასთვის სახალისო და ხელმისაწვდომი გახადოს მისიაზე

უსმენთ თქვენს სპექტროგრაფიულ მწვერვალებს, როცა ისინი ლაპარაკს ცდილობენ? ან უბრალოდ უყურებთ უმაღლესს და თვლით, რომ გამწმენდი სამუშაო დასრულებულია? ეს ყველაზე მწვერვალი *შეიძლება* გითხრათ კონცენტრაცია და დაშლა, მაგრამ დანარჩენ სპექტრს შეუძლია გითხრათ დაბინძურების შესახებ! და ამ დაბინძურებამ შეიძლება გამოიწვიოს ინფლაცია, რაც იწვევს დნმ/რნმ/ცილის კონცენტრაციის გადაჭარბებულ შეფასებას! ამ სიტუაციაში ხარ? Საიდან იცი? შეხედეთ 260/230 და გამაძლიერებელი 260/280 თანაფარდობას!

სპექტროფოტომეტრი შეიძლება გამოვიყენოთ იმ მოლეკულების სიცოცხლის გასანათებლად, რომლებიც სიცოცხლეს გვაძლევენ და იმედია მეცნიერი აღფრთოვანებული იქნება! ჩვენ ხშირად ვიყენებთ სპექტროსკოპიას (როგორიცაა NanoDrop სპექტროფოტომეტრით) ისეთი მოლეკულების კონცენტრაციის გასაზომად, როგორიცაა ნუკლეინის მჟავები (დნმ ან რნმ) ან პროტეინები და შუქის გამოსხივება მათ შემცველ ხსნარებში და ვხედავთ, თუ რამდენი შუქი იპარება გზაზე, შეგვიძლია. გამოთვალეთ რამდენად სავსე იყო ხსნარი ამ მოლეკულებით.

ეს შესაძლებელია, რადგან სხვადასხვა მოლეკულებს აქვთ განსხვავებული მიდრეკილება სხვადასხვა ტალღის სიგრძის სინათლის შთანთქმის სხვადასხვა ზომით (მეტი წამში). თუ თქვენ ანათებთ მოლეკულას და აქცევთ მას ტალღის სიგრძეს, რაც უფრო მეტია მოლეკულა, მით მეტი იქნება მოპარული. შეგიძლიათ უბრალოდ გაზომოთ ამ საყვარელი ტალღის სიგრძის შთანთქმა და, თუ გაქვთ სუფთა ნიმუში და იცით, რამდენად მოსწონს თქვენს მოლეკულას ეს ტალღის სიგრძე (გადაშენების კოეფიციენტი), შეგიძლიათ გამოთვალოთ კონცენტრაცია (ლუდის კანონის გამოყენებით, რომელსაც ჩვენ მივიღებთ) სინათლის ერთი ტალღის სიგრძის გამოყენებით.

მაგრამ არის თქვენი ნიმუში ნამდვილად სუფთა? თუ სხვა მოლეკულებსაც მოსწონს ეს ტალღის სიგრძე, მათ შეუძლიათ ხელოვნურად გაზარდონ თქვენი კონცენტრაცია და რომ აღარაფერი ვთქვათ სხვა პრობლემებზე დაბინძურებული მოლეკულების გარშემო, რამაც შეიძლება ხელი შეუშალოს ნივთებს.

ასე რომ (თუ შესაძლებელია) თქვენ უბრალოდ არ უნდა შეხედოთ ერთი ტალღის სიგრძის შთანთქმის მნიშვნელობას და ამის ნაცვლად, შეგიძლიათ გაიგოთ ბევრი რამ, თუ გაზომავთ ელექტრომაგნიტური გამოსხივების (EMR) სპექტრის მთელ ულტრაიისფერ (UV) და ხილული სინათლის ნაწილებს. თითოეული ტალღის სიგრძე, რომელიც შეიწოვება, გამოჩნდება, როგორც შთამნთქმელი სპექტროგრაფი, რომელიც გვიჩვენებს, თუ რამდენ ტალღის სიგრძის შუქს აეკრძალა იგი ნიმუშის გავლით მეორე მხარეს დეტექტორამდე.

მწვერვალის სიმაღლე, რომელზეც ჩვეულებრივ ყურადღებას ამახვილებთ კონკრეტული მოლეკულისთვის, არის ის, სადაც ის უკეთესად შთანთქავს -> ეს შეესაბამება ნივთიერების რაოდენობას (კონცენტრაცია) (იმ მოლეკულის და ამ ტალღის სიგრძის შთანთქმის სურვილის გათვალისწინებით (მისი გადაშენების კოეფიციენტი). სისუფთავის შესახებ ბევრი ინფორმაციის მიღება შეგიძლიათ, თუ დაათვალიერეთ სად *არ&rsquot* უნდა შთანთქავენ დიდ შუქს და მწვერვალებს შორის თანაფარდობამ შეიძლება გითხრათ, რამდენად სუფთაა ეს ნივთიერება.

იმის გასაგებად, თუ რატომ არის ეს, პირველ რიგში უნდა დავრწმუნდეთ, რომ ნათლად ვხვდებით რა არის &ldquolight&rdquo &ndash ასე რომ სწრაფი მიმოხილვა&hellip

სინათლე (ელექტრომაგნიტური გამოსხივება) (EMR) შეიძლება მივიჩნიოთ, როგორც ენერგიის პატარა პაკეტები, რომელსაც ეწოდება ფოტონები, რომლებიც მოძრაობენ ტალღებში. სხვადასხვა ფერს აქვს სინათლის ტალღის სხვადასხვა სიგრძე სხვადასხვა ფოტონის ენერგიით (ეს ასევე ეხება &ldquoinvisible&rdquo ფერებს &ndash ტალღის სიგრძეებს ხილული სპექტრის გარეთ და რადიოტალღების მსგავსად, რომლებიც უფრო დაბალი სიხშირეა და ულტრაიისფერი (UV) ტალღები, რომლებიც უფრო მაღალი სიხშირეა. სიხშირე ეხება იმას, თუ როგორ ხშირად ტალღების მწვერვალები მოდის და ეს პირდაპირ კავშირშია ენერგიასთან და უფრო მეტ ენერგიასთან, უფრო მაღალ სიხშირესთან და, რადგან ყველა EMR მოძრაობს ერთი და იგივე წრფივი სიჩქარით, ეს მწვერვალები უნდა მიუახლოვდნენ ერთმანეთს, რათა ენერგიულმა მწვერვალებმა არ გადააჭარბონ ჩამორჩენილს. (არ დააბნიოთ ეს მწვერვალები სპექტროგრაფიული მწვერვალებით).

როგორც დავპირდი, რომ უფრო მეტს გეტყვით, სხვადასხვა მოლეკულა შთანთქავს სინათლის სხვადასხვა ტალღის სიგრძეს სხვადასხვა ზომით, და ეს შეიძლება რაოდენობრივად განისაზღვროს რიცხვით, რომელსაც ეწოდება გადაშენების კოეფიციენტი, რომელიც გეტყვით, რამდენად კარგად შთანთქავს მოლეკულა კონკრეტული ტალღის სიგრძის სინათლეს. კიდევ უფრო მეტი *რატომ* აქ: http://bit.ly/2CfaXbJ

მაგრამ, ძირითადად, მოლეკულები შედგება ატომებისგან (ეს არის ცალკეული &ldquoC&rdquos & &ldquoH&rdquos & &ldquoO&rdquos ქიმიურ სტრუქტურებში) და ატომები შედგება მკვრივი ცენტრალური ბირთვისგან, სადაც დადებითად დამუხტული პროტონები და ნეიტრალური ნეიტრონები არიან. და უარყოფითად დამუხტული ელექტრონები მათ ირგვლივ ტრიალებენ "ელექტრონულ ღრუბელში".&rdquo ამ ელექტრონებს მართავს ბირთვში არსებული პროტონების საპირისპირო მუხტი. მე მიყვარს ბირთვი, როგორც ძაღლის მოსიარულე, რომელიც ენერგიული ელექტრონული ძაღლების თაიგულზე დადის. მაგრამ უფრო ძნელია ამ მუხტის შეგრძნება, როცა უფრო შორს ხარ, ასე რომ, სიყვარულს არ გრძნობ, ყველაზე შორეული ელექტრონები ყველაზე ნაკლებად ლოიალურები არიან და ყველაზე ენერგიულები (მათ არ უნდა დახარჯოს იმდენი ენერგია, რომ წინააღმდეგობა გაუწიოს ამ წევას). ასე რომ, ისინი დიდი ალბათობით ურთიერთქმედებენ სხვა მოლეკულებთან. ჩვენ ვუწოდებთ ამ ენერგიულ, გარე ელექტრონებს &ldquovalence ელექტრონებს&rdquo და ისინი არიან ისეთები, რომლებიც ჩვენ ყველაზე მეტად გვაინტერესებს უმეტეს დროს. ისინი არიან ისეთები, რომლებსაც შეუძლიათ გააკეთონ ისეთი რამ, როგორიცაა სახლების შერწყმა სხვა ატომების ელექტრონებთან, რათა მოგაწოდოთ ძლიერი კოვალენტური ბმები ან &ndash, რაც ამ შემთხვევაში მნიშვნელოვანია და მათ შეუძლიათ ფოტონების შთანთქმა.

მათ შეუძლიათ*, მაგრამ ეს არ ნიშნავს, რომ ისინი * დაარკვევენ, შთანთქავს თუ არა მოლეკულა სინათლის გარკვეულ ტალღის სიგრძეს, აქვს თუ არა კავშირი მის ვალენტურ ელექტრონებს ამჟამად და რამდენი ენერგია სჭირდებათ მათ შემდეგ დონეზე გადასასვლელად. მე ვსაუბრობდი, რომ არსებობს ელექტრონული ღრუბელი, მაგრამ ეს ღრუბელი ჰგავს საცხოვრებელ უბანს და არის ადგილები, რომლებსაც ელექტრონები უფრო მეტად მოსწონთ, ასე რომ, მიუხედავად იმისა, რომ ისინი მუდმივად ტრიალებენ გარშემო, თქვენ გაქვთ ყველაზე დიდი შანსი, იპოვოთ ისინი ელექტრონულ სახლებში და უფრო ფორმალურად. მოხსენიებულია როგორც &ldqumolecular orbitals&rdquo

თქვენ შეგიძლიათ წარმოიდგინოთ ეს, როგორც ელექტრონებს, რომლებსაც სჭირდებათ ქირავნობის გადახდა და ენერგიის სახით სხვადასხვა სახლებში საცხოვრებლად. და იმ პროტონის მომზიდველი ენერგიის წყალობით, რაზეც მე ვსაუბრობდი, ორბიტალები მოლეკულების ბირთვებიდან უფრო შორს და გამოდიან ელექტრონულ გარეუბანში, ელექტრონებს სჭირდებათ უფრო მაღალი რენტის გადახდა (უფრო მეტი ენერგია აქვთ), ვიდრე უფრო ახლოს. ელექტრონები ჩვეულებრივ იცხოვრებენ იქ. დაწყებული მდგომარეობა, სადაც ისინი შორდებიან რაც შეიძლება *კომფორტულად*. მაგრამ საბინაო ვითარება არ არის ჩამოყალიბებული, და შესაძლებელია მისი განახლება, მაგრამ თქვენ უნდა შეძლოთ ქირაში სხვაობის გადახდა. &ldquoზუსტ&rdquo ცვლილება. და ეს ენერგეტიკული ფული შეიძლება მოდიოდეს სინათლის ფოტონებიდან, მაგრამ ამ სინათლეს უნდა ჰქონდეს მოლეკულა და ოპტიმალური ენერგია.

უნიკალური ქიმიური შემადგენლობის წყალობით, სხვადასხვა მოლეკულებს აქვთ ელექტრონული სახლები, რომლებიც განსხვავებულად არის განლაგებული მათ შორის განსხვავებული ენერგეტიკული განსხვავებებით, ამიტომ აღგზნებისთვის საჭირო ენერგიის რაოდენობა განსხვავდება მოლეკულიდან მოლეკულამდე და სინათლისგან ამ ენერგიის მისაღებად საჭიროა სინათლე. ფოტონებით, რომლებიც გაძლევენ &ldquoზუსტ ცვლილებას&rdquo გადაიხადოთ ქირის სხვაობა. ასე რომ, სხვადასხვა მოლეკულა შთანთქავს სინათლის სხვადასხვა ტალღის სიგრძეს.

თუ ძაღლის ანალოგიას ანიჭებთ უპირატესობას, სუბატომურ დონეზე ის ჰგავს ძაღლს, რომელიც ხედავს ციყვს, აღელვდება და ჭიმავს ჭიპს, რომ უფრო შორს წავიდეს. სხვადასხვა მოლეკულებს აქვთ ელექტრონები, რომლებიც აღგზნდებიან "სხვადასხვა ციყვებით".

ციყვი ან გარეუბნები, აღგზნებულ ელექტრონს შეუძლია დიდხანს დარჩეს ამ გარე ორბიტალში და დაბრუნდეს თავის უფრო მყუდრო ფუნდამენტურ მდგომარეობამდე და დაუბრუნდეს ენერგიას, რომელიც მან შთანთქა. ფლუორესცენციის დროს აბსორბირებული ენერგია გამოიყოფა სხვა ფოტონის სახით (მაგრამ განსხვავებული, დაბალი ენერგიის, ტალღის სიგრძის) და ტალღის სიგრძის სახით, მაგრამ უმეტეს შემთხვევაში, როდესაც მოლეკულა შთანთქავს სინათლეს, ის უბრალოდ იტაცებს მას ელექტრომაგნიტური გამოსხივების (EMR) სპექტრიდან და იმის ნაცვლად, რომ მოგვცეს. სინათლე, ის კარგავს ენერგიას სითბოს სახით და ა.შ.

მაგრამ ჩვენ მაინც შეგვიძლია აღმოვაჩინოთ, რომ შუქი მოიპარეს და თუ ის იპარავს შუქს სპექტრის ხილული სინათლის ნაწილიდან, შეგვიძლია ვთქვათ, რომ რაღაც მოხდა ჩვენი შეუიარაღებელი თვალით. თეთრი შუქი შედგება ცისარტყელის ყველა ფერისგან და, თუ ერთი ფერი მოიპარეს (შეიწოვება), ჩვენ ვხედავთ &ldquoleftovers&rdquo-ს, როგორც სხვა ფერს. ფერის ბორბალი გეხმარებათ დაინახოთ რა ფერი გამოჩნდება, თუ მისი საპირისპირო ფერი შეიწოვება.

მაგრამ მოლეკულებს ასევე შეუძლიათ შთანთქას სინათლე, რომელსაც ჩვენ ვხედავთ და ხშირად ეს ეხება ულტრაიისფერ სხივებს! მიუხედავად იმისა, რომ ჩვენ შეგვიძლია ვნახოთ ულტრაიისფერი, სპექტროფოტომეტრს შეუძლია. ასე რომ, ჩვენ შეგვიძლია შევხედოთ სპექტროგრაფს და ვიმედოვნებთ, რომ გავიცინებთ ბოლო.

არ გაგიკვირდეთ, თუ ხედავთ მრავალ და/ან ფართო პიკს, რადგან მოლეკულებს შეიძლება ჰქონდეთ უამრავი ატომები ბევრი ელექტრონით და რადგან არის გარკვეული "მოძრავი ოთახი" ენერგიის დონეებთან დაკავშირებით, მოლეკულები უბრალოდ არ შთანთქავენ ერთ ტალღის სიგრძეს. მათ ხშირად აქვთ ტალღის სიგრძე, რომელსაც ყველაზე ძლიერად შთანთქავენ, რაც შეესაბამება ყველაზე ადვილად დაწინაურებულ ელექტრონს, ოდნავ დაბალი შთანთქმით ორივე მხარეს (ზარის მრუდის მსგავსად), რომელიც შეესაბამება რხევის ტევადობას და შემდეგ შესაძლოა მეორადი პიკი სხვაგან, რომელიც შეესაბამება სხვადასხვა ელექტრონებს. დაწინაურებული

თქვენ ხედავთ ამას, თუ უყურებთ UV-Vis შთანთქმის სპექტრს, როგორიც შეგიძლიათ მიიღოთ, თუ იყენებთ სპექტროფოტომეტრს, როგორიცაა NanoDrop. ძირითადად, ის ანათებს სინათლეს ხსნარის მეშვეობით და ზომავს, თუ რამდენად გადის (იწოვება) სხვადასხვა ტალღის სიგრძე, ვიდრე არ გადის (იწოვება). ჩვენ შევხედეთ, თუ როგორ შეიძლება ეს გარდაიქმნას ხსნარის კონცენტრაციად (დაშლილი მოლეკულები) ლუდის და rsquos კანონის გამოყენებით http://bit.ly/2N4nzXE

&epsilon = გადაშენების კოეფიციენტი (aka molar შთანთქმის კოეფიციენტი) &ndash სპეციფიკური კონკრეტული მოლეკულისთვის & აძლიერებს L mol-1cm-1 ტალღის სიგრძის კონკრეტულ ერთეულებს

c = კონცენტრაცია (მოლ/ლ-ში) &ndash ეს არის მოლარობა &ndash მოლი მხოლოდ ქიმიკოსია&rsquos &ldquobaker&rsquos ათეული&rdquo &ndash it&rsquos Avogadro&rsquos ნომერი (6.022 x 10^23) რაღაცის &ndash ხსნარის მოლეკულები ან უბრალოდ დონატები, .ly/2r4RnrX

Beer&rsquos კანონისთვის, თქვენ გჭირდებათ შთანთქმა მხოლოდ ერთი ტალღის სიგრძეზე, მაგრამ კიდევ ბევრია სასწავლი, თუ გადახედავთ მთელ სპექტრს (ან მინიმუმ რამდენიმე საკვანძო მნიშვნელობას). იმის გამო, რომ მოლეკულებს აქვთ გადახურული სპექტრები (მაგ., ორივე დნმ და რნმ შთანთქავს 260 ნმ ტალღის სიგრძის სინათლეს), თქვენ ეძებთ თანაფარდობებს. ნუკლეინის მჟავას (დნმ ან რნმ) ხარისხის ანალიზისას რამდენიმე ძირითადი თანაფარდობაა 260/230 და 260/280.

ბიომოლეკულების თვალსაზრისით, 260 &ndash დომინანტური შთამნთქმელია დნმ & რნმ & amp 280 & ndash დომინანტური შთამნთქმელი არის ცილა

260/280: გეუბნებათ ცილის და დაბინძურების შესახებ&rdquo &ndash მე დაბინძურებას ბრჭყალებში ვდებ, რადგან თუ თქვენ აანალიზებთ ცილებს, ეს არის დნმ, რომელიც არის დამაბინძურებელი!

260/230: გიამბობთ ცილებისგან და/ან ისეთი ნივთიერებებისგან, როგორიცაა ფენოლი ან მარილები, დაბინძურების შესახებ, რომლებიც დარჩენილია გაწმენდის პროცესიდან.

დნმ-სა და რნმ-ს აქვს მხოლოდ 4 ასო და ყველა მათგანი შთანთქავს 260 ნმ სინათლეს, მაგრამ ეს არის მათი უნიკალური ნაწილი, რომელიც შთანთქავს ადენინის, გუანინის, ციტოზინის და თიმინის/ურაცილის ფუძეებს. ეს არის არომატული რგოლები (არომატიული რგოლები არის რგოლები, სადაც არის ელექტრონის საერთო გაზიარება, რომელიც მათ სტაბილიზაციას უკეთებს და დაწვრილებით აქ: http://bit.ly/2Xj4Zyc ). ეს ელექტრონის დელოკალიზაცია რეზონანსის საშუალებით ამცირებს გადაადგილების ღირებულებას (ელექტრონის გასაძლიერებლად), ამიტომ არომატული რგოლები ხშირად გვხვდება საღებავებში.

ყველა ეს ფუძე შთანთქავს 260-ზე, მაგრამ სხვადასხვა ზომით -> თუ გაზომავთ 260/280 თანაფარდობას თითოეული ნუკლეოტიდისთვის ცალ-ცალკე მიიღებთ: გუანინი: 1.15 ადენინი: 4.50 ციტოზინი: 1.51 ურაცილი: 4.00 თიმინი: 1.47

ერთი რამ, რაც შეიძლება შეამჩნიოთ, არის ის, რომ ურაცილს (U), რომელიც არის რნმ-ში, მაგრამ არა დნმ-ში, აქვს ბევრად უფრო მაღალი 260/280, ვიდრე მისი დნმ-ის კოლეგას, თიმინს (T) & ndash, შედეგად, სუფთა რნმ-ს აქვს 260/280 უფრო მაღალი თანაფარდობა ვიდრე სუფთა. დნმ

თუ მხედველობაში მიიღებთ სხვადასხვა ფუძის საშუალო შეწონილებას, სუფთა რნმ-ს უნდა ჰქონდეს A260/A280 თანაფარდობა.

2-ჯერ მეტი 260 ნმ სინათლე, ვიდრე 280 ნმ) და სუფთა ორჯაჭვიანი დნმ, რომელიც მხოლოდ შთანთქავს

1.8-ჯერ მეტი 260-ზე 280-ზე, უნდა ჰქონდეს A260/A280 თანაფარდობა

მიუხედავად იმისა, რომ საბაზისო შემადგენლობა გავლენას მოახდენს გადაშენების ზუსტ კოეფიციენტზე (საზომი იმისა, თუ რამდენად კარგად შთანთქავს კონკრეტული რაღაც კონკრეტულ ტალღის სიგრძეს და არღვევს ნივთს, რომელსაც ამაგრებთ ლუდის კანონში, შთანთქმის კონცენტრაციად გადაქცევისთვის, თქვენ მაინც შეგიძლიათ შეაფასოთ გადაშენების კოეფიციენტები &ldquogeneric&rdquo დნმ & amp RNA

dsDNA: 50ng-cm/µl -> A260 1.0 შეესაბამება 50 მგ/მლ(ნგ/ულ) სუფთა dsDNA-ს

ssDNA: 33 ნგ-სმ/& მიკროლ

რნმ: 40ნგ-სმ/&მიკრ

ამ ფასეულობებიდან ხედავთ, რომ მიჯაჭვულობა მნიშვნელოვანია. როდესაც დნმ ორჯაჭვიანია, მისი ფუძეები (ნაწილები, რომლებიც შთანთქავენ შუქს) "დამალულია&rdquo & აძლიერებენ &ldquobusy&rdquo აკავშირებენ მეორე ჯაჭვის ფუძეს. მაგრამ ერთჯაჭვიანი დნმ-ით, ფუძეები ღიაა და თავისუფლად შეიწოვება. შედეგად მიიღებთ ჰიპერქრომიულ ცვლას -> ერთჯაჭვიანი დნმ (ssDNA) შთანთქავს უფრო მეტ ულტრაიისფერ შუქს, ვიდრე ორჯაჭვიანი დნმ (dsDNA) და თავისუფალი ნუკლეოტიდები შთანთქავს უფრო ძლიერად, ვიდრე რომელიმე მათგანი.

ცილების პიკია 280 და ამპ 230. ცილების ნაწილები, რომლებიც შთანთქავენ 280-ზე, არის არომატული რგოლები (ჟღერს ნაცნობი?) 20 ჩვეულებრივი ამინომჟავიდან მხოლოდ 3-ს აქვს ეს &ndash ტრიპტოფანი (Trp) და ტიროზინი (Tyr) არის ძირითადი კონტრიბუტორები &ndash Trp. ასე რომ, ფენილალანინს აქვს ბეჭედიც, მაგრამ ის აქაც კარგად იწოვება. ცისტეინის ჯვარედინი ბმულებს ასევე შეუძლიათ შთანთქმა, სადაც ეს შესაძლებელია, და სხვადასხვა ცილებს აქვთ ამ ყველაფრის სხვადასხვა რაოდენობა. ასე რომ, სხვადასხვა პროტეინი განსხვავებულად შთანთქავს 280 ნმ სინათლეს, რაც აისახება სხვადასხვა გადაშენების კოეფიციენტებით.

თქვენ შეგიძლიათ გამოთვალოთ გადაშენების სავარაუდო კოეფიციენტი უფასო ონლაინ პროგრამული ინსტრუმენტების გამოყენებით, როგორიცაა Expasy ProtParam. მე ვამბობ შეფასებულად, რადგან კონტექსტს აქვს მნიშვნელობა და შთამნთქმელი ნაწილის ირგვლივ ადგილობრივ გარემოს შეუძლია გავლენა მოახდინოს ფოტონის შთანთქმის სურვილზე.

პროტეინები ასევე შთანთქავს 230 ნმ-ზე და ეს შთანთქმა არის ზოგადი ხერხემლის ნაწილიდან და შეესაბამება შთანთქმას ასოების დამაკავშირებელი პეპტიდური ბმებით. ამ პეპტიდურ ობლიგაციებს ასევე აქვთ რეზონანსი, მაგრამ არა ისე, როგორც რგოლებს აქვთ და შთანთქავენ

იმის გამო, რომ დნმ ძალიან ძლიერად შთანთქავს UV260-ზე, სადაც ცილა არ არის, შედარებით ადვილია იმის დანახვა, გაქვთ თუ არა დნმ თქვენს ცილოვან პრეპარატში, მაგრამ უფრო რთულია იმის თქმა, არის თუ არა ცილა თქვენს დნმ-ის მოსამზადებელში და ndash 260 დომინირებს 260/280 თანაფარდობაში.

თქვენ ასევე გსურთ ნახოთ 260/230 მნიშვნელობები -> სუფთა ნუკლეინის მჟავებისთვის, ეს ჩვეულებრივ არის

ჯერჯერობით, ჩვენ მიერ განხილული "დამაბინძურებლები" არის ბიომოლეკულები, რომლებიც გაწმენდილია თქვენ მიერ გაწმენდილ მოლეკულასთან ერთად, მაგრამ დამაბინძურებლები ასევე შეიძლება წარმოიშვას ქიმიკატებიდან, რომლებიც გამოიყენეთ გაწმენდის პროცესში.

გამოყენებამდე თქვენ "დააფარებთ" სპექტროფოტომეტრს და აიღებთ სითხის სპექტრს, რომელშიც მოლეკულები იხსნება, რათა გამოიყენონ როგორც &ldquobackground&rdquo თქვენ გამოაკლებთ &ndash, მაგრამ თქვენი ცარიელი არ შეიცავს ნივთებს, რომლებიც აღარ უნდა იყოს იქ & აიღეთ ქიმიკატები, რომლებიც გამოიყენებოდა რაღაც მომენტში, მაგრამ ბოლომდე უნდა წასულიყო

მაგალითად, ფენოლი და ქაოტროპული მარილები, როგორიცაა გუანიდინი, ხშირად გამოიყენება ნუკლეინის მჟავების გაწმენდისას, მაგალითად, ფენოლ-ქლოროფორმის ან ტრიზოლის ექსტრაქციებით (მეტი აქ: http://bit.ly/2Xj4Zyc )

ისინი ძლიერად შთანთქავენ 230 ნმ-ზე, რაც (გარდა იმისა, რომ იქ ცილებიც შთანთქავენ) ამიტომ დაბალი 260/230 თანაფარდობა შეიძლება იყოს შემაშფოთებელი, თუ თქვენ უყურებთ ნუკლეინის მჟავას მომზადებას.

თქვენ ასევე გსურთ შეხედოთ შთანთქმას 320 ნმ. ეს გეუბნებათ თქვენი ნიმუშის სიმღვრივეზე და თუ თქვენი ნიმუში არის ბუნდოვანი, ხსნარში შეჩერებულმა ნაწილაკებმა შეიძლება გააფანტონ შუქი, რაც ხელს უშლის მას ყველა მოლეკულამდე მისვლას. ასე რომ, ეს მორგებულია.

ასე რომ, დნმ-ისთვის შეგიძლიათ მიიღოთ კონცენტრაცია ამ განტოლების გამოყენებით: კონცენტრაცია (მგ/მლ) = (A260 კითხვა & ndash A320 კითხვა) x განზავების ფაქტორი x 50 მგ/მლ


რნმ იზოლაცია

დაწესებულება არ ახორციელებს რნმ-ის მთლიან გაწმენდას. ჩვენ გვჭირდება მინიმუმ 500 ნგ მთლიანი რნმ QC-სთვის და ბიბლიოთეკის მომზადება Illumina-ს თანმიმდევრობისთვის. არსებობს მთელი რიგი კარგად დამკვიდრებული კომერციული ნაკრები და პროტოკოლი სხვადასხვა სახეობისა და ქსოვილის/უჯრედის ტიპებისთვის. მკვლევარებმა გულდასმით უნდა დაადგინონ ყველაზე შესაფერისი მეთოდები მათი ქსოვილის/უჯრედის ტიპისთვის. ძირითადი დაწესებულება მტკიცედ წაახალისებს საპილოტე პროექტებს, რათა დაადასტურონ, რომ არჩეული მეთოდი რეპროდუცირებულად შექმნის მაღალი ხარისხის მთლიანი რნმ-ის საკმარის რაოდენობას ინტერესის ქსოვილიდან/უჯრედიდან. ქსოვილის/უჯრედების ტიპების უზარმაზარი მრავალფეროვნების გათვალისწინებით, ჩვენთვის რთულია კონკრეტული რეკომენდაციების მიცემა. მათთვის, ვინც არ არის დარწმუნებული, რომელი პროდუქტი აირჩიოს, ჩვენ მტკიცედ მოგიწოდებთ შეამოწმოთ Qiagen-ისა და Ambion-ის (LifeTech) პროდუქტები, როგორც საწყისი წერტილი. ამ კომპანიებს აქვთ პროდუქციის დიდი არჩევანი გადაწყვეტილების სქემებით, რომლებიც დაგეხმარებათ სწორი არჩევანის გაკეთებაში. გარდა ამისა, თუ გჭირდებათ უფრო დეტალური რჩევები, ამ კომპანიებში არიან ტექნიკური მხარდაჭერის მქონე ადამიანები, რომლებიც ნამდვილად არიან რნმ-ის იზოლაციის ექსპერტები და აქვთ ფართო გამოცდილება კლიენტებს დაეხმარონ რნმ-ის იზოლირებაში ყველა შესაძლო სახეობიდან/ქსოვილიდან/უჯრედიდან. თუმცა, ჩვენ გვაქვს რამდენიმე ზოგადი რეკომენდაცია რნმ-ის იზოლაციის ტექნიკასთან დაკავშირებით, ჩვენი გამოცდილებიდან გამომდინარე.

ჩვენ არ გირჩევთ მხოლოდ ტრიზოლის გამოყენებას მთლიანი რნმ-ის იზოლაციისთვის, რადგან ტრიზოლის გამოყენება ხშირად იწვევს ნიმუშებს, რომლებიც დაბინძურებულია ცილებითა და ორგანული ნივთიერებებით, რომლებსაც შეუძლიათ ბიბლიოთეკის შექმნის პროცესის დათრგუნვა. ჩვენ გირჩევთ პროდუქტებს, როგორიცაა RNeasy, რომელიც არის სვეტზე დაფუძნებული გამწმენდი მეთოდი, რომელიც აწარმოებს მთლიანი რნმ-ის ძალიან სუფთა პრეპარატებს. ჩვენმა ბევრმა მომხმარებელმა აღმოაჩინა, რომ ისინი იღებენ მაღალ მოსავალს Trizol-ით, ამიტომ ისინი ასრულებენ თავდაპირველ იზოლაციას Trizol-ით, რასაც მოჰყვება შემდგომი გაწმენდა RNeasy ნაკრების გამოყენებით. ჩვენ დავაკვირდით, რომ ეს იწვევს ძალიან სუფთა რნმ-ს და ეს მეთოდი წარმატებით იქნა გამოყენებული RealTime PCR-ისთვის, მიკრომასივებისთვის და RNA-Seq-ისთვის.


მაღალი ხარისხის რნმ-ის გამოყოფა ავოკადოს ნაყოფიდან (პერსეა ამერიკა Წისქვილზე.)

ავოკადოს ნაყოფი მდიდარია სტრუქტურული ნახშირწყლებითა და პროტეინებით და ასევე შეიცავს პოლიფენოლებს, რომლებიც ხელს უშლიან რნმ-ის მაღალი რაოდენობისა და ხარისხის გამოყოფას. ამ კვლევის მიზანი იყო ავოკადოს ნაყოფიდან რნმ-ის იზოლაციის ოპტიმიზაცია შემდგომი დამატებითი დნმ-ის (cDNA) ტრანსკრიფციისთვის. ჩვენ აღვწერთ ოპტიმიზებულ ცეტილტრიმეთილამონიუმის ბრომიდზე (CTAB) დაფუძნებული რნმ-ის ექსტრაქციის პროტოკოლს, რომელიც საშუალებას იძლევა მაღალი ხარისხის მთლიანი რნმ-ის ეფექტური ამოღება ნაყოფის კანიდან და ხორციდან ფენოლის გამოყენების გარეშე. ამ პროცედურის შედეგად მიღებული მთლიანი რნმ არის მაღალი ხარისხის და არადეგრადირებულია, როგორც შეფასებულია სპექტროფოტომეტრიული ჩვენებითა და ელექტროფორეზით და წარმატებით იქნა გამოყენებული cDNA სინთეზისთვის. ეს არის ავოკადოს ხილიდან ეფექტური რნმ-ის ექსტრაქციის პირველი მოხსენება.

მაჩვენებლები

► ჩვენ აღვწერთ ოპტიმიზებულ ცეტილტრიმეთილამონიუმის ბრომიდზე დაფუძნებულ პროტოკოლს რნმ-ის ექსტრაქციისთვის ავოკადოს ნაყოფის კანიდან და ხორციდან. ► სპექტროფოტომეტრიითა და ელექტროფორეზით შეფასებამ აჩვენა, რომ მიღებული იქნა მაღალი ხარისხის საერთო რნმ, რომელიც აღმოჩნდა შესაფერისი cDNA-ზე ტრანსკრიფციისთვის. ► ეს არის პირველი მოხსენება ავოკადოს ნაყოფისგან რნმ-ის ეფექტური იზოლაციის შესახებ.


ბიოანალიზი

რნმ-ის სიწმინდე (დაბინძურების ხარისხი) და ხარისხი (უცვლელობა ან მთლიანობა) აუცილებელი ელემენტებია გენის ექსპრესიის შესაფასებელი მეთოდებისთვის, როგორიცაა რეალურ დროში qPCR და მიკრომასივები. ორივე მეთოდი წარმატებისთვის მოითხოვს ძალიან მაღალი ხარისხის რნმ-ს. დაბინძურებულ ნიმუშს შეუძლია პოტენციურად გამოიწვიოს საპირისპირო ტრანსკრიპციის (საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა) და qPCR რეაქციების (პოლიმერაზა) ფერმენტული კომპონენტების ინჰიბირება. დეგრადირებულმა ნიმუშმა შეიძლება გამოიწვიოს მონაცემების არასწორად წარმოდგენა და არათანმიმდევრულობა განმეორებადობამდე. აქედან გამომდინარე, მნიშვნელოვანია შეფასდეს არა მხოლოდ რნმ-ის რაოდენობა, არამედ სისუფთავე და ხარისხი გენის ექსპრესიის ექსპერიმენტების დაწყებამდე.

აქ მოცემულია რნმ-ის რამდენიმე ფაქტი (Alberts, B. et al. (1994) უჯრედის მოლეკულური ბიოლოგია):

  • ტიპიური ძუძუმწოვრების უჯრედი შეიცავს 10-30 პგ მთლიან რნმ-ს
  • დაახლოებით 360,000 mRNA მოლეკულა იმყოფება ძუძუმწოვართა ერთ უჯრედში, დაახლოებით 12,000 სხვადასხვა mRNA სახეობის უჯრედში.
  • ზოგიერთი mRNA მოიცავს mRNA აუზის 3%-ს, ზოგი კი 0,01%-ზე ნაკლებს.
  • ამ დაბალი სიმრავლის mRNA სახეობებს შეიძლება ჰქონდეთ ასლის რაოდენობა უჯრედზე 5-15 მოლეკულამდე. თუმცა, ეს იშვიათი სახეობები შეიძლება შეადგენდეს 11000-მდე სხვადასხვა mRNA სახეობას, რაც მოიცავს mRNA პოპულაციის 45%-ს.

ამის გათვალისწინებით, რნმ-ის მთლიანობა განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია თქვენს qPCR რეაქციაში, რათა ყველა mRNA სახეობა ადეკვატურად იყოს წარმოდგენილი თქვენს cDNA ნიმუშში.

The სიწმინდეს რნმ ზოგადად შეიძლება შეფასდეს სპექტროფოტომეტრიული მეთოდებით ყველა ნუკლეოტიდი (ამგვარად, რნმ, ssDNA და dsDNA) შეიწოვება 260 ნმ-ზე, ცილა ძლიერად შეიწოვება 280 ნმ-ზე ან მის მახლობლად, ნახშირწყლები 230 ნმ-თან ახლოს და ფენოლი (ტრიზოლის რეაგენტი არის პჰენი) აქვს ორი შთანთქმის პიკი 230 და

270 ნმ. ამრიგად, შთანთქმის კოეფიციენტები 260/280 ნმ და 260/230 ნმ შეიძლება გამოყენებულ იქნას რნმ-ის სისუფთავის შესაფასებლად: OD 260 / 280 ნმ თანაფარდობა 1.8-2.0 მიუთითებს მაღალი ხარისხის რნმ-ზე, ხოლო OD 260/230 ნმ ჩვეულებრივ მნიშვნელობებზე. დიაპაზონი 2.0-2.2 მაღალი ხარისხის რნმ-ისთვის. თუ თანაფარდობა მოსალოდნელზე მნიშვნელოვნად დაბალია, ეს შეიძლება მიუთითებდეს დამაბინძურებლების არსებობაზე, რომლებიც შთანთქავენ 280 ან 230 ნმ. გენომიურმა დნმ-ის დაბინძურებამ მთლიანი რნმ-ის პრეპარატში ასევე შეიძლება ცრუ გადაჭარბებული იყოს არსებული რნმ-ის რაოდენობაზე. თუმცა, ეს სპექტროფოტომეტრიული გაზომვები არ იძლევა ინფორმაციას რნმ-ის მთლიანობის შესახებ.

ვინაიდან რიბოსომული რნმ (rRNA) შეადგენს რნმ-ის მთლიანი ნიმუშების 80%-ზე მეტს, ძირითადი rRNA სახეობების მთლიანობა (ძუძუმწოვრების rRNA-სთვის 18S და 28S) ჩვეულებრივ გამოიყენება რნმ-ის ნიმუშის მთლიანობის შესაფასებლად. შეიძლება ვიზუალურად წარმოიდგინოთ 28S და 18S რიბოსომური რნმ-ის ზოლები ფლუორესცენტური საღებავით (ეთიდიუმის ბრომიდი) ფორმალდეჰიდის აგაროზის გელზე ელექტროფორეზის შემდეგ. მაღალი ხარისხის რნმ-ს ექნება ძალიან მცირე ფონი ზოლში, ხოლო უფრო მაღალი (28S) ზოლი იქნება დაახლოებით ორჯერ აღემატება ქვედა (18S) ზოლის ინტენსივობას. ეს მეთოდი ძალიან შრომატევადია (აპარატის მართვა და RNase თავისუფალი გარემოს შენარჩუნება), შრომატევადი, მოითხოვს დიდი რაოდენობით რნმ-ს ვიზუალიზაციისთვის და არ არის რაოდენობრივი.

ბიოანალიზი მიკრო-თხევადზე დაფუძნებული ელექტროფორეზის სისტემის გამოყენებით იძლევა ინფორმაციას რნმ-ის რაოდენობის, სისუფთავისა და ხარისხის შესახებ. The Agilent Bioanalyzer ბირთვულ ლაბორატორიებში გამოიყენება ამ მიზნით და St. Michael’s Hospital-ის მკვლევარებისთვის სახარჯო მასალების ღირებულებას ფარავს კვლევითი დაწესებულებები. პროცედურა მოითხოვს ძალიან ცოტა ნუკლეინის მჟავას (1 მლ) და აქვს ფართო დინამიური დიაპაზონი, რადგან შესაძლებელია ნანოგრამიდან (მთლიანი რნმ ნანო ნაკრები) წაკითხვა რნმ-ის პიკოგრამების რაოდენობამდე (მთლიანი RNA Pico ნაკრები). ბიოანალიზატორი ითვლის რნმ-ის ხარისხის ორ გაზომვას (28S/18S რიბოსომური რნმ-ის თანაფარდობა და რნმ-ის მთლიანობის რიცხვი, RIN) და ასევე გაძლევთ mRNA-ს უფრო ზუსტ რაოდენობებს თქვენი რნმ-ის შაბლონის საპირისპირო ტრანსკრიფციის ნორმალიზებისთვის.

შედეგები მოცემულია როგორც ელექტროფეროგრამა რაოდენობრივად და გელის სახით რნმ-ის ხარისხის ვიზუალური შემოწმებისთვის. რნმ-ის რაოდენობა მიახლოებულია ელექტროფეროგრამის 28S და 18S rRNA მწვერვალების ქვეშ მდებარე ფართობის აღებით (რაც შეადგენს თქვენი ნიმუშის მთლიანი რნმ-ის დაახლოებით 90%-ს). ხარისხი აისახება 28S/18S თანაფარდობა ასევე ა RIN (რნმ მთლიანობის ნომერი), რომელიც ითვალისწინებს მთელ ელექტროფორეზულ კვალს. RIN პროგრამული ალგორითმი იძლევა რიბოეკარიოტული მთლიანი რნმ-ის კლასიფიკაციის საშუალებას, ნუმერაციის სისტემის საფუძველზე 1-დან 10-მდე, სადაც 1 არის ყველაზე დეგრადირებული პროფილი და 10 ყველაზე ხელუხლებელი.

იმის უზრუნველყოფა, რომ თქვენი რნმ-ის ნიმუშები შედარებულია როგორც სისუფთავით, ასევე ხარისხით, დარწმუნდება, რომ ცვალებადობა შემცირდება თქვენს ბიოლოგიურ რეპლიკატებში. გარდა ამისა, დაბალი ხარისხის რნმ-ით დაწყებამ შეიძლება უარყოფითად იმოქმედოს ქვემოთ მოყვანილი აპლიკაციების შედეგებზე, რომლებიც შრომატევადი, შრომატევადი და ხშირად ძვირია. რეკომენდირებულია, რომ RIN 5-ზე მაღალი იყოს გამოყენებული რნმ-ის ღირსეული მთლიანობის საზომად, ხოლო RIN 8-ზე მეტი გამოიყენება, როგორც სრულყოფილი რნმ მთლიანობა ქვედა დინების აპლიკაციებისთვის. რეკომენდირებულია, რომ რნმ >7 RIN-ით გამოყენებული იქნას ქვემოთ qPCR აპლიკაციებისთვის. ყოვლისმომცველი სტატიისთვის, რომელიც აღწერს რნმ-ის მთლიანობის გავლენას რეალურ დროში PCR შესრულებაზე, იხილეთ Fleige-სა და Pfaffl-ის სტატია (224 kbpdf ფაილი).

ელექტროფეროგრამის ნიმუში Agilent Bioanalysis-დან (და შესაბამისი შედეგების ცხრილი, რომელიც აჩვენებს რნმ-ის მთლიანობის რიცხვს (RIN), rRNA თანაფარდობას (28s/18s) და რნმ-ის კონცენტრაციას:

სხვა შესაძლო სცენარი, რომელიც გავლენას ახდენს რნმ-ის ხარისხზე და qPCR შედეგებზე:

მაღალი ხარისხის უცვლელი მთლიანი რნმ:

  • ბრტყელი საბაზისო ხაზი
  • კარგად გამოყოფილი 18S/28S მწვერვალები
  • მწვერვალების ძალიან მცირე მხრები
  • არ არის პატარა rRNA
  • ქვედა მარკერის კარგი გასწორება
  • კარგი 28S/18S თანაფარდობა
  • მაღალი RIN (9.7)

ნაწილობრივ დეგრადირებული მთლიანი რნმ:

  • ამაღლებული საბაზისო ხაზი
  • გამორჩეული 18S/28S მწვერვალები, მაგრამ არა გამოყოფილი
  • ქვედა 28S/18S თანაფარდობა
  • ქვედა RIN (7.7)

მთლიანად დეგრადირებული მთლიანი რნმ:

  • არ არის შესამჩნევი რიბოსომური (18S/28S) მწვერვალები
  • მწვერვალების გადატანა ქვედა მოლეკულური წონის დიაპაზონში
  • დაბალი მოლეკულური წონის ნაცხის მაღალი ხარისხი
  • ძალიან დაბალი RIN (2.5)

Genomic contamination:

Trizol extracted total RNA:

  • Presence of small rRNA in fast region (25-30 s) which is usually eliminated from total RNA preps using column purification

Total Eukaryotic (nano) RNA ladder:

  • 6 distinct peaks, flat baseline
  • Used as quality control measure AND to assign migration of 18S and 28S peaks
  • 6 Peaks migrating (following 25 nt marker) at 200, 500, 1000, 2000, 4000 and 6000 nt

Depending on your predicted RNA yield, you can choose between several chips for bioanalysis. Here is an overview of the different kits available and highlighted are the kits available in the Keenan Research Centre for Biomedical Science Molecular Core:


Re : DO 260/280 et 260/230

en effet, c'est a.
les acides nucl iques absorbent MAJORITAIREMENT 260nm
les prot ines absorbent MAJORITAIREMENT 280nm ( cause des acides amin s aromatiques (Phe, Trp, Tyr)
les mol cules organiques (tampons, etc. ) absorbent MAJORITAIREMENT 230nm.

C'est pourquoi un mauvais ratio 260/280 (g n ralement < 1.9) indique une contamination par prot ines et un mauvais ratio 260/230 (g n ralement > 2) indique une contamination par mol cules organiques.

Maintenant si ta question est "Pourquoi on peut pas avoir un rapport de 10'000 si on a pas du tout de contaminant ?", alors l , sauf erreur de ma part, et c'est pourquoi j'ai accentu le "MAJORITAIREMENT", c'est que les acides nucl iques absorbent aussi un petit peu 230 ou 280, ce qui fait que la mesure de l'absorbtion 230 ou 280 n'est jamais de 0.


Expert Insight: FREE WEBINAR: A New Approach for DNA/RNA Sample Assessment Using the NanoDrop One


Experimental techniques such as PCR, qPCR, cloning, sequencing, and transfection require samples of known concentration and purity. The success of an experiment depends in part on the accurate evaluation of the nucleic acid sample.

Absorbance at 260nm is the most popular method for DNA and RNA quantification. However, residual chemicals from the nucleic acid extraction process as well as co-purified cell components can affect the A260 concentration result and the purity ratios (260/280, 260/230) don&rsquot tell the whole story about sample purity.

In an upcoming SelectScience ® webinar, Dr. Kodoyianni, Product Manager for the Thermo Scientific&trade NanoDrop&trade microvolume UV-Vis instruments, will discuss the important steps towards accurate nucleic acid quantification.

Plus, you&rsquoll hear about the Thermo Scientific&trade NanoDrop&trade One&trade Acclaro Sample Intelligence technology that uses powerful mathematical algorithms to identify contaminants and deliver accurate information about both concentration and purity for success in your downstream experiments.

In this webinar, you will learn:
&bull how contaminants in DNA and RNA samples can affect absorbance at 260 and concentration results
&bull how the purity ratios 260/280 and 260/230, although useful, don&rsquot tell the whole story about sample purity
&bull how the cutting-edge NanoDrop One Acclaro Sample Intelligence technology uses powerful chemometric algorithms to identify contaminants and provide corrected concentrations

Who should attend:
&bull Any scientist who works with DNA and RNA samples.
&bull Any scientist working with molecular biology techniques such as PCR, qPCR, cloning, sequencing, and transfection.


Unable to join us live? We can send you an on-demand link after the event. Sign up here for the on-demand version.


Უყურე ვიდეოს: How to check DNA Purity by using absorbance ratio (აგვისტო 2022).