ინფორმაცია

რა როლი აქვს ტრიტონს ბუფერში ვესტერნ ბლოტის ანალიზისთვის?

რა როლი აქვს ტრიტონს ბუფერში ვესტერნ ბლოტის ანალიზისთვის?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

რა როლი აქვს ტრიტონს ბუფერში ვესტერნ ბლოტის ანალიზისთვის? მე მესმის, რომ ეს დაკავშირებულია ანტისხეულების არასპეციფიკური შეკავშირების პრევენციასთან.


ზუსტად ასეა. Triton არის სარეცხი საშუალება და მისი ჩართვა უბრალოდ ართულებს მას ყველაფერი შეკვრას. აი, როგორ წარმომიდგენია ბუფერის ბლოკირება:

PBS/TBS: ბუფერული pH

რძე/BSA: ერთგვაროვანი ურთიერთქმედება ბლოტის მთლიანობასთან. იდეა იმაში მდგომარეობს, რომ ისინი ა) შეიწოვება ბლოტის იმ ნაწილებზე, რომლებსაც ჯერ კიდევ არ აქვთ დიდი ნიმუში (რადგან ლაქის "ცარიელი" ადგილები სხვაგვარად შთანთქავს აღმოჩენის ანტისხეულებს (ეს არის არასპეციფიკური შებოჭვის წყარო. ).

ტრიტონი (ან, უფრო ხშირად, Tween-20): კარგი, ახლა დაფიქრდი, რა არის შენს ბლოტზე. შენი ანტისხეული ნება აქვს სუსტი ურთიერთქმედება იქ თითქმის ყველაფერთან. სარეცხი საშუალება ურთიერთქმედებს ყველაფერთან, რასაც ეხება (ანტისხეული და ადსორბირებული პროტეინები ლაქაზე), რათა შეამციროს შეკავშირების აფინურობა ბევრ ამ ურთიერთქმედებაში (თუმცა, რამდენიმე საინტერესო საპირისპირო მაგალითი შეგიძლიათ ნახოთ აქ), რითაც ნაკლებად ხელსაყრელი შეკავშირება კიდევ უფრო ნაკლებად ხელსაყრელია, ამცირებს თქვენი გამოვლენის ანტისხეულების შანსები შეინარჩუნებს ამ უფრო სუსტ (მიზანმიმართულ) ურთიერთქმედებებს. წინა სტატია ასევე ვარაუდობს, რომ არაიონური სარეცხი საშუალებების გამოყენება ამცირებს დასავლეთის სიგნალის ინტენსივობას (და ცილებში სხვადასხვა ხარისხით).


Western Blot ანალიზი

ლეონარდ გ. დევისი Ph.D. , . ჯეიმს ფ. ბატი მ.დ., ფ. , მოლეკულურ ბიოლოგიაში ძირითადი მეთოდები, 1986 წ

გამომცემლის რეზიუმე

ამ თავში მოცემულია ვესტერნი ბლოტის ანალიზის მეთოდის მიმოხილვა, რომელიც საშუალებას აძლევს მკვლევარს დაადგინოს სპეციფიკური პროტეინები, რომლებიც გადაწყვეტილია SDS პოლიაკრილამიდის გელის ელექტროფორეზით სპეციფიურ ანტიშრატებთან შეკავშირების გზით. აკრილამიდურ გელზე გადანაწილებული პროტეინები გადადის ნიტროცელულოზის (NC) ფილტრში, რომელიც ინკუბირებულია ანტისერებით. ვესტერნ ბლოტის ანალიზის მეთოდში გამოყენებული გადაცემის ბუფერი შედგება ტრის ფუძისგან, გლიცინის, წყლისა და მეთანოლისგან. გადაცემის ბუფერის pH შენარჩუნებულია HCl-ით. პირველადი ანტისხეული სპეციალურად აკავშირებს მის ეპიტოპს და შეკრული ანტისხეული გამოვლენილია მეორად სახეობებთან, როგორიცაა [125] I]-პროტეინი A ან ბიოტინილირებული თხის ანტი-IgG. ვესტერნ ბლოტის ანალიზის მეთოდი მოიცავს პოლიაკრილამიდ-SDS გელის მომზადებას ცილების გამოყოფისთვის და ანტისხეულები მიიღება ინტერესის პროტეინის თანმიმდევრობის საწინააღმდეგოდ. ცილა ელექტროფორეტულად გადადის პოლიაკრილამიდის გელიდან NC ფილტრში.


დაბლოკვის ნაბიჯების მიზანი და ფუნქცია

ვესტერნ ბლოტინგში გამოყენებული მემბრანის საყრდენებს აქვთ მაღალი მიდრეკილება ცილებთან. ამიტომ, გელისგან ცილების გადატანის შემდეგ, მნიშვნელოვანია მემბრანის დარჩენილი ზედაპირის დაბლოკვა, რათა თავიდან იქნას აცილებული გამოვლენის ანტისხეულების არასპეციფიკური შეკავშირება შემდგომი ეტაპების დროს. მემბრანაზე თავისუფალი ადგილების დასაბლოკად გამოყენებული იქნა სხვადასხვა ბლოკირების ბუფერები, დაწყებული რძიდან ან ნორმალური შრატიდან მაღალ გაწმენდილ ცილებამდე. ბლოკირების ბუფერმა უნდა გააუმჯობესოს ანალიზის მგრძნობელობა ფონური ჩარევის შემცირებით და სიგნალ-ხმაურის თანაფარდობის გაუმჯობესებით. იდეალური ბლოკირების ბუფერი დაუკავშირდება არასპეციფიკური ურთიერთქმედების ყველა პოტენციურ ადგილს, მთლიანად აღმოფხვრის ფონს ანტისხეულების შებოჭვის ეპიტოპის შეცვლის ან დაფარვის გარეშე.

ბლოკატორის სწორი არჩევანი მოცემული ბლოტისთვის დამოკიდებულია თავად ანტიგენზე და გამოყენებული გამოვლენის ეტიკეტის ტიპზე. მაგალითად, აპლიკაციებში, სადაც გამოიყენება AP კონიუგატები, უნდა შეირჩეს ბლოკირების ბუფერი TBS-ში, რადგან PBS ერევა ტუტე ფოსფატაზას. კონკრეტული იმუნოანალიზისთვის ბლოკირების ეტაპის ნამდვილი ოპტიმიზაციისთვის აუცილებელია ემპირიული ტესტირება. ბევრმა ფაქტორმა, მათ შორის სხვადასხვა ცილა-პროტეინის ურთიერთქმედება, რომელიც უნიკალურია იმუნოანალიზის რეაგენტების მოცემული ნაკრებისთვის, შეიძლება გავლენა მოახდინოს არასპეციფიკურ შეკავშირებაზე. ბლოკატორის არჩევისას ყველაზე მნიშვნელოვანი პარამეტრია სიგნალი-ხმაურის თანაფარდობა, რომელიც იზომება, როგორც სიგნალი, რომელიც მიღებულია ნიმუშით, რომელიც შეიცავს სამიზნე ანალიზს, ვიდრე მიღებულ ნიმუშთან ერთად სამიზნე ანალიტიტის გარეშე. ბლოკატორის არაადეკვატური რაოდენობით გამოყენება გამოიწვევს ფონის გადაჭარბებულ შეღებვას და სიგნალ-ხმაურის შეფარდებას. ბლოკატორის გადაჭარბებული კონცენტრაციის გამოყენებამ შეიძლება შენიღბოს ანტისხეულ-ანტიგენის ურთიერთქმედება ან დათრგუნოს მარკერის ფერმენტი, რაც კვლავ იწვევს სიგნალ-ხმაურის თანაფარდობის შემცირებას. ნებისმიერი ახალი იმუნოანალიზის შემუშავებისას მნიშვნელოვანია რამდენიმე განსხვავებული ბლოკატორის ტესტირება სიგნალისა და ხმაურის უმაღლესი თანაფარდობისთვის ანალიზში. არც ერთი მაბლოკირებელი აგენტი არ არის იდეალური ყველა შემთხვევისთვის, რადგან ანტისხეულ-ანტიგენის თითოეულ წყვილს აქვს უნიკალური მახასიათებლები.

პროტეინის გამოვლენის ტექნიკური სახელმძღვანელო

ეს 84 გვერდიანი სახელმძღვანელო უზრუნველყოფს ღრმა ჩაძირვას ვესტერნ ბლოტის სამუშაო პროცესის ბოლო საფეხურზე - ცილების გამოვლენაში. სხვადასხვა გამოვლენის ტექნიკის არჩევისას (ქიმილუმინესცენცია, ფლუორესცენცია ან ქრომოგენული), შეგიძლიათ აირჩიოთ ტექნოლოგია, რომელიც შეესაბამება თქვენს ექსპერიმენტულ მოთხოვნებს და ხელმისაწვდომ ინსტრუმენტებს. სწრაფი ვიზუალიზაციისთვის თუ ზუსტი რაოდენობებისთვის, ერთი ზონდის გამოვლენისთვის თუ მულტიპლექსირებისთვის - Thermo Fisher Scientific გთავაზობთ რეაგენტებისა და კომპლექტების რიგს ვესტერნ ბლოტის გამოვლენისა და შემდგომი ანალიზისთვის.


რა როლი აქვს ტრიტონს ბუფერში ვესტერნ ბლოტის ანალიზისთვის? - ბიოლოგია

აქ წარმოგიდგენთ ლაბორატორიული სარეცხი საშუალებებისა და მათი გამოყენების ყოვლისმომცველ მიმოხილვას ბიოსამედიცინო ექსპერიმენტებში. ეს მიმოხილვა მოიცავს იონური, არაიონური და ცვიტერიონული სარეცხი საშუალებების განხილვას, მათ ზოგად თვისებებს, ასევე ინფორმაციას თითოეული ჯგუფის საყოველთაოდ გამოყენებული სარეცხი საშუალებების შესახებ. დაბოლოს, ჩვენ ვიცავთ Labome-ის კვლევის შედეგების მოკლე განხილვას ზოგიერთი ჩვეულებრივი სარეცხი საშუალების შესახებ.

ბიოსამედიცინო ლაბორატორიებში გამოყენებული სარეცხი საშუალებები არის რბილი ზედაპირული მოქმედების აგენტები, რომლებიც გამოიყენება უჯრედის ლიზისისთვის (ანუ უჯრედის მემბრანების მოშლისთვის) და უჯრედშიდა მასალების გასათავისუფლებლად. ისინი ამფიფილური მოლეკულებია, რომლებიც შეიცავს როგორც ჰიდროფილურ, ასევე ჰიდროფობიურ რეგიონებს. ეს ამფიფილური თვისება საშუალებას აძლევს სარეცხ საშუალებებს დაარღვიონ ცილა-ცილა, ცილა-ლიპიდური და ლიპიდ-ლიპიდური ასოციაციები, დენატურული ცილები და სხვა მაკრომოლეკულები და თავიდან აიცილონ არასპეციფიკური შეკავშირება იმუნოქიმიურ ტესტებში და ცილების კრისტალიზაციაში.

არსებობს მრავალი სახის სარეცხი საშუალება, რომელიც გამოიყენება ლაბორატორიულ კვლევებში. ახალი ამფიფილური ნაერთები, როგორც წესი, განკუთვნილია სპეციფიკური აპლიკაციებისთვის, განაგრძობს განვითარებას (მაგ., მალტოზა-ნეოპენტილგლიკოლი [1] და გლიკოზილით შემცვლელი დიკარბოქსილატები [2] ). ეს სტატია მიმოიხილავს ყველაზე ხშირად გამოყენებული ლაბორატორიული სარეცხი საშუალებების მახასიათებლებსა და გამოყენებას.

ტიპიქიმიკატები
იონურინატრიუმის დოდეცილ სულფატი (SDS), დეოქსიქოლატი, ქოლატი, სარკოსილი
არაიონურიTriton X-100, DDM, digitonin, tween 20, tween 80
ცვიტერიონულითავები
ქაოტროპულიშარდოვანა

სარეცხი საშუალებები არის ამფიფილური ორგანული ნაერთები, რომლებიც შედგება ჰიდროფობიური არაპოლარული ნახშირწყალბადის ნაწილისგან (კუდი) და ჰიდროფილური პოლარული სათავე ჯგუფისგან (ნახ. 1A). ეს მოლეკულური სტრუქტურა ძალიან ჰგავს ამფიფილურ ფოსფოლიპიდებს, რომლებიც ქმნიან ჩვენს უჯრედულ გარსებს, გარდა იმისა, რომ ფოსფოლიპიდებს აქვთ წყვილი ჰიდროფობიური კუდები, რომლებიც მიმაგრებულია ჰიდროფილურ სათავე ჯგუფზე (ნახ 1D). როდესაც წყალში იხსნება შესაბამის კონცენტრაციებსა და ტემპერატურაზე, ამფიფილური მოლეკულები იკრიბებიან სტრუქტურებად, რომლებიც ინარჩუნებენ მათ ჰიდროფილურ სათავე ჯგუფებს გარედან, ხოლო ჰიდროფობიურ კუდებს შიდა მხარეს წყლისგან მოშორებით. მათი მოლეკულური განსხვავებების გამო, სარეცხი საშუალებების მოლეკულები ქმნიან სფერულ მიცელებს (ნახ. 1C), ხოლო ფოსფოლიპიდებს უფრო მეტად აქვთ ორშრე (ნახ. 1D). მოლეკულური სტრუქტურების მსგავსება საშუალებას აძლევს სარეცხ საშუალებას შეაღწიოს ფოსფოლიპიდურ ორ ფენებში და ამით დაარღვიოს უჯრედის მემბრანა.

გარდა ამისა, მიკელის ჰიდროფობიური ბირთვი შეიძლება დაუკავშირდეს ცილების ჰიდროფობიურ რეგიონებს (ნახ 1B). სარეცხი საშუალებების მოლეკულების რაოდენობას მიცელში ეწოდება აგრეგაციის რიცხვი, მნიშვნელოვანი პარამეტრი, რომელიც გამოიყენება მემბრანის ცილის ხსნადობის შესაფასებლად [3]. ჰიდროფობიური რეგიონის სიგრძე პირდაპირპროპორციულია ჰიდროფობიურობის ხარისხთან და საკმაოდ მუდმივია სარეცხ საშუალებებს შორის, ხოლო დამუხტული სათავე ჯგუფი ცვალებადია. ტემპერატურაც და კონცენტრაციაც სარეცხი საშუალების ფაზის განცალკევებისა და ხსნადობის მნიშვნელოვანი პარამეტრებია. სარეცხი საშუალებების მინიმალურ კონცენტრაციას, რომლის დროსაც მიცელი შეინიშნება მოცემულ ტემპერატურაზე, ეწოდება კრიტიკული მიცელის კონცენტრაცია (CMC). CMC-ზე დაბალი ნებისმიერი კონცენტრაციისას, მხოლოდ მონომერები შეინიშნება CMC-ზე მაღალ კონცენტრაციებში, ორივე მიცელი და მონომერი თანაარსებობენ სხვა არამიცელარული ფაზებთან ერთად, რომლებიც არ იხსნება წყალში. ანალოგიურად, ყველაზე დაბალ ტემპერატურას, რომლის დროსაც წარმოიქმნება მიცელი, ეწოდება კრიტიკული მიცელის ტემპერატურა (CMT). CMC ასევე გავლენას ახდენს სათავე ჯგუფის ლიპოფილურობის ხარისხით. ზოგადად, დაბალი ლიპოფილური ან ლიპოფობიური ხასიათი იწვევს მაღალ CMC-ს.

საერთო სარეცხი საშუალებები იყოფა სამ ჯგუფად მათი მახასიათებლების მიხედვით: იონური (ანიონური ან კატიონური), არაიონური და ცვიტერიონული. ქვემოთ განვიხილავ თითოეულ ამ კატეგორიის გავრცელებულ სარეცხ საშუალებებს და მოგაწვდით მნიშვნელოვან ინფორმაციას ლაბორატორიული სარეცხი საშუალებების შერჩევისა და გამოყენების შესახებ.

იონური სარეცხი საშუალებები შედგება ჰიდროფობიური ჯაჭვისა და დამუხტული სათავე ჯგუფისგან, რომელიც შეიძლება იყოს ანიონური ან კათიონური. მათ ჩვეულებრივ აქვთ CMC უფრო მაღალი მნიშვნელობები, ვიდრე არაიონური სარეცხი საშუალებები და საკმაოდ მკაცრია. მათი დამუხტული სათავე ჯგუფების გამო, იონური სარეცხი საშუალებების ამოღება შეუძლებელია იონგაცვლის ქრომატოგრაფიით. გარდა ამისა, დამატებითი სიფრთხილის ზომები უნდა იქნას მიღებული იონური სარეცხი საშუალებების გამოყენებისას, რადგან მათი ზოგიერთი თვისება შეიძლება შეიცვალოს ბუფერებში ცვლადი იონური სიძლიერით (მაგ., CMC შეიძლება მკვეთრად დაეცეს, როდესაც NaCl კონცენტრაცია იზრდება 0-დან 500 მმ-მდე).

ანიონური SDS არის ძალიან ხშირად გამოყენებული და ეფექტური სურფაქტანტი ცილების უმრავლესობის ხსნადობაში. ის არღვევს არაკოვალენტურ ობლიგაციებს ცილებს შიგნით და მათ შორის, ახდენს მათ დენატურაციას და იწვევს მათი ბუნებრივი კონფორმაციისა და ფუნქციის დაკარგვას. SDS უკავშირდება ცილას 1,4:1 w/w თანაფარდობით (შეესაბამება დაახლოებით ერთ SDS მოლეკულას ორ ამინომჟავაზე), ნიღბავს ცილის მუხტს. ამრიგად, SDS ამატებს მთლიან უარყოფით მუხტს ნიმუშის ყველა ცილას, მიუხედავად მათი იზოელექტრული წერტილისა (pI). უარყოფითად დამუხტული SDS მოლეკულებით შებოჭვის შემდეგ ცილები შეიძლება განცალკევდეს ზომის მიხედვით. ეს არის დიდი მიზეზი SDS პოლიაკრილამიდის გელის ელექტროფორეზის (SDS-PAGE) ფართო გამოყენებისთვის ცილების გამოყოფისა და შესასწავლად. ჩვეულებრივ, უჯრედის სრული ლიზისისთვის SDS-ის თანდასწრებით, ნიმუში უნდა მოხდეს სონიკირებით ან გაჩეხვით (მაგ., გაიაროს 19G ნემსით) რამდენჯერმე, რათა უზრუნველყოფილი იყოს დნმ-ის დეგრადაცია. SDS არ შეიძლება გამოყენებულ იქნას, როდესაც საჭიროა აქტიური ცილები ან როდესაც მიმდინარეობს ცილა-პროტეინის ურთიერთქმედების შესწავლა, რადგან ორივე მათგანი დარღვეულია SDS-ით. SDS-თან მუშაობისას მნიშვნელოვანია ვიცოდეთ, რომ SDS ნალექი ხდება დაბალ ტემპერატურაზე და ეს ეფექტი ძლიერდება კალიუმის მარილების არსებობისას. ეს ფენომენი ზოგჯერ შეიძლება გამოყენებულ იქნას SDS-ის ამოსაღებად ცილის ნიმუშიდან [4].

ნატრიუმის დეოქსიქოლატი და ნატრიუმის ქოლატი ნაღვლის მარილების სარეცხი საშუალებებია. ორივე არის ანიონური სარეცხი საშუალება. ეს სარეცხი საშუალებები ხშირად გამოიყენება მემბრანის დაშლისა და მემბრანის ცილების ამოღებისთვის, მაგალითად, აპელინის რეცეპტორისთვის [5]. დეოქსიქოლატი ახდენს ცილების დენატურაციას, ხოლო ქოლატი არის არადენატურირებული სარეცხი საშუალება. ორივე ამ სარეცხი საშუალების ერთ-ერთი პოტენციური სარგებელი არის ის, რომ მათი ამოღება შესაძლებელია ნიმუშებიდან დიალიზის გზით, რაც შეიძლება დაეხმაროს ცილების რაოდენობრივ და/ან ანალიზს.

სარკოსილი, რომელიც ასევე ცნობილია როგორც სარკოსილი ან ნატრიუმის ლაუროილ სარკოსინატი, არის ანიონური ზედაპირულად აქტიური ნივთიერება. ის ამფიფილურია ჰიდროფობიური 14-ნახშირბადოვანი ჯაჭვის (ლაუროილი) და ჰიდროფილური კარბოქსილატის გამო. კარბოქსილატი pKa მნიშვნელობით 3.6 უარყოფითად დამუხტულია ნებისმიერ ფიზიოლოგიურ ხსნარში. სარკოსილი მზადდება ლაუროილის ქლორიდისა და სარკოზინისგან ნატრიუმის ჰიდროქსიდის თანდასწრებით და იწმინდება ალკოჰოლისაგან რეკრისტალიზაციით, ან მინერალური მჟავით მჟავიანობით, თავისუფალი მჟავის გამოყოფით და თავისუფალი მჟავას ნეიტრალიზებით. სარკოსილი ასევე გამოიყენებოდა ადგილობრივი ფარმაცევტული პროდუქტების დატენიანებისა და შეღწევის გასაუმჯობესებლად. კვების მრეწველობაში სარკოსილი დამტკიცებულია ადამიანის მოხმარებისთვის საკვების გადამუშავების, შეფუთვისა და ტრანსპორტირებისას და საკვების შესანახად ან ტრანსპორტირებაში გამოყენებულ ადჰეზივებში გამოსაყენებლად. იგი ფართოდ გამოიყენება კოსმეტიკური ფორმულირებების სახით, როგორიცაა შამპუნები და სხეულის დასაბანი საშუალებები 3-13% კონცენტრაციით [6]. სარკოსილი ასევე გამოიყენება ლითონის დასრულების დასასრულის დამუშავებაში მისი კრისტალური მოდიფიკაციის, ჟანგის საწინააღმდეგო და კოროზიის საწინააღმდეგო თვისებების გამო.

სარკოსილი ფართოდ გამოიყენება ლაბორატორიულ ექსპერიმენტებში, მაგალითად, ალცჰეიმერის დაავადების კვლევაში ტაუს ხსნადობისთვის [7], წყალში კარგი ხსნადობის, მაღალი ქაფის სტაბილურობისა და ცილებისადმი ძლიერი შთანთქმის უნარის გამო. სარკოსილი ემსახურება როგორც სარეცხი საშუალება უჯრედების გამტარიანობისთვის და ცილების ამოღების მიზნით იზოლაციისა და გაწმენდის ტექნიკით, როგორიცაა western blot და არაპირდაპირი ELISA. მას ასევე შეუძლია შეაფერხოს დნმ-ის ტრანსკრიფციის დაწყება.

სარკოსილის ერთ-ერთი მთავარი გამოყენება არის ცილების ხსნადი და ხელახალი დასაკეცი ინკლუზიური სხეულებიდან (ცილის აგრეგატები ციტოპლაზმაში ან ბირთვებში). ევკარიოტული რეკომბინანტული ცილები ზედმეტად გამოხატულია ეშერიხია კოლი მიდრეკილია ისეთი ინკლუზიური ორგანოების ჩამოყალიბებისთვის. სარკოსილი ხშირად გამოიყენება ინკლუზიური სხეულის მარცვლების გასახსნელად ცილების ამოსაღებად და მათ მშობლიურ ფორმაში დასაბრუნებლად. ადრეული სამუშაოები მოიცავდა ინკლუზიური სხეულების ხსნადობას დენატურანტებით, როგორიცაა შარდოვანა ან გუანიდინიუმის ჰიდროქლორიდი, და ხელახლა დაკეცვა ნელი განზავების გზით - თუმცა, ხსნადი ცილების უმეტესი ნაწილი გროვდება და გროვდება ძლიერი სარეცხი საშუალებების მოცილებისას. სარკოსილი არის ეფექტური ხსნადი აგენტი, რომელიც ამცირებს აგრეგაციას და იძლევა ხელახლა დაკეცვას ცილების მაღალ კონცენტრაციებში (10-ჯერ მეტი გუანიდინის ჰიდროქლორიდის გამოყენებასთან შედარებით [8]). ერთმა კვლევამ აჩვენა, რომ ინკლუზიური სხეულის შერწყმა ცილების 95%-ზე მეტი იხსნება 10%-იანი სარკოზილით და რომ ცილების შემდგომი აღდგენა შესაძლებელია სხვა სარეცხი საშუალებების (მაგ. Triton X-100 და CHAPS) ნაზავით [9]. სარკოსილთან ხსნად ექსტრაქტში შემავალი ცილები ასევე შეიძლება ინახებოდეს 4°C ტემპერატურაზე ერთი კვირით ადრე აფინურ გაწმენდამდე. თუმცა უნდა აღინიშნოს, რომ სარკოსილი ხელს უშლის შემდგომ ქრომატოგრაფიულ პროცესს და უნდა მოიხსნას ხსნარიდან განზავების ან დიალიზის გზით.

არაიონურ სარეცხ საშუალებებს აქვთ დაუტენო ჰიდროფილური სათავე ჯგუფები. ისინი განიხილება რბილ ზედაპირულად აქტიური ნივთიერებებით, რადგან ისინი არღვევენ ცილა-ლიპიდურ და ლიპიდ-ლიპიდურ ასოციაციებს, მაგრამ, როგორც წესი, არა ცილა-პროტეინის ურთიერთქმედებას და, ზოგადად, არ დენატურებენ ცილებს. აქედან გამომდინარე, მემბრანის მრავალი ცილა შეიძლება ხსნად იქცეს მათ მშობლიურ და აქტიურ ფორმაში, შეინარჩუნოს მათი ცილოვანი ურთიერთქმედებები. თუმცა, იმის გამო, რომ ყველა ცილა ერთნაირად არ იქცევა სხვადასხვა არაიონურ სარეცხი საშუალებებთან, შესაძლოა საჭირო გახდეს ცდა და შეცდომა, რათა იპოვოთ საუკეთესო სარეცხი საშუალება თქვენი ინტერესის პროტეინ(ებ)ისთვის. გარდა ამისა, უნდა აღინიშნოს, რომ არაიონური სარეცხი საშუალებების უმეტესობა ხელს უშლის ულტრაიისფერი (UV) სპექტროფოტომეტრიას. ამიტომ, ცილის განსაზღვრა 280 ნმ-ზე არაიონური სარეცხი საშუალებების თანდასწრებით, როგორც წესი, არაზუსტია.

ტრიტონის ოჯახის ყველა წევრი: Triton X-100, Triton X-114, Nonidet P-40 (NP-40), Igepal® CA-630, საკმაოდ მსგავსია, ოდნავ განსხვავდება მონომერების საშუალო რაოდენობით (n) მიცელზე. (9.6, 8.0, 9.0 და 9.5, შესაბამისად) და მათი პოლიეთილენ გლიკოლის (PEG) დაფუძნებული სათავე ჯგუფის ზომის განაწილება. ამ სარეცხი საშუალებების CMC მნიშვნელობები დაბალია და ამიტომ მათი ადვილად მოცილება დიალიზით შეუძლებელია. Triton X-100, ტიპიური არაიონური სარეცხი საშუალება, მომდინარეობს პოლიოქსიეთილენისგან და შეიცავს ალკილფენილ ჰიდროფობიურ ჯგუფს. Triton X-100 ჩვეულებრივ გამოიყენება მემბრანული ცილოვანი კომპლექსების იზოლირებისთვის და არჩევის ზედაპირულად აქტიური ნივთიერების უმეტესობისთვის, მაგალითად, ერთობლივი იმუნოპრეციპიტაციის ექსპერიმენტებისთვის. ტრიტონის ოჯახის სხვა წევრები გამოიყენება მემბრანული ცილის იზოლაციისთვის ფაზური გამოყოფის გზით დაბალი ღრუბლის წერტილების გამო (ტემპერატურა, რომელზედაც მიცელები გროვდება და ქმნიან მკაფიო ფაზას). მაშინ როდესაც Triton X-100-ის ღრუბლის წერტილი არის 64°C, Triton X-114-ის ღრუბლის წერტილი არის 23°C. ეს საშუალებას იძლევა მემბრანული ცილის მოპოვება და ხსნადი Triton X-114-ში ნიმუშების უფრო თბილ ტემპერატურამდე მიყვანის გარეშე, რამაც შეიძლება ბევრი ცილის დენატაცია გამოიწვიოს.

Brij™ 35 არის კიდევ ერთი არაიონური პოლიოქსიეთილენის სურფაქტანტი, რომელიც ჩვეულებრივ გამოიყენება როგორც უჯრედის ლიზისის ბუფერების ან საანალიზო ბუფერების კომპონენტი ან ზედაპირულად აქტიური ნივთიერება HPLC პროგრამებში.

n-დოდეცილ-β-D-მალტოზიდი (DDM) არის გლიკოზიდური სურფაქტანტი, რომელიც სულ უფრო ხშირად გამოიყენება ჰიდროფობიური და მემბრანული ცილის იზოლირებით, როდესაც საჭიროა ცილის აქტივობის შენარჩუნება. ის უფრო ეფექტურია ცილების ხსნადობისას 2-D ელექტროფორეზისთვის, ვიდრე რამდენიმე სხვა სარეცხი საშუალება, მათ შორის CHAPS და NP-40 [10]. გლიკოჯაინი მის ლიპოფილურ ადგილას, მისი მაღალი CMC 0,17 მმ და მიცელების ინტერფეისი ქმნის წყლის მსგავს მიკროგარემოს, რომელიც იდეალურია მემბრანის და ჰიდროფობიური ცილების ხსნადობისა და სტაბილურობის შესანარჩუნებლად [11]. მაგალითად, Winkler MBL-მა და სხვებმა გაასუფთავეს NCR1 ცილა n-დოდეცილ-β-D-მალტოპირანოზიდის დამატებით [12], ისევე როგორც Li Y და სხვებმა LptB2FG და LptB2FGC პროტეინებისთვის [13]. Steichen JM et al-მა შერეული ცილოვანი კომპლექსები DDM-ის ხსნარში Anatrace-დან Cryo-EM-მდე [14].

სხვა მალტოზიდებს, როგორიცაა ბეტა-დეცილ-მალტოზიდი, აქვთ ჰიდროფობიური ალკილის ჯაჭვების სხვადასხვა სიგრძე. გლუკოზიდი (ოქტილ-გლუკოზიდი) არის მალტოზიდური სარეცხი საშუალებების პოტენციური ალტერნატივა ცილების კვლევისთვის [15].

დიგიტონინი, სტეროიდული გლიკოზიდი, რომელიც მიღებულია მეწამული მელას მცენარისგან (ციფრული purpurea), გამოიყენება უჯრედული მემბრანების ხსნარებისთვის. როგორც აქ განხილული სხვა არაიონური სარეცხი საშუალებების შემთხვევაში, დიგიტონინი ხშირად გამოიყენება მემბრანის ცილების გასახსნელად მათი დენატურაციის გარეშე. მაგალითად, B de Laval-მა და სხვებმა ალიზეს უჯრედები 1% დიგიტონინით Tn5 ტრანსპოზაზას რეაქციისთვის ATAC-seq პროტოკოლის დროს [16]. Zhao Y-მ და სხვებმა გამოუშვეს სინაფსური და ექსტრასინაფსური AMPA რეცეპტორები პოსტსინაფსური სიმკვრივისგან დიგიტონინთან ერთად [17]. გარდა ამისა, დიგიტონინი გამოიყენება უჯრედული ორგანელების ამოსაღებად. დიგიტონინი ურთიერთქმედებს მემბრანებში ქოლესტეროლთან და, ამრიგად, შეიძლება გამოყენებულ იქნას ქოლესტერინით მდიდარი პლაზმური მემბრანის გამტარიანობისთვის, ხოლო ქოლესტერინით ღარიბი ორგანული მემბრანების ხელუხლებლად დატოვება.

Tween-20 და Tween-80 არის პოლისორბატის ზედაპირულად აქტიური ნივთიერებები ცხიმოვანი მჟავების ესტერის ნაწილით და გრძელი პოლიოქსიეთილენის ჯაჭვით. მათ აქვთ ძალიან დაბალი CMC, ზოგადად ნაზი სურფაქტანტები, არ ახდენენ გავლენას ცილის აქტივობაზე და ეფექტურია ხსნადობაში. Tweens არ არის უჯრედების ლიზისის ბუფერების საერთო ინგრედიენტები, თუმცა, ისინი ჩვეულებრივ გამოიყენება როგორც სარეცხი საშუალება იმუნობლოტინგში და ELISA-ში ანტისხეულების არასპეციფიკური შებოჭვის შესამცირებლად და შეუკავშირებელი ნაწილების მოსაშორებლად და გამოიყენება უჯრედის მემბრანების გამტარიანობისთვის. მაგალითად, Yang J et al-მა მოახდინა იმუნოშეღებილი უჯრედშიდა FLAG ტეგი HEK293 უჯრედების დამუშავების შემდეგ 0.2% Tween 20-ით [18].

Tween ოჯახის სარეცხი საშუალებების შესახებ ერთი გავრცელებული კითხვა არის განსხვავება Tween 20-სა და Tween 80-ს შორის, ყველაზე ხშირად გამოყენებული ორ წევრს შორის. Tween 20-ს აქვს ლაურინის მჟავა, ხოლო Tween 80-ს აქვს ოლეინის მჟავა (სურათი 3). ცხრილი 2 აჯამებს მათ შორის არსებულ სხვადასხვა ასპექტს. ამ სარეცხი საშუალებების გამოყენება ხშირად შეიძლება ურთიერთშემცვლელად, თუმცა, მათ შორის განსხვავება ზოგჯერ მნიშვნელოვანია, მაგალითად in vivo კვლევები, რომლებზეც შესაძლოა გავლენა იქონიოს Tween 20 და Tween 80-ის ჰემოლიზური ეფექტის სხვადასხვა დონემ [19]. მაგალითად, გრინვუდის დიჯეი და სხვები გაიზარდა ტუბერკულოზის მიკობაქტერია გარემოში დამატებული 0,05% Tween 80 [20]. Ouadah Y-მა და სხვებმა თაგვებში გაუკეთეს დიბენზაზეპინის ხსნარი 0.1% ვ/ვ Tween 80-ით, რათა დათრგუნონ Notch სიგნალიზაცია [21].

სინონიმები ქიმიური ფორმულა Მოლეკულური წონა სიმკვრივე (გ/მლ) გარეგნობა აპლიკაციები
20-ს შორისპოლისორბატი 20, პოლიოქსიეთილენის სორბიტანის მონოლაურატი, PEG (20) სორბიტანის მონოლაურატიC 58 H 114 O 26 12281.1გამჭვირვალე, მოყვითალო-მოყვითალო-მწვანე ბლანტი სითხეგამოყენების ფართო სპექტრი: როგორც მაბლოკირებელი აგენტი PBS ან TBS სარეცხი ბუფერებში ELISA-სთვის, Western blotting და სხვა იმუნოანალიზის მეთოდები ძუძუმწოვრების უჯრედების ლიზირებისთვის და როგორც მემბრანის ცილების ხსნადი აგენტი.
80-ს შორისპოლისორბატი 80, პოლიოქსიეთილენის სორბიტანის მონოოლატი, PEG (80) სორბიტანის მონოოლატიC 64 H 124 O 26 13101.06-1.09ქარვისფერი ბლანტი სითხეროგორც სტაბილიზირებელი აგენტი პროტეინებისთვის, რომლებიც გამოიყენება ვაქცინის პრეპარატებში გამოყენებული ზოგიერთი მიკობაქტერიის ფენოტიპის იდენტიფიკაციის ტესტებში [22]

მიუხედავად იმისა, რომ არაიონური სარეცხი საშუალებები ზოგადად შედარებით რბილია, ბევრი ცილა დენატურდება ან გროვდება ამ სარეცხი საშუალებების თანდასწრებით. ამ საკითხის გასაუმჯობესებლად შეიქმნა ახალი არაიონური გლიკო-ლითოქოლატური ამფიფილები (GLC-1, GLC-2 და GLC-3) და გლიკო-დიოსგენინის ამფიფილები (GDN) [23]. GDN გამოიყენებოდა საფუარის მიტოქონდრიული დიმერული ATP სინთეზაზას მოსაპოვებლად, რათა უკეთ გაეგოთ, თუ როგორ ფუნქციონირებს ცილა [24]. Pluronic F-68 ჩვეულებრივ გამოიყენება სუსპენზიის უჯრედების კულტურაში 0.1%-ით წყლის ათვლის ძალის შესამცირებლად [25].

ცვიტერიონული სარეცხი საშუალებების სათავე ჯგუფები არის ჰიდროფილური და შეიცავს როგორც დადებით, ასევე უარყოფით მუხტებს თანაბარი რაოდენობით, რის შედეგადაც არის ნულოვანი წმინდა მუხტი. ისინი უფრო მკაცრი ზედაპირულად აქტიური ნივთიერებებია, ვიდრე არაიონური სარეცხი საშუალებები. ტიპიური ცვიტერიონული სარეცხი საშუალებაა 3-[(3-ქოლამიდოპროპილ)დიმეთილამონიო]-1-პროპანესულფონატი, უფრო ცნობილი როგორც CHAPS. CHAPS მაღალი CMC (6 მმ ოთახის ტემპერატურაზე) საშუალებას იძლევა ეფექტური მოცილება დიალიზით. ძალიან ხშირია ნიმუშის მომზადებაში 2-4% კონცენტრაციით იზოელექტრული ფოკუსირებისთვის და 2D ელექტროფორეზისთვის. CHAPSO განსხვავდება CHAPS-ისგან იმით, რომ ის შეიცავს უფრო პოლარულ სათავე ჯგუფს, რაც მას უფრო აძლიერებს ჰიდროფობიური მოლეკულების ხსნარს. ამრიგად, CHAPSO ძირითადად გამოიყენება ინტეგრალური მემბრანის ცილების ხსნარებისთვის.

ქაოტროპული აგენტები სურფაქტანტების მსგავსი ნივთიერებებია, რადგან ისინი არღვევენ არაკოვალენტურ ურთიერთქმედებებს (წყალბადის ბმები, დიპოლ-დიპოლური ურთიერთქმედება, ჰიდროფობიური ურთიერთქმედება), რაც ხელს უწყობს ცილის დენატურაციას, რაც ამ შემთხვევაში ჩვეულებრივ შექცევადია. შარდოვანა არის ჩვეულებრივი ქაოტროპული აგენტი, რომელიც გამოიყენება ცალკე, ან თიორეასთან ან სხვა სარეცხ საშუალებებთან ერთად, აპლიკაციებში, როგორიცაა 2D-გელის ელექტროფორეზი და ცილების ფერმენტული მონელება ხსნარში, პროტეომიური სამუშაოების დროს მოსამზადებლად. შარდოვანას გამოყენებისას განსაკუთრებული სიფრთხილეა საჭირო, რომ ნიმუში არ გაცხელდეს 37°C-ზე ზემოთ, რადგან ეს გამოიწვევს ცილების კარბამილაციას [26].

მემბრანის ცილის ხსნადობისთვის, ზოგადად უნდა შეირჩეს სარეცხი საშუალება მაღალი CMC-ით და ბუფერის მოცულობა და კონცენტრაცია ასევე გადამწყვეტია, რადგან საკმარისი სარეცხი საშუალება უნდა იყოს წარმოდგენილი ნიმუშში მემბრანის ყველა ცილის გასახსნელად. უმეტეს შემთხვევაში, სარეცხი საშუალებების კონცენტრაცია კარგად უნდა იყოს CMC დონეზე (მინიმუმ 2X CMC), რათა უზრუნველყოს მიცელის საკმარისი კონცენტრაცია მემბრანის ცილების ხსნარებისთვის. Linke [3]-ის მიხედვით, მემბრანის ცილის მოლეკულაზე საჭიროა მინიმუმ ერთი მიცელი, რათა საკმარისად მიბაძოს მემბრანის ლიპიდურ გარემოს (ნახ. 1B, D).

ფაზის გამოყოფა შეიძლება გამოყენებულ იქნას ცილების შემდგომი გასაწმენდად. ეს მოითხოვს ბუფერში მარილების და სარეცხი საშუალებების ტემპერატურისა და კონცენტრაციის კორექტირებას, რათა გამოიწვიოს სარეცხი საშუალებების მიცელების აგრეგაცია და გამოყოფა წყლის ფენისგან. ამ შემთხვევაში მემბრანის ცილები, რომლებიც გარშემორტყმულია მიცელებით, გროვდება სარეცხი საშუალებით. ტემპერატურაზე, რომლის დროსაც სარეცხი ხსნარი იყოფა ორ ფაზად, ღრუბლის წერტილად, გავლენას ახდენს გლიცეროლი ან მარილები ბუფერში (მაგ., Triton X-114-ს აქვს ღრუბლის წერტილი 23°C, მაგრამ 20% გლიცეროლის თანდასწრებით, ღრუბლის წერტილი მცირდება 4°C-მდე). ეს ძალიან მნიშვნელოვანია, რადგან ცილის სტაბილურობაზე გავლენას ახდენს მაღალი ტემპერატურა.

კარგ სარეცხ საშუალებას უნდა შეეძლოს უჯრედების ლიზირება, ცილების ხსნადი და შესაფერისი იყოს თქვენი ქვედა ნაკადის გამოყენებისთვის. ასევე, გასათვალისწინებელია ხსნადი ცილა ბუნებრივი ან დენატურირებული ფორმით. არ არსებობს იდეალური სარეცხი საშუალება ყველა გამოყენებისთვის და ერთი და იმავე აპლიკაციაშიც კი შედეგი განსხვავდება (ცხრილი 3). ამიტომ, ვარიანტების განხილვის შემდეგ, ხშირად საჭიროა ცდა და შეცდომა საუკეთესო სარეცხი საშუალების მოსაძებნად და სარეცხი საშუალებების ნარევი შეიძლება იყოს ოპტიმალური. ასევე, სარეცხი საშუალებების სამუშაო ხსნარის ახალი მომზადება, როგორც წესი, საუკეთესო პრაქტიკაა ჰიდროლიზისა და დაჟანგვის თავიდან ასაცილებლად.

სარეცხი საშუალებაMW (Da) მონომერიMW (Da) მიცელიCMC (მმ) 25 o Cაგრეგაცია No.ღრუბლის წერტილი (o C)საშ. მიცელარული წონასიძლიერედიალიზირებადიაპლიკაციები
SDS28918,0007-1062>10018,000მკაცრიდიახუჯრედის ლიზისი, ელექტროფორეზი, WB, ჰიბრიდიზაცია
Triton X-10062590,0000.2-0.9100-1556580,000Რბილიარაფერმენტული იმუნოანალიზები, IP, მემბრანული ხსნადი
თავები6156,150610>1006,150ᲠბილიდიახIEF, IP
NP-4068090,0000.059 45-50 ᲠბილიარაIEF
n-დოდეცილ-β-D-მალტოზიდი511 0.1598 50,000 ცილის კრისტალიზაცია
Tween-201228 0.06 76 ᲠბილიარაWB, ELISA, ფერმენტული იმუნოანალიზები
დიგიტონინი122970,000<0.560 70,000Რბილიარამემბრანის ხსნადი

ქვემოთ მოყვანილი აპლიკაციები ხშირად მოითხოვს სარეცხი საშუალებების კონცენტრაციის შემცირებას ან მთლიანად მოცილებას. ასეთი მიზნებისთვის, ზომის გამორიცხვის ქრომატოგრაფია ან დიალიზი შეიძლება გამოყენებულ იქნას, თუ მიცელის ზომა არსებითად განსხვავდება ინტერესის პროტეინისგან ან მიცელი საკმარისად მცირეა (ანუ მაღალი CMC) დიალიზის მილში გასავლელად [3]. სხვა მეთოდებში გამოიყენება სარეცხი საშუალებების დამაკავშირებელი არაპოლარული მძივები ან ფისები, ციკლოდექსტრინის ინკლუზიური ნაერთები [27], იონგაცვლის ქრომატოგრაფია ან ცილის ნალექი. თუმცა, სარეცხი საშუალებების ამოღების შემდეგ გამოყენებული ბუფერი უნდა იყოს შერჩეული ფრთხილად, რათა თავიდან იქნას აცილებული ცილის ნალექი ან აგრეგაცია.

Labome იკვლევს სარეცხი საშუალებების გამოყენების ლიტერატურას. შემდეგ ცხრილში ჩამოთვლილია ძირითადი მომწოდებლები და პროდუქციის რაოდენობა, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ სარეცხი საშუალებების უმეტესობა მოწოდებულია MilliporeSigma-ს მიერ.

სარეცხი საშუალება მომწოდებლები
Triton X-100თერმო ფიშერი [28, 29], Electron Microscopy Sciences [30], Amresco, JT Baker
Tween-20Bio-Rad [31], MilliporeSigma [29], თერმო ფიშერი
SDSAmresco, Bio-Rad, Q.BIOgene, MilliporeSigma
NP-40Roche, MilliporeSigma [32]
თავებიMilliporeSigma, JT Baker
დიგიტონინიმილიპორე სიგმა, ვაკო
DDMგენერონი [33], ანატრასი [15]

Thermo Fisher Pierce Triton X-100, მაგალითად, BP151 [29] ან 85111 [28], გამოიყენებოდა უჯრედისა და ქსოვილის ნიმუშების დასალიზებლად იმუნოჰისტოქემიტრიისთვის [29] და იმუნოციტოქემიისთვის [28]. MilliporeSigma Triton X-100 გამოიყენებოდა უჯრედების ლიზირებისთვის [34], ან უჯრედების გამტარიანობისთვის იმუნოციტოქემიაში [35] და იმუნოჰისტოქიმიის ბლოკირების ბუფერში [36, 37] და პროტეინაზა K-ს დაცვის ანალიზში [38].

Tween-20 ჩვეულებრივ გამოიყენება სარეცხი ბუფერებში, როგორიცაა TBS-Tween (TBS-T) ან PBS-Tween (PBT-T), სხვადასხვა იმუნოანალიზში. MilliporeSigma Tween-20, მაგალითად, P1379 [29], გამოიყენებოდა სარეცხი ბლოტების დროს [29], IHC ექსპერიმენტებში (P1379) [39], იმუნოპრეციპიტაციაში [40] და მიკროფლუიდური მასივის მულტიპლექს PCR [41] და სხვა [41]. 42]. MilliporeSigma Tween-80, გამოიყენებოდა ერლოტინიბის (ქიმიოთერაპიის წამალი) დასაშლელად [43] და როგორც დანამატი ზრდისთვის M. ტუბერკულოზი შტამები [44].

Lonza SDS (კატალოგის ნომერი 51213) გამოიყენებოდა ქრომატინის პრეპარატებში [39]. Amresco SDS გამოიყენებოდა SDS-PAGE-ში [45]. Bio-Rad ნატრიუმის დოდეცილ სულფატი გამოიყენებოდა რადიოიმუნოპრეციპიტაციური ანალიზის ბუფერის მოსამზადებლად [46]. MilliporeSigma-Aldrich SDS გამოიყენებოდა ბუფერების მოსამზადებლად, სხვათა შორის, in vitro ოქტანოილაციის ანალიზისთვის, Laemmli ნიმუშის ბუფერისთვის, 2D-DIGE ექსპერიმენტებისთვის [47].

Roche NP-40 გამოიყენებოდა უჯრედების ლიზისში [48, 49]. MilliporeSigma NP-40 გამოიყენებოდა რადიოიმუნოპრეციპიტაციის ანალიზის ბუფერის [46], უჯრედების ლიზის/ჰომოგენიზაციის ბუფერების [50, 51] და იმუნოპრეციპიტაციის ანალიზის RIPA ბუფერის მოსამზადებლად [52].

MilliporeSigma CHAPS გამოიყენებოდა ბუფერებში ცილის კრისტალიზაციისთვის [53]. JT Baker CHAPS გამოიყენებოდა უჯრედების ლიზისთვის, ადამიანის ASF1 პროტეინთან ვირუსული ურთიერთქმედების შესასწავლად [54].

MilliporeSigma გამოიყენებოდა იმუნოციტოქემიის ექსპერიმენტში PI4P-ის შესასწავლად [55] და გამოიყენებოდა პროტეინაზა K-ს დაცვის ანალიზის ჩასატარებლად [38] და რნმ-ის ამოსაღებად [56]. ვაკო დიგიტონინი გამოიყენებოდა უჯრედების დასალიზებლად [57] და იმუნოპრეციპიტაციის ექსპერიმენტების ჩასატარებლად [58].

Y Lee-მ და სხვებმა მოახდინეს GPCR პროტეინის ხსნადი დოდეცილმალტოზიდით / DDM Generon-ისგან [33]. ანატრაცი n-დეცილ-ბეტა-D-მალტოპირანოზიდი გამოიყენებოდა ცილის გასაწმენდად [59, 60], ისევე როგორც მისი n-დოდეცილ-ბეტა-D-მალტოზიდი [61] და n-უნდეცილ-ბეტა-D-მალტოზიდი [62, 63] . გლიკონ ბეტა-დოდეცილ-მალტოზიდი და ბეტა-დეცილ-მალტოზიდი ასევე გამოიყენებოდა ცილების გაწმენდაში [64]. Anatrace n-octyl-beta-glucoside გამოიყენებოდა AQP4 ცილების ხსნარებისთვის [15].

Silva MC და სხვებმა გამოიყენეს Brij-35, როგორც სარეცხი საშუალება ბიოსენსორული ბიოსენსორული ანალიზისთვის [65]. ცილის გამწმენდისთვის გამოყენებული იქნა Affymetrix octyl glucose neopentyl glycol (OGNPG) 1% [66] და MilliporeSigma ქოლესტერინის ჰემისუკცინატი 0.1% ან 0.05% (w/v) [11, 67]. ქრომატინთან დაკავშირებული ანალიზებისთვის გამოყენებული იქნა MilliporeSigma-Aldrich ნატრიუმის დეოქსიქოლატი (კატალოგის ნომერი D6750) და Igepal (კატალოგის ნომერი I8896) და TEKnova N-ლაუროილსარკოზინი (კატალოგის ნომერი S3379) [39].


Western blot: ტექნიკა, თეორია და პრობლემების გადაჭრა

Western blotting არის მნიშვნელოვანი ტექნიკა, რომელიც გამოიყენება უჯრედულ და მოლეკულურ ბიოლოგიაში. Western blot-ის გამოყენებით მკვლევარებს შეუძლიათ ამოიცნონ კონკრეტული ცილები უჯრედებიდან ამოღებული ცილების რთული ნარევიდან. ტექნიკა იყენებს სამ ელემენტს ამ ამოცანის შესასრულებლად: (1) განცალკევება ზომის მიხედვით, (2) გადატანა მყარ საყრდენზე და (3) სამიზნე ცილის მარკირება ვიზუალიზაციისთვის სათანადო პირველადი და მეორადი ანტისხეულების გამოყენებით. ეს ნაშრომი შეეცდება ახსნას ვესტერნ ბლოტის მიღმა არსებული ტექნიკა და თეორია და შემოგთავაზოთ პრობლემების გადაჭრის რამდენიმე გზა.

საკვანძო სიტყვები: ბიო-სამედიცინო კვლევის პროტეინი western blot.

ინტერესთა კონფლიქტის განცხადება

ინტერესთა კონფლიქტი: არ არის გამოცხადებული.

ფიგურები

აწყობილი თარო გელის გასამაგრებლად

აწყობილი თარო გელის გასამაგრებლად

დაამატეთ გელის ხსნარი გადაცემის პიპეტის გამოყენებით

დაამატეთ გაშვებული ბუფერი…

დაამატეთ გაშვებული ბუფერი ელექტროფორატორს

დაამატეთ ნიმუშები და მოლეკულური მარკერი…

სავარცხლების მოხსნის შემდეგ გელს დაამატეთ ნიმუშები და მოლეკულური მარკერი

(ა) ნიმუშები გადის…

(ა) ნიმუშები, რომლებიც გადის დაწყობის გელის მეშვეობით (დაბალი ძაბვა). (ბ): ნიმუშები გადის…


შინაარსი

განუზავებელი Triton X-100 არის გამჭვირვალე ბლანტი სითხე (ნაკლებად ბლანტი ვიდრე განუზავებელი გლიცეროლი). განუზავებელ Triton X-100-ს აქვს სიბლანტე დაახლოებით 270 სენტიპოისი 25 °C-ზე, რაც 50 °C-ზე დაახლოებით 80 სენტიპოისამდე მოდის. Triton X-100 იხსნება 25 °C-ზე წყალში, ტოლუოლში, ქსილენში, ტრიქლოროეთილენში, ეთილენგლიკოლში, ეთილის ეთერში, ეთილის სპირტში, იზოპროპილის სპირტში და ეთილენ დიქლორიდში. Triton X-100 უხსნადია ნავთში, მინერალურ სპირტებში და ნაფტაში, თუ არ გამოიყენება ოლეინის მჟავის მსგავსი დამაკავშირებელი აგენტი. [5]

Triton X-100 არის ლაბორატორიებში ხშირად გამოყენებული სარეცხი საშუალება. [6] Triton X-100 ფართოდ გამოიყენება უჯრედების ლიზისთვის ცილების ან ორგანელების მოსაპოვებლად, ან ცოცხალი უჯრედების მემბრანების გამტარიანობისთვის. [7]

ზოგიერთი აპლიკაცია მოიცავს:

    ლიპიდური გარსით დაფარული ვირუსები (მაგ. აივ, HBV, HCV) ბიოფარმაცევტული საშუალებების წარმოებაში
  • სამრეწველო დანიშნულება (ლითონის დაფარვა), ფლუზონის ჩათვლით
  • გაუმაგრებელი (ან მსუბუქად დამაგრებული) ევკარიოტული უჯრედის მემბრანების გამტარიანობა [7]
  • მემბრანის ცილების ხსნადი მშობლიურ მდგომარეობაში ცვიტერიონულ სარეცხ საშუალებებთან ერთად, როგორიცაა CHAPS
  • ლიზისის ბუფერის ნაწილი (ჩვეულებრივ 5% ხსნარში ტუტე ლიზისის ბუფერში) დნმ-ის ექსტრაქციაში
  • წყალხსნარის ზედაპირული დაძაბულობის შემცირება იმუნოშეღებვის დროს (ჩვეულებრივ 0,1-0,5% კონცენტრაციით TBS ან PBS ბუფერში)
  • ნახშირბადის მასალების დისპერსია რბილი კომპოზიტური მასალებისთვის
  • კოლონიების გაფართოების შეზღუდვა Aspergillus nidulans მიკრობიოლოგიაში
  • ცხოველური წარმოშობის ქსოვილების დეცელულარიზაცია
  • SDS-ის მოცილება SDS-PAGE გელებიდან გელის შიგნით ცილების რენატურამდე
  • უჯრედის მონოფენების დარღვევა, როგორც დადებითი კონტროლი TEER გაზომვებისთვის
  • მიცელარული კატალიზატორი

ლაბორატორიული გამოყენების გარდა, Triton X-100 გვხვდება რამდენიმე სახის საწმენდ ნაერთებში, [8] დაწყებული მძიმე სამრეწველო პროდუქტებიდან ნაზი სარეცხი საშუალებებით დამთავრებული. It is also a popular ingredient in homemade vinyl record cleaning fluids together with distilled water and isopropyl alcohol. [9]

In December 2012, the European Chemicals Agency (ECHA) included the substance group “4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol, ethoxylated” – which includes Triton X-100 – in the Candidate List of substances of very high concern [10] of the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH) Regulation which addresses the production, import and use of chemical substances and their potential impacts on human health and the environment. [11] A Triton X-100 degradation product has indeed turned out to be ecotoxic as it possesses hormone-like (estrogeno-mimetic) activity that may act on wildlife. [12] The ECHA finally included the substance group in the Authorisation List (Annex XIV), [13] mandating the pharmaceutical and other industries to replace this detergent by the “sunset date” January 4, 2021, thereby affecting EU manufacturers, importers, and downstream users, as well as non-European manufacturers exporting their products into the EU.

Alternatives for viral inactivation Edit

Since the inclusion of Triton X-100 in the candidate list of substances of very high concern for authorization, pharmaceutical companies, as well as bioprocessing research groups, are in need of an alternative detergent which must at the same time be eco-friendly and effective. Ideally, a Triton X-100 replacement should generate minimal manufacturing process change, because only then the necessary updates of regulatory filings for medicines could be realized without additional animal experiments or even clinical studies. Therefore, an alternative virus-inactivating detergent should have physico-chemical properties similar to Triton X-100, should be soluble, easy to remove, eco-friendly, but not degrade to toxic metabolites. In a recent study, [14] two alternatives for antiviral treatment in biopharmaceutical manufacturing have been identified: Triton X-100 reduced, as well as a novel compound which was named Nereid (after the mermaids in Greek mythology). As reflected by the name, Nereid can be seen as just another relative of the Triton X-100 family, however, due to a small molecular difference, it does not degrade into phenolic compounds the way that Triton X-100 does. The virus inactivation studies comprised experiments with several relevant viruses under various conditions. It turned out that at room temperature, where most virus inactivation steps in biopharmaceutical manufacturing are conducted, both Triton X-100 reduced and Nereid showed similar virus inactivating performances as Triton X-100. In contrast, for some processes that are conducted at cold temperatures, Nereid and Triton X-100 gave better results than Triton X-100 reduced. To date, Nereid can be produced at kilogram-scale using a three-step synthesis, and a patent has been applied for. [15] Nereid is scalable and compatible with existing processes and has not shown any impact on product activity so far. In terms of performance, Nereid would be a robust “all-in-one” replacement for Triton X-100. Thus, it is currently tested in ecotoxicology and biodegradation studies to confirm that it is environmentally safe.


Chapter 13 - Co-IP assays for measuring GPCR–arrestin interactions

βarrestin1 and -2 (also known as arrestin2 and -3, respectively) are G protein-coupled receptor (GPCR) adapter proteins, performing three major functions in the cell: functional desensitization, i.e., G protein uncoupling from the receptor, GPCR internalization via clathrin-coated pits, and formation of signalosomes. The βarrestins elicit a large part of the G protein-independent signaling emanating from GPCRs. Several methodologies have been developed over the past 15 years or so to quantify the GPCR–arrestin interaction/binding, especially since the latter's roles in signal transduction were discovered. One of the simplest and most traditional of these methodologies is the assay of co-immunoprecipitation (co-IP), followed by western blotting. This assay is also one of the most reliable ones, since it does not require any chemical modification of either component in the complex (i.e., neither of the receptor nor of the arrestin). Therefore, it is the only assay that can detect and semi-quantify interactions between native GPCRs and native arrestins. The caveat of this assay is of course that its reliability depends on the quality (specificity and sensitivity) of the utilized antibodies. Here, we describe a simple protocol for performing this co-IP assay to get a measurement of the steady-state levels of agonist-elicited GPCR–arrestin interaction in cells.


Interpretation and Use of the Western Blot Assay for Serodiagnosis of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infections

Reported by: Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors and AIDS Program, Center for Infectious Diseases, Public Health Practice Program Office, Centers for Disease Control* The Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors (ASTPHLD) and CDC have collaborated in preparing this report. It includes a description of various interpretive criteria associated with the Western blot test for HIV-1, evaluates the sensitivity and specificity of these criteria as tools for public health practice, and provides recommendations for use of the Western blot and the manner in which to report results in order to provide clinicians and public health policy officials with useful information in their efforts to reach an accurate diagnosis for persons tested for HIV-1 infection. შესავალი

The development of sensitive and specific tests for antibody to human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) progressed rapidly after this retrovirus was identified as the cause of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). These tests have been used for various purposes, including clinical diagnosis of HIV-1 infection--for symptomatic and asymptomatic patients in counseling and testing programs--for seroprevalence surveys, and for blood-donor screening.

Enzyme immunoassay (EIA) is the most widely used serologic test for detecting antibody to HIV-1. Serum samples that are repeatedly reactive in the EIA for HIV-1 antibody are then retested with a supplemental and more specific test, the most common of which is the Western blot (1-3). To date, only one commercial Western blot test (Du PontœPr) has been licensed by the Food and Drug Administration (FDA). The purpose of this report is to provide guidance for interpreting Western blot test results and their use in diagnosing HIV-1 infection. THE WESTERN BLOT ASSAY

The Western blot assay is a method in which individual proteins of an HIV-1 lysate are separated according to size by polyacrylamide gel electrophoresis. The viral proteins are then transferred onto nitrocellulose paper and reacted with the patient's serum. Any HIV antibody from the patient's serum is detected by an antihuman immunoglobulin G (IgG) antibody conjugated with an enzyme that in the presence of substrate will produce a colored band. Positive and negative control serum specimens are run simultaneously to allow identification of viral proteins.

Table 1 lists the major structural proteins coded for by the HIV genome. Antibodies to the HIV-1 major group-specific antigen (GAG) protein p24, and its precursor p55, are the earliest detected after infection by Western blot and tend to decrease or become undetectable with onset or progression of clinical symptoms (4-9). In contrast, antibodies to the envelope (ENV) precursor protein gp160 and the final ENV proteins (gp120 and gp41) can be detected in specimens from virtually all HIV-infected persons regardless of clinical stage (4-9). Antibodies to the polymerase (POL) gene products (p31, p51, and p66) are also commonly detected if these antigens are present on the Western blot strips. However, in a recent study, the protein with a mobility of 160 kilodaltons (kd) present in commercially available Western blots and in viral lysate antigen preparations was identified as a multimer of the gp41 protein (10,11). Furthermore, this study presented evidence that the reaction observed against the gp120 on certain Western blots may have resulted in part from a reaction with a multimeric form of the gp41. In fact, the true gp120 was shown to be absent from some commercial Western blot antigens. When these reagents were used, serum specimens with only gp41 antibodies produced bands at the 41-, 120-, and 160-kd positions. Interpretive Criteria

Although the overall sensitivity and specificity of the Western blot for detection of antibodies to the various viral proteins are high, there has been substantial debate regarding the interpretive criteria. The currently licensed Du Pont Western blot test specifies that the test result should be interpreted as positive only when the detected bands include p24 and p31, and gp41 or gp120/160 (12) (see Table 2). Conversely, a negative Du Pont Western blot test result requires the absence of any and all bands--not just viral-bands. All other patterns are regarded as indeterminate. This interpretation scheme maximizes the specificity of the assay and is mainly intended for use with samples from persons, such as blood donors, for whom there is usually little clinical or virologic information available. (Donated units of blood that are repeatedly reactive by EIA are discarded Western blot results are used to guide donor notification and deferral.) These criteria are not ideal for all situations, especially the testing of persons at increased risk for HIV infection, or with symptoms suggestive of this infection.

Alternative criteria have been proposed by various groups. ASTPHLD has proposed that a positive test result be defined by the presence of any two of the following bands: p24, gp41, and gp120/160 (13). The Consortium for Retrovirus Serology Standardization (CRSS) has defined a positive test result as the presence of either p24 or p31, plus a diffuse envelope band (i.e., gp41 or gp120/160) (14). The American Red Cross has defined a positive test result as greater than or equal to 1 band from each of the GAG, POL, and ENV gene-product groups (15). These three groups and DuPont all agree that an indeterminate result is the presence of any other band or bands that fail to meet the positive criteria, and that a negative result is the absence of all bands.

The criteria for a negative Western blot interpretation specify "no bands." This interpretation is essential because some observed bands may reflect the presence of antibodies to HIV regulatory proteins or may indicate partially processed or degraded viral structural proteins. Furthermore, different Western blots (commercial, as well as "in-house" preparations) and different virus-antigen preparations used to prepare Western blots may contain different numbers and concentrations of both viral-specific and contaminating cellular proteins that may have unpredictable molecular weights. Evaluation of Criteria

To compare the four sets of criteria for Western blot interpretation, CDC selected 424 serum samples on the basis of the patients' clinical status and EIA results only, and analyzed them using the licensed Du Pont Western blot test (CDC unpublished data). The samples were scored according to each of the criteria (Table 3). For all three categories with repeatedly reactive EIA test results, the Western blot results demonstrate that the ASTPHLD definition gives the highest percentage of positive and the lowest percentage of indeterminate results. The interpretive standards that require the identification of bands from each of the three groups of gene products tend to have indeterminate results for some AIDS and other symptomatic patients due to absence of antibodies to p24 (n=5) or to p31 (n=14) or absence of both types of antibodies (n=2). Since these patients clearly are infected with HIV, the three-gene-product approach to Western blot interpretation is not sensitive enough for public health or clinical practice.

The ASTPHLD/CDC criteria for a positive Western blot differ from the CRSS criteria in two ways: first, ASTPHLD/CDC deletes p31, a change that does not affect the sensitivity or specificity of the criteria (Table 3), and second, ASTPHLD/CDC adds "gp41 and gp120/160," a combination not interpreted as positive with the CRSS criteria. This latter combination of bands represents antibody to envelope glycoproteins only. In practice, this is a rare finding for asymptomatically infected persons, but it has been reported to be specific for HIV-infected persons and should be included in the positive criteria (9). However, when a Western blot test has only the multimeric form of gp41 and no true gp120 present, a serum sample would be scored as positive on the basis of the presence of antibody to a single envelope glycoprotein, gp41. HIV-1-infected persons with this profile have lost their antibodies to the GAG proteins and are usually symptomatic and do not present a diagnostic problem.

The ASTPHLD/CDC interpretive criteria for a negative result are identical to the FDA recommendation for blood-donor reentry or the Western blot interpretive criteria that are specified in the licensed Western blot kit package insert. რეკომენდაციები

On the basis of the results described above, CDC concurred with the ASTPHLD criteria and recommends their use in public health and clinical practice.

Laboratories should report test results as positive, indeterminate, or negative. The Public Health Service recommends that no positive test results be given to clients/patients until a screening test has been repeatedly reactive (i.e., greater than or equal to two tests) on the same specimen and a supplemental, more specific test such as the Western blot has been used to validate those results (3). Upon request, laboratory reports may also contain a list of the bands detected and reference to the interpretive criteria the laboratory uses. Because of the variability of unlicensed reagents, laboratories using non-FDA-licensed Western blots should compare, on a routine basis, their tests with the FDA-licensed Western blot kit using well-characterized serum specimens.

Clinical diagnosis and follow-up of patients is the responsibility of the clinical practitioner. Serologic test results are but one contribution to a patient's data base, which contains medical history (including high-risk behavior or exposure to HIV), results of physical examination, and other clinical findings. Clinicians must consider the total profile for a client when attempting to make a diagnosis after indeterminate Western blot results have been obtained. Accurate diagnosis for such persons can be challenging--and the challenge can be complicated by the tendency of some clients to become distressed by the apparent "uncertainty" of their test results.

Clinical follow-up of patients with indeterminate Western blot results may require many months of observation, interviewing, and testing. Most indeterminate patterns involve p18 (also referred to as p17), p24, or p55, or any combination of these three proteins (16-18). In one study of 390 "atypical" or indeterminate samples, 53% reacted against p24, with or without p18 or p55 47% reacted against p18 (but not p24), with or without p55 (18).

Some indeterminate results may be obtained with serum samples from persons who are in the process of seroconverting. A compilation of 209 volunteer blood donors with GAG-only indeterminate Western blot results were followed for as long as 2 years (17-21). During that time, only five of 134 persons who had initially reacted to p24 developed additional bands on the Western blot test. None of the 75 persons who initially reacted against p18 (but not p24) developed additional bands. The five persons who did seroconvert had positive results when their first follow-up samples were tested. The intervals between initial and follow-up tests were 8 weeks (two persons), 20 weeks (two persons), and 32 weeks (one person). The three longest intervals reflected delays in follow-up testing and not the actual time to seroconversion. These results do not refute earlier findings that seroconversion typically occurs within 3 months of infection (5,22). The importance of careful risk assessment for persons with indeterminate Western blot patterns was reemphasized when in one study (18) two of three people who initially had indeterminate results (but later seroconverted) disclosed histories of risk behavior when they were reinterviewed during follow-up.

A person whose Western blot test results continue to be consistently indeterminate for at least 6 months--in the absence of any known risk factors, clinical symptoms, or other findings--may be considered to be negative for antibodies to HIV-1. Such persons should be reassured that they are almost certainly not infected with HIV-1. However, no large-scale studies have been done to provide virologic data to confirm independently the serologic findings from the studies of clients whose Western blot test results are consistently indeterminate. In contrast, an asymptomatic person who has an indeterminate Western blot test result and a history of possible exposure to or symptoms compatible with HIV infection requires additional diagnostic follow-up. This should include conducting serial Western blot testing, assessing the function of the individual's immune system, and eliciting the cooperation of the person's sexual and needle-sharing partners to determine whether they are infected. Individuals with a pattern of indeterminate Western blot test results should not donate blood or plasma for either transfusion or use in manufactured blood products.

As the HIV/AIDS epidemic continues, additional tests of higher specificity will be needed to decrease the number of false-positive reactions and to permit correct diagnosis of HIV infection in a larger spectrum of clinical situations in which an indeterminate antibody profile exists. The use of new antibody tests based on antigens derived by recombinant deoxyribonucleic acid (DNA) technology or the application of DNA probe technology--particularly DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR)--already shows promise in this area (23).

ცნობები

Centers for Disease Control. Provisional public health service

inter-agency recommendations for screening donated blood and plasma for antibody to the virus causing acquired immunodeficiency syndrome. MMWR 198534:1-5.

2. Centers for Disease Control. Public health service guidelines for counseling and antibody testing to prevent HIV infection and AIDS. MMWR 198736:509-15.

3. Centers for Disease Control. Update: Serologic testing for antibody to human immunodeficiency virus. MMWR 198836:833-40, 845.

4. Lange JMA, Coutinho RA, Krone WJA, et al. Distinct IgG recognition patterns during progression of subclinical and clinical infection with lymphadenopathy associated virus/human T lymphotropic virus. Brit Med J 1986292:228-30.

5. Esteban JI, Shih JW, Tai CC, et al. Importance of Western blot analysis in predicting infectivity of anti-HTLV-III/LAV positive blood. Lancet 19852:1083-6.

6. Goudsmit J, Lange JMA, Paul DA, et al. 1987. Antigenemia and antibody titers to core and envelope antigens in AIDS, AIDS-related complex, and subclinical human immunodeficiency virus infection. J Infect Dis 1987155:558-60.

7. Lange JDA, Paul DA, Huisman HG, et al. Persistent HIV antigenemia and decline of HIV core antibodies associated with transition to AIDS. Brit Med J 1986293:1459-62.

8. Weber JN, Clapham PR, Weiss RA, et al. Human immunodeficiency virus infection in two cohorts of homosexual men: neutralizing sera and association of anti-gag antibody with prognosis. Lancet 1987i:119-21.


Maintain some integrity with NP-40 or Triton X-100 lysis buffer

NP-40 (Nonidet P-40) and Triton X-100 are milder, nonionic detergents. They are good at solubilizing membrane proteins and for isolating cytoplasmic proteins. Proteins retain their native state in the presence of these detergents and protein-protein interactions can be preserved. These buffers can be used for co-IPs.

NP-40 and Triton X-100 will not lyse nuclear membranes. After lysis, pellet the nuclei by centrifugation and transfer the supernatant to a new tube. If you wish to isolate both the nuclear and soluble fractions, resuspend the nuclear pellet in RIPA buffer.

NP-40 is also marketed under the name Igepal CA-630.

NP-40/Triton X-100 lysis buffer : 50 mM Tris•HCl, pH 8.5, 150 mM NaCl*, 1% detergent*

*The concentrations of salts and detergents can be altered to optimize protein recovery.


Primary antibodies and determining specificity

The principle of the WB is the detection of protein(s) through the binding and recognition of antibodies (Ab) to one or more targets this interaction should be highly specific between a portion of the antigen (protein) or epitope and the specific recognition sites found on the fragment antigen-binding (Fab) region of the antibody termed a paratope (Kurien et al., 2011 ) (Fig. 1). The 1°Ab should be thoroughly assessed and validated to be specific and sensitive enough to detect the intended target protein. It is important to check that the antibody is specific toward the native or denatured protein, as the denaturing treatment of protein samples prior to SDS-PAGE may alter the exposure and availability of the epitope, affecting antibody binding affinity. In some cases, it may be necessary to use “native-specific” monoclonal antibodies (Tino et al., 2000 ). The targeted peptide sequence may be available from the supplier to allow confirmation of specificity and region of binding however, occasionally this may be unavailable proprietary information. Traditionally 1°Ab are produced through immunization of the host using purified target proteins, whereas modern approaches utilize synthetic peptides, often producing Ab toward short denatured 8–10 amino acid sequences. Isolation and purification is generally achieved through affinity chromatography isolating antibodies and small proteins and/or anion-exchange filtration depending on the class (i.e., IgG, IgM) (Clezardin et al., 1986 ). Predicted and confirmed species cross-reactivity information is often only available through the vendor however, binding will entirely depend on the antigen region. When choosing a 1°Ab, there may be multiple forms available from different vendors, ideally each would bind to a unique antigen upon the protein of interest, allowing accurate assessment of the protein's abundance. However, this is often not the case, and assessment of the previous literature utilizing that antibody is strongly advised. Some proteins may be orthologous and contain the same or similar sequence to other species. Thus, if a 1°Ab is specific to an epitope with this sequence, it may be used to probe other species (i.e., GAPDH 1°Ab may be used on human, rat, and mouse tissue). Depending on the protein of interest, extensive testing of multiple antibodies may have already been undertaken, allowing the most suitable antibody to be selected. For example, the VDR has low expression within skeletal muscle, and in order to find a 1°Ab capable of detecting it by WB and immunofluorescence, extensive validation of a panel of multiple 1°Abs was required (Wang et al., 2010 ). The identification of a highly specific VDR 1°Ab (D-6 Santa Cruz Biotechnology, Cambridge, UK) was confirmed and is believed to be the most representative. Assessment of new antibodies for a target antigen requires even more careful testing, including the use of a variety of appropriate positive and negative controls (discussed below).

Specificity and performance of the 1°Ab antibody is also dependent on whether it is monoclonal (mAb) or polyclonal (pAb). Both have disadvantage/advantage pAb are produced from differing B-cell lineages, recognizing multiple epitope regions on an antigen. They are generally more cost-effective (Lipman et al., 2005 ) and provide more antibody molecules that can target the protein of interest, producing potentially a greater level of sensitivity upon analysis (MacPhee, 2010 ). However, their specificity can also be compromised, due to greater possibility of non-specific binding (MacPhee, 2010 ). In contrast, mAb provide highly consistent and specific binding to a specific and known epitope on an antigen, as they are produced from a single cell lineage, raised against a single specific epitope (Lipman et al., 2005 MacPhee, 2010 ). Yet binding affinities of mAb can suffer if the epitope structure is affected in any way through denaturing or electrophoresis for example (Lipman et al., 2005 ).

Depending on the primary amino acid sequence of the target protein, similar epitopes may be present within degradation products or alternate isoforms, potentially presenting additional bands. Degradation products will migrate ahead of the band of interest, due to the decreased molecular weight. 1°Ab affinities toward alternative isoforms may not interfere with data interpretation if the bands are sufficiently separated (i.e., have different molecular weights). For example, certain antibodies toward P70 S6K1 (70 kDa), a critical protein in the mRNA translational initiation pathway and one of the most probed of all in the muscle and exercise field, may bind to the isoform P80 S6K (80 kDa). P80 S6K encodes a nuclear localization signal and contains an additional 23 amino acids and would be present above P70 S6K1 when blotted (Thomas, 1993 ). Nonetheless, sufficient electrophoretic separation between the two isoforms and appropriate controls may allow correct identification. For example, insulin-treated L6 myotubes increased P70 S6K1 phosphorylation (Somwar et al., 1998 ) but not P85 S6K allowing, in this instance, identification of the correct band nonetheless, this does not guarantee specificity. However, the assessment of a bands molecular weight may not always be suitable, as some proteins may migrate to a non-predictable region. For instance, the mTOR regulator REDD1 has a predicted molecular weight of 25 kDa however, it is detectable at 35 kDa due to multiple lysine residues (increased positively charged residues) (Chang et al., 2009 ). This highlights the importance of knowing the migrating properties of the target protein, and if unexpected bands occur, literature investigation may be required.

In order to validate the specificity of a new 1°Ab, it should be tested against a positive lysate or purified protein control, giving a detectable band at the correct molecular weight and a negative sample from a tissue known not to express the intended target [The Human Atlas provides reliable protein expression data (http://www.proteinatlas.org)], resulting in no detectable band. Sometimes, it may be appropriate to include a specific knock-in/out (e.g., via shRNA or siRNA) sample to allow confirmation of a target within the same tissue type. For example, overexpression of AKT isoforms (an essential signaling protein for muscle hypertrophy/atrophy) within rat skeletal muscle following shRNA produced detectable bands at the predicted molecular weight (

40 kDa) compared with control samples (Cleasby et al., 2007 ). Conversely, knockdown of AKT, again within skeletal muscle, demonstrated a reduction in band intensity at the same molecular weight compared with control samples. Similarly protein inhibitors (e.g., LY294002, rapamycin, etc.) known to block specific phosphorylation pathways can be used. For example, the addition of LY294002 to cultured cells inhibits PI(3)K, resulting in decreased phosphorylation of down-stream intermediates (i.e., AKT/P70 S6K1) (Rommel et al., 2001 ). Thus, if probing for phosphorylated P70 S6K1, cultured L6 cells treated with/without insulin and LY294002 will provide a robust positive (greater band intensity) and negative control (reduced intensity), respectively, compared with untreated samples. In this instance, the inclusion of an untreated sample alongside an inhibited negative control will confirm the reduction in band intensity is in fact due to decreased expression, rather than a loss of detection. Despite rigorous testing of antibodies with appropriate positive/negative controls, additional bands may still be present or insufficiently separated making identification and quantitation of the correct band (if present) unreliable. Absolute confirmation of the presence of a protein in a given band may be achieved by mass spectrometry via determination of the peptide sequence (Trauger et al., 2002 ). Briefly, the band of interest is excised and the mixture of proteins digested by trypsin into small peptide sequences capable of being sequenced by liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS/MS). Utilizing this approach, however, requires access to highly specific and costly equipment and technical expertise, but can provide validation of antibody specificity. Ultimately, positive and negative controls will help establish the degree of non-specific binding and potential false-positive bands, along with the confirmation of increased/decreased protein expression, giving confidence that the highlighted band is indeed the correct one.


Western blot protocol

Reviewed December 14 2020

Western blotting is a technique that uses specific antibodies to identify proteins that have been separated based on size by gel electrophoresis. The immunoassay uses a membrane made of nitrocellulose or PVDF (polyvinylidene fluoride). The gel is placed next to the membrane and the application of an electrical current induces the proteins to migrate from the gel to the membrane. The membrane can then be further processed with antibodies specific for the target of interest and visualized using secondary antibodies and detection reagents.

შინაარსი

View our western blot protocol video below.

For other video protocols please visit our video protocols library here.

​​If you are looking to build up your skills in western blot analysis, check out our free on-demand western blot training.

​Solutions and reagents: lysis buffers

These buffers may be stored at 4°C for several weeks or aliquoted and stored at -20°C for up to a year.

NP-40 buffer

  • 150 mM NaCl
  • 1.0% NP-40 (possible to substitute with 0.1% Triton X-100)
  • 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
  • პროტეაზას ინჰიბიტორები

RIPA buffer (radioimmunoprecipitation assay buffer)

  • 150 mM NaCl
  • 1% IGEPAL CA-630
  • 0.5% sodium deoxycholate
  • 0.1% SDS (sodium dodecyl sulphate)
  • 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
  • პროტეაზას ინჰიბიტორები

Tris-HCl

​ Solutions and reagents: running, transfer, and blocking buffers

​Laemmli 2X buffer/loading buffer

  • 4% SDS
  • 10% 2-mercaptoethanol
  • 20% glycerol
  • 0.004% bromophenol blue
  • 0.125 M Tris-HCl

Check the pH and adjust to 6.8

Running buffer (Tris-Glycine/SDS)

Check the pH and adjust to 8.3

Transfer buffer (wet)

  • 25 mM Tris base
  • 190 mM glycine
  • 20% methanol
  • Check the pH and adjust to 8.3

For proteins larger than 80 kDa, we recommend that SDS is included at a final concentration of 0.1%.

Transfer buffer (semi-dry)

  • 48 mM Tris
  • 39 mM glycine
  • 20% methanol
  • 0.04% SDS

Blocking buffer

3–5% milk or BSA (bovine serum albumin)

Add to TBST buffer. Mix well and filter. Failure to filter can lead to spotting, where tiny dark grains will contaminate the blot during color development.

​Sample lysis

​Preparation of lysate from cell culture

  1. Place the cell culture dish on ice and wash the cells with ice-cold PBS.
  2. Aspirate the PBS, then add ice-cold lysis buffer (1 mL per 10 7 cells/100 mm dish/150 cm 2 flask 0.5 mL per 5x10 6 cells/60 mm dish/75 cm 2 flask).
  3. Scrape adherent cells off the dish using a cold plastic cell scraper, then gently transfer the cell suspension into a pre-cooled microcentrifuge tube. Alternatively, cells can be trypsinized and washed with PBS prior to resuspension in lysis buffer in a microcentrifuge tube.
  4. Maintain constant agitation for 30 min at 4°C.
  5. Centrifuge in a microcentrifuge at 4°C. You may have to vary the centrifugation force and time depending on the cell type a guideline is 20 min at 12,000 rpm but this must be determined for your experiment (leukocytes need very light centrifugation).
  6. Gently remove the tubes from the centrifuge and place on ice, aspirate the supernatant and place in a fresh tube kept on ice, and discard the pellet.

​Preparation of lysate from tissues

  1. დაშალეთ საინტერესო ქსოვილი სუფთა ხელსაწყოებით, სასურველია ყინულზე და რაც შეიძლება სწრაფად, პროტეაზების მიერ დეგრადაციის თავიდან ასაცილებლად.
  2. Place the tissue in round-bottom microcentrifuge tubes or Eppendorf tubes and immerse in liquid nitrogen to snap freeze. შეინახეთ ნიმუშები -80°C-ზე შემდგომი გამოყენებისთვის ან შეინახეთ ყინულზე დაუყოვნებლივ ჰომოგენიზაციისთვის. For a

Sample preparation

  1. Remove a small volume of lysate to perform a protein quantification assay. Determine the protein concentration for each cell lysate.
  2. Determine how much protein to load and add an equal volume 2X Laemmli sample buffer.​

​Loading and running the gel

  1. Load equal amounts of protein into the wells of the SDS-PAGE gel, along with a molecular weight marker. Load 20–30 μg of total protein from cell lysate or tissue homogenate, or 10–100 ng of purified protein.
  2. Run the gel for 1–2 h at 100 V.

he time and voltage may require optimization. We recommend following the manufacturer’s instructions. A reducing gel should be used unless non-reducing conditions are recommended on the antibody datasheet.

The gel percentage required is dependent on the size of your protein of interest:

Protein size

Gel percentage

Gradient gels can also be used.

​Transferring the protein from the gel to the membrane

The membrane can be either nitrocellulose or PVDF. Activate PVDF with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer before preparing the stack. The time and voltage of transfer may require some optimization. We recommend following the manufacturer’s instructions. Transfer of proteins to the membrane can be checked using Ponceau S staining before the blocking step.

Prepare the stack as follows:

Figure 1. Example of prepared stack.

ანტისხეულების შეღებვა

  1. Block the membrane for 1 h at room temperature or overnight at 4°C using blocking buffer.
  2. Incubate the membrane with appropriate dilutions of primary antibody in blocking buffer. We recommend overnight incubation at 4°C other conditions can be optimized.
  3. Wash the membrane in three washes of TBST, 5 min each.
  4. Incubate the membrane with the recommended dilution of conjugated secondary antibody in blocking buffer at room temperature for 1 h.
  5. Wash the membrane in three washes of TBST, 5 min each.
  6. For signal development, follow the kit manufacturer’s recommendations. Remove excess reagent and cover the membrane in transparent plastic wrap.
  7. Acquire image using darkroom development techniques for chemiluminescence, or normal image scanning methods for colorimetric detection.

Useful links

All lanes: beta Actin antibody - loading control (ab8227) at 1/5000 dilution

Lane 1: HeLa whole cell extract
Lane 2: Yeast cell extract
Lane 3: Mouse brain tissue lysate

Protocols are provided by Abcam “AS-IS” based on experimentation in Abcam’s labs using Abcam’s reagents and products your results from using protocols outside of these conditions may vary.

Webinar transcript​

The purpose of western blotting is to separate proteins on a gel according to the molecular weight. The proteins are then transferred onto a membrane where they can be detected using antibodies. Heat the samples and 95 degrees C for five to 10 minutes in a sample buffer containing a reducing agent such as beta-mercaptoethanol. This results in linearized proteins with a negative charge proportional to their size.

Place a gel into the electrophoresis tank and add in buffer, ensuring the tops of the wells are covered. Acrylamide percentage of the gel being used depends on the molecular weight of the target protein. Node a molecular weight market into the first lane then load the samples into adjacent wells. All the samples which contained equal amounts of protein. Once all the samples are loaded, ad running buffer, place the lid onto the electrophoresis tank. Turn on the power supply and set the voltage recommended by the manufacturer of the gels in the gel tank. You should be able to see bubbles rising through the tank. Run the gel until the die front has moved sufficiently down the gel.

The next stage is to transfer the proteins from the gel onto a membrane. Membranes are usually made from nitrocellulose or PVDF. Remove the gel from the tank and carefully release it from its plastic case. Cut up the wells and the gel foot and place the gel into transfer buffer. Prepare the transfer stack by sandwiching the membrane and gel between filter paper and sponges. The membrane should be traced to the positive electrode and the gel closest to the negative electrode. Use a small roller to remove any bubbles between the gel and the membrane. Cap the transfer case closed and submerge into a transfer tank containing transfer buffer. Add water to the outer chamber to keep the system cool and put on the lid. Turn on the power supply to begin protein transfer. Time and voltage require optimization, so check the manufacturer's instructions for guidance.

Now that the proteins have migrated from the gel onto the nitro cellulose membrane, the protein of interest can be detected as an antibody. The membrane can be removed from the cassette and the molecular weight market should now be visible. If required, the transfer of proteins can be confirmed by staining the membrane with [inaudible 00:04:40] solution. To prevent nonspecific binding of the antibody, the membrane needs to be blocked. Pour blocking buffer onto the membrane and agitate gently on a rocker. Typically, this is done using a solution of five percent milk or bovine serum albumin, BSA, for two hours at room temperature or overnight at four degrees. The time and type of blocking buffer should be optimized, so check the data sheet of the primary antibody you intend to use for details.

After the membrane is blocked, remove the blocking buffer and add the diluted primary antibody in the same solution. Incubate on the rocker as before. Typically primary antibody incubations are for one hour at room temperature or overnight at four degrees C. Antibody concentration and incubation time will need to be optimized. Refer to the antibody datasheet for guidance. Pour off the primary antibody and rinse the membrane twice in wash buffer. Follow with one 15 minute wash and three 10 minute washes on a rocker. The wash buffer is usually Trys buffered saline, TBS, or phosphate buffered, saline, PBS, with 0.1 percent tween 20.

Pour off the wash buffer and incubate the membrane in conjugating secondary antibody which has been diluted in blocking buffer. Usually this is done for one hour at room temperature, but antibody concentration and incubation time will need to be optimized. Pull off the secondary antibody and wash the membrane has shown previously.

There are several different systems for detection. If the secondary antibodies conjugate into an enzyme, incubate the membrane in the appropriate substrate before imaging. If the secondary antibodies are fluorescent counjugates then you can move directly onto the imaging step. Imaging can be carried out with x Ray film or with a digital imaging system. Place the membrane into an imaging tray. Place the imaging tray into imaging system. Exposure times will most likely need to be optimized in order to clearly detect the bands relating to the proteins of interest.