ინფორმაცია

რამდენი მოლეკულაა ზოგადად საჭირო უჯრედის სასიგნალო პროცესებისთვის მოცემულ შემთხვევებში?

რამდენი მოლეკულაა ზოგადად საჭირო უჯრედის სასიგნალო პროცესებისთვის მოცემულ შემთხვევებში?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

მე ვიცი, რომ ეს მართლაც ფართო თემაა, მაგრამ მე მაინტერესებს მხოლოდ რამდენიმე შემთხვევა:

  1. კვორუმის ზონდირება
  2. ნეიროტრანსმიტერები სურათების/ზოგადი ინფორმაციის გადაცემისთვის
  3. ჰორმონები/ფერომონები

რეალურად მინდა ვიცოდე, რომ საჭიროა ერთი ან ასობით მოლეკულა ინფორმაციის ერთი უჯრედიდან მეორეზე გადასაცემად. ვეძებე მაგრამ მოლეკულების დაახლოებით რაოდენობა, ვერსად ვიპოვე.


უჯრედს შეუძლია სხვა უჯრედებთან ურთიერთქმედება მილიონობით გზით. თქვენ შეგიძლიათ გაგზავნოთ ინფორმაცია ერთი უჯრედიდან სხვა უჯრედებში ნეიროტრანსმიტერების, ჰორმონების, ფერომონების, ელექტრული სიგნალების, მაგნიტური რეზონანსის, ლეიკოტრინების და ა.შ.

ზოგადად, ერთი ტიპის მოლეკულა საკმარისია ასეთი ინფორმაციის გასაგზავნად. როგორც თქვენ გჭირდებათ მხოლოდ აცეტილქოლინი (Ach), როგორც ნეიროტრანსმიტერი სხვადასხვა ნერვული იმპულსების გადასაცემად. მაგრამ, თუნდაც ერთი ტიპისთვის, გჭირდებათ ათასობით მოლეკულა. ისევე როგორც Ach-ის 1 მოლეკულას თითქმის არაფრის გაკეთება შეუძლია და მაშინვე დაიშლება აცეტილქოლინესტერაზას მიერ. თქვენ გჭირდებათ 1000 ასეთი მოლეკულა.

თქვენ შეგიძლიათ შეცვალოთ საკომუნიკაციო ინფორმაცია სხვადასხვა ტიპის გადამცემების საშუალებით. თქვენ შეგიძლიათ გამოიყენოთ GABA ან გლიცინი ნებისმიერი ინფორმაციის გაცვლის შესაჩერებლად ან გამოიყენოთ დოფამინი მის გასაძლიერებლად. მაგრამ ისევ დაგჭირდებათ GABA ან გლიცინის მრავალი მოლეკულა.

ვიზუალური გზისთვის შეგიძლიათ გამოიყენოთ No. ისეთი ტიპის გადამცემები, როგორიცაა გლუტამატი, გლიცინი, გაბა, დოფამინი, აცეტილქოლინი, ნივთიერება P და ა.შ. ნეიროტრანსმიტერები ვიზუალური გზისთვის.

ჰორმონები არის გადამცემები, რომლებიც საჭიროა მცირე რაოდენობით. მაგრამ, ისევ თქვენ გჭირდებათ გარკვეული კონცენტრაცია. სისხლში არსებობს სხვადასხვა ჰორმონების ნორმალური კონცენტრაცია, როგორიცაა 80 პგ/მლ კალციტონისთვის.

Quorum sensing იყენებს გადამცემებს, როგორიცაა AHL. ისევ გარკვეული ზღვრული მნიშვნელობაა საჭირო მათთვის მოქმედებისთვის.

ისევ, ამ გადამცემების წარმოებისთვის, თქვენ უნდა გაიაროთ ტრანსკრიფციის, თარგმანისა და შემდგომი თარგმანის ცვლილებების მკაცრი პროცესი. ასე რომ, უჯრედის კომუნიკაციისთვის მკაცრი პროცესი გამოიყენება.


Gab1 საჭიროა უჯრედული ციკლის გადასვლისთვის, უჯრედების პროლიფერაციისა და ტრანსფორმაციისთვის, რომელიც გამოწვეულია ონკოგენური მეთრეცეპტორით

ჩვენ ადრე ვაჩვენეთ, რომ ონკოგენური Met რეცეპტორიდან Tpr-Met ან Grb2- ან Shc შუამავლობით სიგნალი საკმარისია უჯრედული ციკლის პროგრესირების გასააქტიურებლად. ქსენოპუსი კვერცხუჯრედები. თუმცა, ამ გადამყვანების პირდაპირი მიბმა Tpr-Met-თან შეუცვლელია, რაც გულისხმობს, რომ სხვა Met სავალდებულო პარტნიორი შუამავლობს ამ პასუხებს. ამ კვლევაში ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ Grb2-თან ასოცირებული შემკვრელის 1 (Gab1) გადაჭარბებული გამოხატვა ხელს უწყობს უჯრედული ციკლის პროგრესირებას, როდესაც Tpr-Met გამოხატულია არაოპტიმალურ დონეზე. ეს პასუხი მოითხოვს, რომ Gab1-ს ჰქონდეს უცვლელი Met-დაკავშირების მოტივი, პლექსტრინის ჰომოლოგიური დომენი და ფოსფატიდილინოზიტოლ 3-კინაზასა და ტიროზინფოსფატაზას SHP-2-ის დამაკავშირებელი ადგილები, მაგრამ არა Grb2 და CrkII/ფოსფოლიპაზა Cγ. მნიშვნელოვანია, რომ ჩვენ დავადგინეთ, რომ Gab1-ის შუამავლობით სიგნალები გადამწყვეტია უჯრედული ციკლის გადასვლისთვის, რომელსაც ხელს უწყობს ონკოგენური Met და ფიბრობლასტური ზრდის ფაქტორის რეცეპტორები, მაგრამ არა პროგესტერონის, უჯრედული ციკლის გადასვლის ბუნებრივი ინდუქტორი. ქსენოპუსი კვერცხუჯრედები. გარდა ამისა, Gab1 აუცილებელია Tpr-Met–შუამავლობითი მორფოლოგიური ტრანსფორმაციისა და ფიბრობლასტების პროლიფერაციისთვის. ეს კვლევა იძლევა პირველ მტკიცებულებას, რომ Gab1 არის Met რეცეპტორის ძირითადი დამაკავშირებელი პარტნიორი უჯრედული ციკლის პროგრესირების, პროლიფერაციისა და ონკოგენური მორფოლოგიური ტრანსფორმაციის ინდუქციისთვის. ეს კვლევა განსაზღვრავს Gab1-ს და მის დაკავშირებულ სასიგნალო პარტნიორებს, როგორც პოტენციურ თერაპიულ სამიზნეებს, რომლებიც აფერხებენ კიბოს უჯრედების პროლიფერაციას ან ტრანსფორმაციას ადამიანის ავთვისებიან სიმსივნეებში, რომლებიც შეიცავს დერეგულირებულ Met რეცეპტორს.


შესავალი

დიდი ხანია ცნობილია, რომ ბირთვული ფორების კომპლექსები (NPC) ფუნქციონირებენ, როგორც კარიბჭე, რომლებიც აკონტროლებენ ცილის და რნმ-ის ტრანსპორტირებას ბირთვსა და ციტოპლაზმას შორის (Wente and Rout, 2010). თუმცა, საფუარის, ბუზისა და ძუძუმწოვრების სისტემებში ჩატარებულმა კვლევებმა აჩვენა სხვადასხვა ნუკლეოპორინები ტრანსკრიპციულ აქტივაციაში, ტრანსკრიპციულ გახანგრძლივებაში, რნმ-ის დამუშავებაში, რნმ-ის სტაბილიზაციაში, გენის გაჩუმებაში და ჰეტეროქრომატინის წარმოქმნაში (Pascual-Garcia and Capelson, 2014). ეს ანგარიშები მიუთითებს, რომ ნუკლეოპორინები ასრულებენ მრავალფეროვან როლს გენის რეგულირებაში და ქრომატინის ბიოლოგიაში, გარდა მათი კანონიკური ფუნქციისა ნუკლეოციტოპლაზმურ ტრანსპორტში.

ადრეული მინიშნება იმის შესახებ, რომ NPC-ებმა შესაძლოა როლი შეასრულონ ქრომატინის ორგანიზაციაში მოვიდა ბირთვული გარსის (NE) ელექტრონული მიკროსკოპული ანალიზით, რომელიც აღნიშნავდა, რომ NPC-ები იკვეთება მჭიდროდ შეფუთული ჰეტეროქრომატინის რეგიონებს შორის (Blobel, 1985). ამ ადრეული დაკვირვების შემდეგ, NPC-ები ნაჩვენებია მთვარის შუქზე, როგორც ქრომატინის ორგანიზაციის რეგულატორები დნმ-ის „ზიპ კოდების“ შეერთებით (Light და სხვ., 2010 Brickner და სხვ., 2012) ან გენების 5′ და 3′ ბოლოების დაკვრა (ტან-ვონგი და სხვ., 2009), ისევე როგორც ხარაჩოების ან გენის გააქტიურება (Taddei და სხვ., 2006) ან რეპრესია (Van de Vosse და სხვ., 2013) კონტექსტზე დამოკიდებული სახით. გარდა ამისა, NPCs, როგორც ჩანს, კოორდინაციას უწევს ტრანსკრიფციას mRNA-ს ექსპორტთან ურთიერთქმედებით როგორც რნმ-ის დამუშავების, ასევე mRNA ექსპორტის მექანიზმებთან (Rougemaille და სხვ., 2008).

ბოლოდროინდელმა კვლევებმა აჩვენა, რომ ცალკეული ნუკლეოპორინების ქრომატინთან დაკავშირებული ფუნქციები ვრცელდება NPC სტრუქტურის მიღმა ქრომატინის უბნებზე, რომლებიც არ ურთიერთქმედებენ ბირთვულ პერიფერიასთან (კაპელსონი და სხვ., 2010 წელი კალვერდა და სხვ., 2010 Liang და სხვ., 2013). ეს ფენომენი შეიძლება აიხსნას იმ დასკნით, რომ ნუკლეოპორინები აჩვენებენ NPC-ის რეზიდენციის დროების დიაპაზონს, რომელიც მოიცავს რამდენიმე რიგის მასშტაბებს (რაბუტი და სხვ., 2004 ა). მაგალითად, ცენტრალური NPC ხარაჩოს ​​კომპონენტები უკიდურესად სტაბილურია NPC-ზე და იცვლება მხოლოდ მაშინ, როდესაც ბირთვი იშლება მიტოზში. ამრიგად, ამ სტაბილური ხარაჩოების ნუკლეოპორინების ნებისმიერი როლი გენის რეგულირებაში, სავარაუდოდ, გვხვდება NPC სტრუქტურაში. ამის საპირისპიროდ, ბირთვული კალათის კომპონენტებს, როგორიცაა Nup153 და Nup50, აქვთ წამების დრო NPC-ზე და, შესაბამისად, შეუძლიათ გამოიკვლიონ ნუკლეოპლაზმა NPC-ის შეკავშირების მოვლენებს შორის. Nup153-ს აქვს Zn თითის დომენი და ურთიერთქმედებს ტრანსკრიპციულად აქტიური ქრომატინის ტრაქტებთან დროზოფილა მელანოგასტერი (ვაკერიზას და სხვ., 2010). მსგავსი ქცევა დაფიქსირდა Nup98-ის ბირთვული აუზისთვის, რომელიც გროვდება დინამიურ ინტრაბირთვულ კერებში, რომელსაც ეწოდება GLFG სხეულები (Griffis და სხვ., 2004) ცალკე უფრო სტაბილური NPC აუზიდან (Rabut და სხვ., 2004 ა). ეს ნუკლეოპლაზმური აუზი ურთიერთქმედებს ქრომატინის ლოკებთან და არეგულირებს გენის ექსპრესიას (Capelson და სხვ., 2010 წელი კალვერდა და სხვ., 2010 Liang და სხვ., 2013). დაბოლოს, Nup153 და Nup98 მგრძნობიარეა ძუძუმწოვრების უჯრედებში ტრანსკრიპციული ინჰიბიციის მიმართ (გრიფისი და სხვ., 2002, 2004), რაც კიდევ უფრო გულისხმობს კავშირს NPC-სა და ტრანსკრიფციას შორის.

მობილურ ნუკლეოპორინებს შორის, Nup50-ს აქვს უმოკლეს დროში ყოფნის დრო NPC-ში და მხოლოდ ბირთვული სატრანსპორტო რეცეპტორები, როგორიცაა იმპორტინი β, უფრო დინამიურია (Rabut და სხვ., 2004 ა). უცნობია, როგორ უკავშირდება Nup50 დინამიკა Nup98 და Nup153-ს და აქვს თუ არა მას სხვა ფუნქციები ბირთვულ ტრანსპორტში მისი ცნობილი როლის მიღმა. Nup50 უშუალოდ ურთიერთქმედებს იმპორტინის α ქვეკლასის სატრანსპორტო რეცეპტორებთან (Lindsay and Macara, 2002 Pumroy და სხვ., 2012) და შეიძლება ჩაითვალოს, როგორც ინტერფეისი NPC სტრუქტურასა და მასში მოძრავ სატრანსპორტო მანქანას შორის. ეს ურთიერთქმედება აძლიერებს ცილის ტრანსპორტირებას გარკვეულ პირობებში (Lindsay and Macara, 2002), შესაძლოა იმპორტინის α დახურულ კონფორმაციით ამოკვეთით, რათა ხელი შეუწყოს გადამუშავებას (Pumroy და სხვ., 2012).

გენეტიკური მონაცემები მიუთითებს, რომ Nup50 არ არის საჭირო ნუკლეოციტოპლაზმური ტრანსპორტირებისთვის, რადგან ფიბრობლასტები, რომლებსაც არ გააჩნიათ Nup50, ნორმალურად მრავლდებიან კულტურაში. თუმცა, Nup50 −/- თაგვი გვიან კვდება გესტაციის პერიოდში ნერვული მილის ფორმირების მასიური დეფექტების გამო, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ Nup50 ასრულებს მნიშვნელოვან როლს უჯრედების კონკრეტულ ტიპებში განვითარების პროცესში (Smitherman და სხვ., 2000). Nup50 უკავშირდება ბირთვულ კალათას Nup153-თან ურთიერთქმედების გზით (Hase and Cordes, 2003 Makise და სხვ., 2012), მაგრამ ფუნქციონირებს თუ არა ის Nup153-თან ქრომატინთან დაკავშირებულ რომელიმე ფუნქციაში, უცნობია. მის სავარაუდო საფუარის ჰომოლოგს, Nup2, აქვს უნარი შეზღუდოს რეპრესიული რეგიონების გავრცელება ქრომატინზე (ე.წ. „სასაზღვრო აქტივობა“ Dilworth, 2005), და ნაჩვენებია, რომ Nup50 აკავშირებს ქრომატინის ლოკებს დ.მელანოგასტერი (კალვერდა და სხვ., 2010). ამ სურათს კიდევ უფრო ართულებს ის ფაქტი, რომ ბირთვული სატრანსპორტო ტექნიკის კომპონენტები ასევე ურთიერთქმედებენ ქრომატინის ლოკებთან (კასოლარი). და სხვ., 2004).

ამ კვლევაში, ჩვენ ვიკვლევთ Nup50-ის ბირთვულ ფუნქციებს და ვახსენებთ გასაოცარ დასკვნას, რომ Nup50 არ საჭიროებს მის ურთიერთქმედებას α იმპორტინთან და Nup153-თან, რათა მოხდეს ქრომატინის იმობილიზაცია ტრანსკრიპციული ინჰიბიციით. ჩვენ ვამოწმებთ Nup50-ის ფუნქციურ მნიშვნელობას და აღმოვაჩენთ, რომ მიობლასტის პროლიფერაციისთვის შეუცვლელია, მაგრამ ის აუცილებელია მიოგენური უჯრედების დიფერენციაციისთვის, რაც გვთავაზობს Nup50-ის როლს დიფერენციაციის სტიმულებზე ნორმალური პასუხების შუამავლობაში მისი პოზიციის მეშვეობით ქრომატინზე.


Მასალა და მეთოდები

თაგვის შტამები.

ამ კვლევაში გამოყენებული თაგვის მუტანტური შტამები ადრე იყო მოხსენებული (Danielian et al., 1998 Soriano, 1999 Tronche et al., 1999 Inatani et al., 2003). წარმოების Wnt1–Cre- ამოძრავებს Ext1 პირობითი მუტანტი თაგვები, Wnt1–Cre ტრანსგენური თაგვები შეწყვილდნენ ჰეტეროზიგოტურ თაგვებთან, რომლებიც ატარებდნენ Ext1 flox ალელი. შემდგომში, ისინი შეწყვილდნენ თაგვებთან, რომლებიც ჰომოზიგოტებს ჰყავდათ Ext1 flox ალელი (Ext1 flox/flox ) ემბრიონების მისაღებად ა Wnt1–CreExt1 flox/flox გენოტიპი. ნაშობილები, რომლებმაც მემკვიდრეობით მიიღეს ზემოაღნიშნული ალელების არასრული კომბინაცია, გამოიყენეს როგორც კონტროლი (მოხსენიებული, როგორც ველური ტიპი). ცხოველების გენოტიპირება ხდებოდა PCR-ით კუდის ბიოფსიიდან მომზადებული დნმ-ის გამოყენებით. ცხოველების გამოყენების ყველა პროტოკოლი დამტკიცებული იყო ბერნემის სამედიცინო კვლევის ინსტიტუტის ინსტიტუციური ცხოველთა მოვლისა და გამოყენების კომიტეტის მიერ და შეესაბამება ჯანმრთელობის ეროვნული ინსტიტუტის გაიდლაინებს.

უჯრედის კულტურა.

კომისურული ნეირონები დაშორდა ემბრიონული დღის 11.5 (E11.5) დორსალური ზურგის ტვინიდან და კულტივირებული იყო ლამინინით დაფარულ ჭურჭელზე შრატისგან თავისუფალი ნეირობაზალური გარემოში (Invitrogen, Carlsbad, CA) დამატებული B27-ით (Invitrogen), როგორც ადრე იყო აღწერილი (Bouchard et al. , 2004). ვენტრალური ზურგის ტვინიდან ნეირონები კულტივირებული იყო იმავე წესით. იმუნოციტოქემიისთვის, კულტურები 2 დ ინ ვიტრო ინკუბირებული იყო ცოცხალი 10E4 ანტი-HS მონოკლონური ანტისხეულით (თაგვი IgM Seikagaku America, Rockville, MD) 1 საათის განმავლობაში CO-ში2 ინკუბატორი. შემდეგ უჯრედები დაფიქსირდა 4% პარაფორმალდეჰიდში (PFA) 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე და გამტარიანდა 0.2% Trion X-100-ში 10 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე. უჯრედები ინკუბირებული იყო მონოკლონური ანტი-DCC (თაგვის IgG PharMingen, San Diego, CA) და კურდღლის პოლიკლონური ანტინეიროფილამენტის (NF) (Chemicon, Temecula, CA) ანტისხეულებით 2 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე, რასაც მოჰყვა გამოვლენა Alexa 488 ანტი- თაგვის IgM (ინვიტროგენი), როდამინ წითელი-X ანტი-თაგვის IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) და ციანინი 5 კურდღლის საწინააღმდეგო IgG (Jackson ImmunoResearch).

ჰისტოლოგიური და იმუნოჰისტოქიმიური ანალიზები.

ჰემატოქსილინ-ეოზინით (HE) შეღებვისთვის, ემბრიონები დაფიქსირდა 4% PFA-ში PBS-ში, გარეცხილი იყო PBS-ში, გაუწყლოებული და ჩაშენებული პარაფინში. იმუნოჰისტოქიმიისთვის, PFA-ზე დაფიქსირებული კრიოსტატის სექციები შეღებილი იყო ანტი-ნეიროფილამენტით (3A10), ანტი-TAG-1 (გარდამავალი აქსონალური გლიკოპროტეინი 1), ანტი-Pax7 (დაწყვილებული ყუთის გენი 7), ანტი-En1 (Engrailed 1) და ანტი -Nkx2.2 (NK2 ტრანსკრიფციის ფაქტორთან დაკავშირებული 2.2) (Developmental Studies Hybridoma Bank, აიოვას უნივერსიტეტი, აიოვა-სიტი, IA). ვენტრალური კომისურის ზომის გასაზომად, კომისურის სისქე გაზომეს სამ მონაკვეთად თითო ემბრიონზე და გამოითვალეს საშუალოდ. გაზომვისთვის გამოყენებული იქნა NIH ImageJ პროგრამული უზრუნველყოფა. ადგილზე ჰიბრიდიზაცია დიგოქსიგენინზე მარკირებული რიბოპრობებით ჩატარდა კრიოსექციაზე, როგორც ადრე იყო აღწერილი (Inatani et al., 2003). კომისურ აქსონების DiI ტრასინგისთვის, ემბრიონები E11.5-ზე დაფიქსირდა 4% PFA-ში ღამით, და DiI-ის (Invitrogen) კრისტალები იმპლანტირებული იყო ზურგის ტვინის დორსალურ ნაწილზე 24 საათის განმავლობაში. ვიბრატომის სექციები მოიჭრა და გამოიკვლია ფლუორესცენტური მიკროსკოპით. ბეტა-გალაქტოზიდაზას (β-გალი) შეღებვა Wnt1–CreR26R (ROSA26-ის მომხსენებელი) ემბრიონები შესრულდა ისე, როგორც ადრე იყო აღწერილი (Yu et al., 2003).

ექსპლანტაციის ანალიზი.

E11.5 ზურგის ტვინის დორსალური ექსპლანტები გაკვეთილი იქნა როგორც ადრე იყო აღწერილი (Kennedy et al., 1994). კოკულტურული ანალიზებისთვის, ექსპლანტანტები კულტივირებული იყო 24 საათის განმავლობაში სამგანზომილებიან კოლაგენურ გელებში (ტიპი I BD Biosciences, San Jose, CA) ნეტრინ-1-გამომსახველი HEK293T უჯრედების აგრეგატებით, დელ რიოს და სხვების მიხედვით. (2004). HEK293T უჯრედების გარდამავალი ტრანსფექცია ნეტრინ-1-ით განხორციელდა Lipofectamine 2000 (ინვიტროგენის) გამოყენებით. გასუფთავებული ნეტრინ-1-ის ეფექტის შესამოწმებლად, კოლაგენის გელებში ჩაშენებული ექსპლანტები კულტივირებული იყო რეკომბინანტული ნეტრინ-1-ით (R& D Systems, Minneapolis, MN) HS-ის ფერმენტულ და ქიმიურ მოცილებასთან ერთად. ექსპლანტანტები ინკუბირებული იყო 3 საათის განმავლობაში 2 U/ml ჰეპარიტინაზას, 20 μm ნაფთოლ-β-d-ქსილოზიდთან (Xyl-naphthol) ან 20 μm დეკაჰიდრო-2-ნაფთოლ-β-d-ქსილოზიდთან ერთად ან მის გარეშე ), შემდეგ კი კონცენტრირებული რეკომბინანტული ნეტრინი-1 დაემატა კულტურის მედიას საბოლოო კონცენტრაციით 500 ნგ/მლ. შემდეგ ექსპლანტანტები კულტივირებული იყო 24 საათის განმავლობაში. სურათები გადაღებულია ციფრული კამერით, რომელიც დამონტაჟებულია მიკროსკოპზე ფაზა-კონტრასტის ობიექტივით. აქსონის ჩალიჩების მთლიანი სიგრძე გაზომილი იყო NIH ImageJ პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით.

ბიოქიმიური და იმუნოქიმიური ანალიზები.

სინდეკან-3 გლიკანაციის ანალიზისთვის, ზურგის ტვინი დაიშალა დორსალურ და ვენტრალურ ნაწილებად, ცალკე ჰომოგენიზებული და ლიზირებული რადიოიმუნოპრეციპიტაციის ანალიზში (RIPA) ბუფერში. ლიზატების ჰეპარიტინაზას სამკურნალოდ, ველური ტიპის ემბრიონების მთლიანი ზურგის ტვინი ჰომოგენიზირებული იყო 10 მ მ HEPES ბუფერში, pH 7.2, რომელიც შეიცავს 1 მ მ კალციუმის აცეტატს და ინკუბირებული იყო ჰეპარიტინაზათ, როგორც ზემოთ იყო აღწერილი (Inatani et al., 2003). ლიზატები იმუნობლოტირდება ანტი-სინდეკან-3 პოლიკლონური ანტისხეულით (Toba et al., 2002). უჯრედგარე სიგნალით რეგულირებული კინაზას (ERK) აქტივაციის ანალიზისთვის, უჯრედები (დისოცირებული კომისურული ნეირონები და HEK293T უჯრედები, რომლებიც ტრანსფექტირებულია myc-ით DCC-ით იხილეთ ქვემოთ) დამუშავდა 500 ნგ/მლ რეკომბინანტული ნეტრინ-1-ით 15 წუთის განმავლობაში და ლიზირებული იქნა SDS ნიმუშში. ბუფერი. ლიზირებული ნიმუშები ამოღებულ იქნა SDS-PAGE-ით და დაექვემდებარა იმუნობლოტირებას ანტი-ERK1/2 და ანტი-ფოსფო-ERK1/2 ანტისხეულებით (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). ზურგის ტვინში DCC ფოსფორილირების ანალიზისთვის, დაშლილი ზურგის ზურგის ტვინი ჰომოგენიზირებული და ლიზირებულია RIPA ბუფერში. ლიზირებული ნიმუშები იმუნოპრეციპიტირდება ანტი-DCC ანტისხეულით (PharMingen) და შემდეგ იმუნობლოტირდება ანტი-DCC და ანტიფოსფოტიროზინით (კლონი PY-20 Transduction Laboratories, Lexington, KY) ანტისხეულებით. HEK293T უჯრედებში DCC ფოსფორილირების ანალიზისთვის, ზემოთ აღწერილი ნეტრინ-1-ით სტიმულირებული უჯრედები ლიზირებული იყო RIPA ბუფერში, იმუნოპრეციპიტაცია ანტი-myc მონოკლონური ანტისხეულით (9E10 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) და იმუნობლოტირდება PY-20-ით. . myc-ზე მონიშნული DCC-ის გამოხატვის მიზნით, HEK293T უჯრედები ტრანსფექტირდა ვირთხის DCC cDNA-ით, რომელიც ლიგირებულია pcDNA3.1/myc-His-ზე Lipofectamine 2000-ის გამოყენებით. იმუნობლოტირების შედეგების რაოდენობრივი განსაზღვრა განხორციელდა დენსიტომეტრიული ანალიზით, როგორც ეს იყო აღწერილი ადრე (Irie et al., 2005).


2 კულტივირებული ხორცის წარმოების მოსალოდნელი რეჟიმები

კულტივირებული ხორცის წარმოებისთვის უჯრედული კულტურის მედიის შემუშავებაზე ფიქრისას მნიშვნელოვანია გავითვალისწინოთ, თუ რა გავლენას მოახდენს მედია პროდუქტის გადამუშავებაზე. რა თქმა უნდა, მედიის ძირითადი გამოყენება იქნება ღეროვანი უჯრედების გაზრდა და მათი დიფერენცირება კუნთებად, ცხიმებად და შემაერთებელ ქსოვილებად. თუმცა, როგორ განხორციელდება ეს დამოკიდებული იქნება სასურველ პროდუქტზე - ან არასტრუქტურირებულ პროდუქტზე (მაგალითად, ბურგერი ან სოსისის პროდუქტი) ან სტრუქტურირებულ პროდუქტზე (როგორიცაა ქათმის მკერდი ან ბიფშტეიკი). ამიტომ, ამ ორ შემთხვევის ცალ-ცალკე ფიქრი სასწავლებელია.

სავარაუდოა, რომ პირველი პროდუქტები ბაზარზე იქნება არასტრუქტურირებული პროდუქტები. მიუხედავად იმისა, რომ სხვადასხვა სცენარების წარმოდგენა შეიძლებოდა საჭირო უჯრედების წარმოებისთვის, ალბათ ყველაზე სავარაუდო იქნებოდა ემბრიონული ან ინდუცირებული პლურიპოტენტური ღეროვანი უჯრედების გამრავლება ინოკულუმის ყველა სტადიაზე საბოლოო ზრდისა და დიფერენციაციის მასშტაბამდე (Speccht, 2020). თუ კულტივირებული ხორცის უჯრედული კულტურის მასშტაბი იქნებოდა 25,000 ლ, მაგალითად, რომელიც ჩაითვლება დიდი მასშტაბით ძუძუმწოვრების უჯრედებზე დაფუძნებული ბიოთერაპიული წარმოებისთვის, საჭირო იქნებოდა უჯრედის ინოკულუმის დაახლოებით 10 თანმიმდევრული ეტაპი (ვივარაუდოთ, რომ 20% ინოკულუმი თითოეულ ეტაპზე. იყოს გავრცელებული ბიოთერაპევტიკაში) (J. Zhang, 2014). ამ ეტაპებიდან თითოეული წარმოადგენს დაახლოებით სამიდან ოთხ გაორმაგებას, უჯრედებს დასჭირდებათ გადარჩენა ზრდის გარემოში, დიფერენციაციის გარეშე, 40-დან 50 თაობამდე. ამ სცენარში, მხოლოდ ბოლო ეტაპზე, ყველაზე დიდი მასშტაბის ბიორეაქტორია, რომ გარემო შეიცვლება, რათა ხელი შეუწყოს უჯრედების საჭირო ტიპების დიფერენციაციას (კუნთების, ცხიმის და შემაერთებელი ქსოვილის უჯრედები), სავარაუდოდ ცალკეულ ბიორეაქტორებში და შემდეგ შერეული. მიაღწიეთ სასურველ მიქსს საბოლოო პროდუქტის ფორმულირებისთვის (Hanga et al., 2020). მიუხედავად იმისა, რომ ეს ყველაზე მარტივი იქნებოდა ჭეშმარიტი სუსპენზიის კულტურისთვის, სულ მცირე შესაძლებელია, რომ ამ ჩვეულებრივად მიბმული უჯრედების ზრდა შეიძლება საჭირო იყოს საკვებ მიკრომატარებლებთან ერთად, რაც კიდევ უფრო გაართულებს მედიის ოპტიმიზაციას (Hanga et al., 2020 Verbruggen, Luining, van ესენი და პოსტი, 2018).

არასტრუქტურირებული პროდუქტების შექმნის ალტერნატიული მიდგომა იქნება უჯრედის თითოეული შემადგენელი ტიპის (კუნთების, ცხიმის და შემაერთებელი ქსოვილის) ზრდის მასშტაბირება. ეს შეიძლება განხორციელდეს უფრო დიფერენცირებული კუნთოვანი ქსოვილის ღეროვანი უჯრედების გამოყენებით. პროლიფერაცია საკმარისად დიდი რაოდენობით თაობებისთვის, რომ მასშტაბებს მიაღწიოს, თუმცა, შესაძლოა პრობლემური იყოს ამ ტიპის უჯრედებისთვის. მათი კულტურული სისტემების მანიპულირება შესაძლებელია უჯრედის ღეროსა და პროლიფერაციის გასაძლიერებლად (Ding et al., 2018), მაგრამ ამ შესაძლებლობის შესახებ ჯერ კიდევ ბევრი რამ უცნობია და ამ მიმოხილვის ფარგლებს სცილდება იმ სირთულეების განხილვა, რაც შეიძლება ჩაითვალოს.

კულტივირებული ხორცის ინდუსტრიის საბოლოო მიზანია სტრუქტურირებული პროდუქტების წარმოებაც. შესაძლებელია, რომ ყველა უჯრედი გაიზარდოს და დიფერენცირდეს საკვებ ხარაჩოზე, თუმცა ჟანგბადის და საკვები ნივთიერებების მიწოდება ამ სტრუქტურის მასშტაბით არ იქნება ადვილი ამოცანა და არც ქსოვილების უფრო სპეციალიზებულ ტიპებად დიფერენცირება. ადგილზე (პოსტი, 2012 წ.). კიდევ ერთი შესაძლებლობა იქნება იგივე მიდგომა, როგორც არასტრუქტურირებული პროდუქტებისთვის, გარდა იმისა, რომ აიღოთ დიფერენცირებული ან დიფერენცირებული უჯრედები ბოლო ეტაპის წარმოების ბიორეაქტორიდან, როგორც ზემოთ იყო აღწერილი და დაბეჭდოთ ისინი საკვებ ხარაჩოზე სასურველი ნიმუშით. ამას შეიძლება მოჰყვეს ზრდა ერთიდან ორ თაობამდე ადგილზე ქსოვილის ფორმის გასამაგრებლად.

რომელიმე ამ სცენარისთვის, უჯრედების სხვადასხვა წყაროების (მაგ. საქონლის ხორცი, ღორის, ქათმის, ინდაურის, თევზის) გამოყენება, სავარაუდოდ, საჭიროებს უნიკალური ფორმულირებების ხელახალი ოპტიმიზაციას როგორც ზრდის, ასევე დიფერენციაციის მედიისთვის. მიუხედავად იმისა, რომ ჯერ კიდევ არ არის ნათელი, რამდენად განსხვავებული იქნება ეს ოპტიმიზებული მედია თითოეული სასურველი წარმოების ეტაპისთვის, სქემისთვის და სახეობებისთვის, ისინი სავარაუდოდ მოიცავს სასიგნალო ნივთიერებების განსხვავებულ კონცენტრაციებს, რომლებიც არეგულირებენ პროლიფერაციას და მიოგენეზს. მიუხედავად ამისა, ყველა მედია უნდა იყოს საკვები კლასის, ცხოველური პროდუქტებისგან თავისუფალი და იაფი, რათა შეიქმნას და გაყიდოს სიცოცხლისუნარიანი კულტივირებული ხორცის პროდუქტი.


მიდგომა

სტუდენტების შერჩევა და სტუდენტური დემოგრაფია

BIOL 2104, უჯრედული და მოლეკულური ბიოლოგია, არის აუცილებელი მეორე დონის კურსი ვირჯინიის ტექნიკური უნივერსიტეტის ბიოლოგიის ბაკალავრიატის ყველა სპეციალობისთვის. ეს კურსი ასევე სავალდებულოა ან უფასო არჩევითია რამდენიმე სხვა ცხოვრების მეცნიერების სპეციალობისთვის კამპუსში. BIOL 2104-ის ტიპიური სექციები მერყეობს 50-დან 150 სტუდენტამდე, საშუალოდ 90 სტუდენტი თითო სექციაში. 2004 წლის გაზაფხულის სემესტრში ჩარიცხვა შეზღუდული იყო 50 სტუდენტით და შემოიფარგლებოდა ბიოლოგიის სპეციალობით, თუმცა ინსტრუქტორს შეეძლო დაემატებინა ოთხი სტუდენტი სხვა სპეციალობებიდან.

ამ კურსზე ჩარიცხული სტუდენტების დემოგრაფიული ინფორმაცია წარმოდგენილია ცხრილში 1. მამრობითი და მდედრობითი სქესის სტუდენტების პროპორცია კარგად შეესაბამება ბიოლოგიის სპეციალობების საერთო მნიშვნელობებს Virginia Tech-ში. 2003 წელს ბიოლოგიის სპეციალობები იყო 64.9% ქალი და 35.1% მამაკაცი (Virginia Tech ინსტიტუციური კვლევის ვებ-გვერდი http://www.irpa.vt.edu). შედარებისთვის, ასევე შედის დემოგრაფიული ინფორმაცია BIOL 2104-ის უფრო ტრადიციული განყოფილებისთვის, რომელიც ისწავლება 2003 წლის შემოდგომის სემესტრის განმავლობაში.

ცხრილი 1. დემოგრაფიული ინფორმაცია BIOL 2104-ში ჩარიცხული სტუდენტების შესახებ (ტრადიციული განყოფილება 2003 წლის შემოდგომაზე და ექსპერიმენტული სექცია 2004 წლის გაზაფხულის სემესტრების განმავლობაში)

a არატრადიციული სტუდენტები განისაზღვრება, როგორც ის სტუდენტები, რომლებიც უფრო ძველია ვიდრე ტიპიური ბაკალავრიატი და აქვთ სრულ განაკვეთზე დასაქმებული ან ბავშვის აღზრდის გამოცდილება.

ინსტრუქტორები

უჯრედული და მოლეკულური ბიოლოგიის ორ ექსპერიმენტულ სექციას ასწავლიდა ორი განსხვავებული ინსტრუქტორი, ორივე ქალი. მ. მ.ლ. იყო ორიგინალური BIOL 2104 კურსის კოდეველატორი, რომელიც პირველად ისწავლებოდა 1997 წლის შემოდგომაზე. JCS, რომელიც ასწავლიდა 2004 წლის გაზაფხულის განყოფილებას, არის უჯრედული ბიოლოგი, რომელიც ასწავლიდა BIOL 2104 ექვსჯერ ადრე, 1999 წლიდან, 30-დან 150-მდე ზომის სექციებში. სტუდენტები. მიუხედავად იმისა, რომ ფორმალურად არ იყო გაწვრთნილი ფემინისტურ პედაგოგიკაში, J.C.S. მომზადდა ამ სპეციალური განყოფილების სწავლებისთვის ფემინისტური პედაგოგიკაში შესაბამისი ძირითადი მასალების წაკითხვით (მაგ., Lederman and Bartsch, 2001) და განიხილავს მათ M.L. 2004 წლის გაზაფხულის სემესტრის განმავლობაში, D.E.W. იყო კურსის მასწავლებელთა ასისტენტი. D.E.W. ახლახან დაასრულა ბ.ს. ბიოლოგიაში ვირჯინიის Tech-ში და მუშაობდა 2003 წლის შემოდგომის სემესტრის განმავლობაში BIOL 2104-ის (ასწავლიდა J.C.S.) დიდ განყოფილებაში ბაკალავრიატის მასწავლებლის ასისტენტად. სხვადასხვა ინსტრუქტორების გამო განსხვავებების აღმოსაფხვრელად, აქ წარმოდგენილი ყველა მონაცემი არის 2004 წლის გაზაფხულის სემესტრის შედარება 2003 წლის შემოდგომის ტრადიციულ განყოფილებასთან, ორივეს ასწავლიდა J.C.S.

სილაბუსი და სასწავლო მასალა

გაიგე და გამოიყენე ინფორმაცია, რომელიც საფუძვლად ითვლება მოლეკულური და უჯრედული ბიოლოგების პრაქტიკოსით.

აღწერეთ, როგორ გავლენას ახდენს უჯრედული და მოლეკულური ბიოლოგიის პრაქტიკა ფართო საზოგადოებაზე.

აღიარეთ, რომ მეცნიერებას აქვს კულტურა, რომელიც გავლენას ახდენს მის პრაქტიკაზე.

ჩაერთეთ იმ იდეით, რომ თავად მეცნიერების კვლევები ისეთივე მეცნიერების ნაწილია, როგორც მონაცემთა შეგროვება. თქვენ არ გჭირდებათ საბოლოოდ დაეთანხმოთ ამ კონცეფციას, მაგრამ თქვენ უნდა შეძლოთ თქვენი პოზიციის მკაცრად დაცვა.

ჩათვალეთ თქვენი პოზიცია მეცნიერების საზოგადოებაში, სადაც ხართ და სადაც გსურთ იყოთ.

როგორც სურათი 1-ზეა ნაჩვენები, კურსში გაშუქებული სამეცნიერო შინაარსი იყო ძირითადი და სტანდარტული. კურსი დაიწყო უჯრედული ბიოლოგიის შესავალით, მათ შორის ყველაზე პოპულარული ხელსაწყოებისა და სამოდელო ორგანიზმების ჩათვლით. შემდეგ მიმოხილული იქნა ნუკლეინის მჟავების და ცილების ფუნდამენტური ბიოქიმია, რასაც მოჰყვა რამდენიმე კლასი, რომელიც მიეძღვნა ცენტრალურ დოგმას (დნმ → რნმ → ცილა). მეორე კვარტალში ყურადღება გამახვილდა მოლეკულურ ბიოლოგიაზე, აქცენტი ტექნიკებზე და ახალი ტექნოლოგიების დანერგვის შედეგად მიღებულ აღმოჩენებზე. მესამე კვარტალი მიეძღვნა უჯრედული ბიოლოგიის კლასიკურ თემებს, სადაც აქცენტი გაკეთდა სხვადასხვა უჯრედული ნაწილებისა და ორგანელების ფუნქციაზე. კურსის ბოლო განყოფილებაში მიმოხილვის სტატია სახელწოდებით „კიბოს ნიშნები“ (Hanahan and Weinberg, 2000) გამოყენებული იქნა როგორც კონცეპტუალური ჩარჩო უჯრედების სიგნალიზაციის, უჯრედული ციკლის, უჯრედების სიკვდილისა და კიბოს თემებისთვის. J.C.S. რამდენჯერმე გამოიყენა ეს მასალა BIOL 2104-ისთვის ამ კლასის სწავლებამდე. შედარებისთვის, კურსის თემები, რომლებიც დაფარულია კურსის უფრო ტრადიციული 2003 წლის შემოდგომის სექციაში, წარმოდგენილია დამატებით მასალა 1-ში.

სურათი 1. კლასების თემები, საკითხავი და გამორჩეული დისკუსიები BIOL 2104-ის 2004 წლის გაზაფხულის განყოფილებისთვის.

ამ კურსის უფრო ახალი ასპექტი იყო სოციალური კვლევების შინაარსი, რომელიც იყო შერწყმული და შეძლებისდაგვარად ინტეგრირებული სტანდარტულ სამეცნიერო მასალასთან. სოციალური შინაარსის დანერგვის პირველადი მექანიზმები იყო დაგეგმილი საკლასო დისკუსიები (მამატური ტექსტი ნახატ 1-ში) და როგორც კლასში, ისე კლასგარეშე წერითი დავალებები. 2003 წლის გაზაფხულის ექსპერიმენტულ განყოფილებაში, რომელსაც ასწავლიდა მ. საკითხავი სია ჩანს დამატებითი მასალა 2. J.C.S. არ გამოიყენა ეს წაკითხვები, მაგრამ ამას გააკეთებდა, როგორც გაუმჯობესება მომავალი კლასებისთვის. ამის ნაცვლად, მან უზრუნველყო კონტექსტი და სწავლება წერითი დავალებისთვის, როგორც საკლასო დისკუსიების ნაწილი.

საკლასო დისკუსიები

საკლასო დისკუსიის მიზანი იყო მოლეკულური უჯრედული ბიოლოგიის საყოველთაოდ მიღებული თემის ან კონცეფციის დანერგვა და შემდეგ მოსწავლეების წახალისება, დაესვათ კითხვა, გამოეკვლიათ და დაუსვით ეს თემა ისეთი კითხვების დასმით, როგორიცაა: „რატომ ჩაითვალა თემა მნიშვნელოვანად? როგორ იყო წარმოდგენილი სახელმძღვანელოში ან სხვა სამეცნიერო ლიტერატურაში და რატომ?“ "ვინ იყო პასუხისმგებელი კონკრეტულ აღმოჩენაზე?" და „იყო თუ არა ალტერნატიული მიდგომები, დასკვნები და ა.შ.?“ მიზანი იყო სტუდენტებისთვის გაეგებინებინა, რომ მეცნიერული ცოდნა აგებულია, მეცნიერისა და კულტურების (როგორც შინაგანი, ისე გარეგანი) პროდუქტი, რომელშიც ის ახორციელებს დისციპლინას (Fleck, 1935 Kuhn, 1962 Keller, 1985 Shapin and Schaffer, 1985 წ. ლატური, 1987 ჰაბარდი, 1990 ბარნსი და სხვ., 1996 შაპინი, 1996). როგორც წესი, დისკუსიები იმართებოდა მცირე ჯგუფებში, რომლებიც შემდეგ ხელახლა შეიკრიბნენ კლასად, თითოეულ ჯგუფთან ერთად მოწვეულნი იყვნენ დისკუსიიდან მნიშვნელოვანი მომენტების მოხსენებისთვის.

პირველი კლასში დისკუსია ეხებოდა ორგანიზმების ქვეჯგუფის ფართოდ მიღებულ გამოყენებას მოლეკულურ უჯრედულ ბიოლოგიაში. მოსწავლეები პირველად გაეცნენ მოდელის ორგანიზმის კონცეფციას და მიეცათ ინფორმაცია ამ ორგანიზმებიდან ყველაზე პოპულარულთან დაკავშირებით (მაგ. ეშერიხია კოლი, Saccharomyces cerevisiae, დროზოფილა მელანოგასტერი, Arabadopsis thaliana, და მუსკულუსი) და მათი სავარაუდო უპირატესობები (მაგ., გენომის მცირე ზომა, შენარჩუნების დაბალი ღირებულება და თაობის მოკლე დრო). ამის შემდეგ ეჭვქვეშ დადგა ფედერალურად დაფინანსებული კვლევების უმრავლესობის ფოკუსირების კონცეფცია მცირე რაოდენობის სახეობებზე. წარადგინეს ბოლკერისა და რაფის (1997) კომენტარი, რომელიც სტუდენტებს აჩენს მოსაზრებას, რომ მოდელი ორგანიზმები ხშირად უფრო მოსახერხებელია, ვიდრე წარმომადგენლობითი და ექსკლუზიურად მცირე რაოდენობის სახეობებზე ფოკუსირება არა მხოლოდ აფერხებს მეცნიერულ პროგრესს, არამედ შეიძლება გააგრძელოს სიცრუე. შემდეგ სტუდენტებს სთხოვეს კომენტარი გაეკეთებინათ კიბოს ეროვნული ინსტიტუტის (Bethesda, MD) გადაწყვეტილებაზე, დაეფინანსებინათ შვიდი არაძუძუმწოვრების მოდელი ორგანიზმების ქვეჯგუფი კიბოსთან დაკავშირებული კვლევისთვის. მათი რეაქცია მერყეობდა იმ პერსპექტივიდან, რომ კიბოს კვლევა მხოლოდ ძუძუმწოვართა კვლევებისთვის უნდა დაფინანსდეს იმ მოსაზრებით, რომ შვიდი ძალიან ცოტა მოდელია რაიმე მნიშვნელოვანი სამეცნიერო პროგრესისთვის.

როგორც საკლასო დისკუსიის კიდევ ერთი მაგალითი, ორი ტრადიციული ლექციის შემდეგ, რომელშიც ნუკლეინის მჟავებისა და ცილების ფუნდამენტური ბიოქიმია იყო წარმოდგენილი, როგორც უჯრედული ბიოლოგიის საფუძველი, მცირე ჯგუფებში მომუშავე სტუდენტებს სთხოვეს მოეწყოთ ტერმინები „ბიოლოგია“, „ქიმია“. "მათემატიკა" და "ფიზიკა" დიაგრამატიკურად, თუმცა მათ მიზანშეწონილად მიიჩნიეს. ზოგიერთმა ჯგუფმა შეადგინა ტრადიციული იერარქია, სადაც ბიოლოგია ქიმიის ქვემოთ დგას, რაც უფრო დაბალია ვიდრე ფიზიკა, რომელიც მათემატიკაშია, ხოლო სხვებს უფრო ახალი წარმოდგენები ჰქონდათ. ერთმა ჯგუფმა შეადგინა ვენის სტილის დიაგრამა, რომელიც წააგავს ყვავილს, სადაც თითოეული ველი სხვებს გადაფარავს, არცერთი არ არის უფრო დიდი ან დომინირებს მეორეზე, მაგრამ ყველა ერთმანეთთან არის დაკავშირებული. ამ სავარჯიშოს საშუალებით, სტუდენტები, როგორც ჩანს, აფასებდნენ, რომ არსებობდა სამეცნიერო დისციპლინების სტანდარტული, თუმცა იშვიათად მკაფიო ორგანიზაცია, მაგრამ ეს მიდგომა სულაც არ იყო ერთადერთი გზა ან საუკეთესო საშუალება დიდი რაოდენობით სამეცნიერო ინფორმაციის გასათვალისწინებლად.

ერთ-ერთი თემა, რომელიც მოიცავდა რამდენიმე დისკუსიას, იყო მეცნიერების განხილვა, რომლებიც ქმნიან მონაცემებს. პირველი კონტექსტი, რომელშიც ეს თემა გაჩნდა, იყო კლასის შეხვედრა სახელწოდებით „ადრეული მოლეკულური ბიოლოგები“, სადაც განიხილებოდა მრავალი ცნობილი მეცნიერის ნამუშევარი, რომელიც მიგვიყვანს ცენტრალური დოგმას ამჟამად მიღებულ შეხედულებამდე, განიხილებოდა მუსიკალური არჩევანის თანხლებით. პერიოდი, რომელშიც აღმოჩენები გაკეთდა. იგნორირებული არ იყო ის ფაქტი, რომ მოლეკულურ ბიოლოგიაში ამ მიღწევებს თითქმის ყველა მეცნიერი მიეკუთვნებოდა თეთრკანიანი, მამაკაცი და, პირველ რიგში, ევროპელი. ჯეიმს უოტსონი ციტირებული იყო მისი მემუარებიდან, "ორმაგი სპირალი" (Watson, 1980), რათა გამოეჩინა გაბატონებული დამოკიდებულებები ისეთი ქალი მეცნიერების მიმართ, როგორიცაა როზალინდ ფრანკლინი. სტუდენტებს სთხოვეს გამოეთქვათ თავიანთი მოსაზრებები ამ საკითხთან დაკავშირებით წერილობით დავალება 4-ში (სურათი 2), და ბევრმა მათგანმა ასევე კვლავ წამოჭრა ეს საკითხი გამოცდა 2-ზე (დამატებითი მასალა 3), როდესაც ჰკითხეს, იმსახურებდნენ თუ არა უოტსონი, კრიკი და უილკინსი. ნობელის პრემია.

სურათი 2. წერითი/სახატავი დავალებები BIOL 2104 2004 წლის გაზაფხულის განყოფილებისთვის.

მეცნიერთა დისკუსიამ კულმინაციას მიაღწია მას შემდეგ, რაც სტუდენტებმა დაასრულეს წერითი დავალება 7, რომელშიც ისინი დაუკავშირდნენ მეცნიერს, რომელსაც არ იცნობდნენ ელექტრონული ფოსტით და დაუსვეს ამ მეცნიერს შეკითხვა. ჩვენ გავუზიარეთ ეს გამოცდილება კლასში, რომელიც მერყეობდა ძალიან დამაკმაყოფილებელისაგან, სადაც სტუდენტები გრძნობდნენ მაამებს, რომ ერთმა ან მეტმა მეცნიერმა უპასუხა, იმედგაცრუებამდე, როდესაც სტუდენტებმა არ მიიღეს პასუხი, მიუხედავად მრავალი კონტაქტის მცდელობისა. კითხვები, რომლებიც სტუდენტებმა დაუსვეს, მერყეობდა ძალიან პირადიდან („რა არის თქვენი საყვარელი ხუმრობა?“ რა არის თქვენი ჰობი?“) კონკრეტულ სამეცნიერო კითხვებამდე. რამდენიმე სტუდენტმა გამოიყენა შესაძლებლობა დაემყარებინა კონტაქტები ან დასვა შეკითხვები სამაგისტრო სკოლის საკუთარ გეგმებთან დაკავშირებით. რამდენიმე სტუდენტმა ქალმა მეცნიერებმა ჰკითხეს თავიანთი მოსაზრებები როზალინდ ფრანკლინისთვის მინიჭებული კრედიტის ნაკლებობის შესახებ, სხვებმა კი სპეციალურად მისწერეს ქალ მეცნიერებს, რომ ეკითხათ, როგორია იყო ქალი უჯრედულ და მოლეკულურ ბიოლოგიაში. მიუხედავად იმისა, რომ კითხვები და პასუხები საოცრად განსხვავდებოდა, სავარჯიშო, როგორც მთლიანობაში, წარმატებული ჩანდა სტუდენტების შეხსენებაში, რომ მეცნიერებას ასრულებენ მეცნიერები, რომლებიც თავიანთ პიროვნებას, კულტურას და ა.შ. მეცნიერება, რომელშიც ისინი მუშაობენ.

წერითი დავალებები

სემესტრის განმავლობაში სტუდენტებს მიეცათ რამდენიმე წერითი და ხატვის დავალება (ზოგი კლასში, ზოგს გაკვეთილის გარეთ) (სურათი 2). დავალებები სტუდენტებს აძლევდა უფრო ფორმალურ მექანიზმს მეცნიერებაში სოციალურ საკითხებში ჩართვისთვის და საშუალება, რომ შეგვეფასებინა ამ კურსის გავლენა სტუდენტების მეცნიერების აღქმაზე. მოსწავლის პასუხების მაგალითები და ასევე ამ ორი დავალების თვისებრივი ანალიზი წარმოდგენილია ქვემოთ შედეგები/შეფასება.

წერითი დავალებები შეფასდა 0-10 ქულიანი სკალით და ყოველი მოსწავლის საუკეთესო 10 ქულა ერთმანეთში დაემატა (100 ქულამდე). ეს დავალებები შეადგენდა 20% კურსის საბოლოო შეფასებას. ზოგადად, სტუდენტებმა მიიღეს ძალიან მაღალი ქულები ამ სამუშაოსთვის (საშუალოდ 96.5% დიაპაზონი 56-100%), რადგან ისინი შეფასდნენ პასუხის გააზრებულობისა და პოზიციების მხარდაჭერის მიხედვით, ვიდრე აღქმული სწორი პასუხის მიხედვით. გარდა ამისა, რამდენიმე დავალება იყო ექსპერიმენტული ხასიათის (მაგ., მონაწილეობა კლასში დისკუსიაში ღეროვანი უჯრედების ეთიკის შესახებ) და მოსწავლეებმა მიიღეს ავტომატური 10 ქულა მონაწილეობის ნებისმიერ დონეზე. Although these assignments probably “inflated” the grades for the course, the instructor considered this just reward for students' participation in this experimental section and for the amount of writing required. Typically, 2000-level classes in biology at Virginia Tech require little or no writing, and although students are required to complete two or more “writing-intensive” courses, this course did not qualify as one of the two courses.

Examinations

In addition to the writing assignments described above, evaluation of student learning was based on four examinations. The first three were given in class, and the fourth exam was a take-home essay exam. The material covered in the examinations was both factual/typical and opinion/social in nature as illustrated by the first examination, shown in Figure 3. The other three exams are provided in Supplemental Material 3.

Figure 3. BIOL 2104, exam 1. The examination was given in class during the regular 75-min period.

The short-answer format of the exam was selected based on several considerations. To be consistent with the goals and philosophy of this course, students needed to be able to put their own “voices” into the responses, and the examination questions needed to allow for elements of subjectivity. Thus, a multiple-choice format was inappropriate, although multiple choice is the testing format to which students at Virginia Tech are most accustomed during their introductory and 2000-level biology courses. Longer essay questions were not used (except for the take-home exam 4 Supplemental Material 3) based on practical considerations of grading time. Although this class was relatively small (<50 students), the instructor and teaching assistant were already committed to extensive grading time for the writing assignments and for the extra-credit options (see below). Therefore, short-answer questions seemed to provide the most acceptable balance between personal response and efficiency in grading.

Furthermore, the short-answer style permitted the integration of both fact- and opinion-based questions (e.g., Figure 3, question 9) and enabled us to assess whether students exposed to this type of course were learning standard scientific information (e.g., primary, secondary, tertiary, and quaternary structure of a protein) and whether they could apply an opinion (Is knowledge of a protein's structure necessary to study its function?) to that information. For each exam question, the instructor developed a grading rubric with specific point values for each component of the question. An example of the range of answers and points awarded for a typical question is provided in Supplemental Material 4.

Extra Credit

After each of the first three examinations, students were allowed to participate in an extensive extra-credit project, in which they performed a self-analysis of their approach to the examination and a rigorous assessment of every point lost on the exam. This extra-credit assignment was not a new feature of this course but rather had been developed several years earlier by the instructor (J.C.S.) in collaboration with Patricia Bevan of the Biological Sciences Initiative at Virginia Tech. The assignment, detailed in Supplemental Material 5, is consistent with the philosophy that science (and science education) is socially constructed and that by encouraging students to deconstruct the material, in this case, the examination itself, they will achieve a higher and more personal level of learning. For this experimental section of BIOL 2104, all extra-credit assignments were read and graded by the teaching assistant (D.E.W.) who met with all students in small groups after the first extra-credit project was graded to discuss what they had learned from the exercise. Participation in the extra-credit assignments was high, with 41 (89%) of the students completing the extra credit for at least one exam and 45% completing extra credit for all three exams. Details of class participation are provided in Supplemental Material 5.


NEURAL CELL DEATH AND DEVELOPMENT

As in most other parts of the developing body (Baehrecke 2002), cell death constitutes an important mechanism contributing to the patterning of the brain (Fig. 4). Two main types of cell death can be distinguished, based on their timing and cellular targets: a late cell death that strikes mainly postmitotic neurons, and an early cell death of dividing progenitors or immature neurons, independently of synaptogenesis (Buss et al. 2006).

Distinct patterns and mechanisms of neural cell death. () According to the neurotrophic model, cell death regulates the final number of neurons that compete for limiting amounts of neurotrophic factors to innervate their target, thereby enabling a precise qualitative and quantitative matching between synaptic partners. () A model to link axon guidance and neuronal death. Netrin ligands (in blue) control the guidance and promote the survival of several populations of neurons within the spinal cord and hindbrain. In absence of Netrin, responsive neurons are misguided and display decreased survival. In absence of Netrin receptors, neurons are misguided in a similar way but show normal or sometimes enhanced survival. Overall, these observations are consistent with a dual role of Netrins and their receptors on neuronal guidance and apoptosis. (C) During normal brain development, a subset of neural progenitors undergo apoptosis, which negatively regulates their number. Following ephrin/Eph loss of function, this wave of apoptosis is decreased, which causes an expansion of the progenitor pool, and thereby forebrain overgrowth. Following ephrin/Eph gain of function, the rate of apoptosis of neural progenitors is increased, resulting in a reduction of the pool, and thereby a decrease in forebrain size.

These waves of cell death have been described throughout the developing brain, but their relative importance differs from region to region. The underlying molecular and cellular mechanisms also seem to differ, in particular the extrinsic cues and receptors involved, but it is generally admitted that all eventually converge to intracellular pathways controlling classical apoptotic cascades (Bredesen et al. 2006 Yuan et al. 2003). Interestingly, most axon guidance cues, including netrins, semaphorins, and ephrins, have now been shown to be involved in the control of neural cell death, either at the level of neurons or neural progenitors, aside of their prominent role in neurite patterning.

Neuronal Death and the Neurotrophic Model

Neuronal death is by far the best described and understood to date, and will not be described in full detail here, given the number of excellent reviews dealing with this classical chapter of developmental neurobiology (Buss et al. 2006 Buss and Oppenheim 2004 Cowan 2001). It has been known for decades that a large proportion of neurons undergo PCD at the time of synaptogenesis. Seminal experiments demonstrating the physiological relevance of these regressing events mainly focused on the development of the peripheral nervous system and of neuromuscular projections. Key findings included the observation that peripheral targets can influence the final number of neurons, essentially through the regulation of neuronal survival. This led to the identification of the first neurotrophic cue, nerve growth factor (NGF), followed by the other neurotrophic factors such as BDNF, GDNF, and NT3-4, which have all been implicated in neuronal survival (Cowan 2001 Huang and Reichardt 2001), and some of which may also act as axon guidance cues (Lumsden and Davies 1986 O’Connor and Tessier-Lavigne 1999 Singh et al. 2008).

According to the neurotrophic hypothesis, neurons compete for access to neurotrophic factors that are released in limiting amounts by their peripheral targets. In this case, the apoptotic cascades are triggered by withdrawal of the factor, which when present control positively pro-survival cascades through their receptors, mainly through a complex retrograde signaling process (Huang and Reichardt 2001 Zweifel et al. 2005).

Neurotrophin withdrawal is thus a major trigger of apoptotic pathways, but pro-apoptotic effects of Neurotrophins or their precursors have also been described, in particular through the p75 receptor (Frade et al. 1996 Raoul et al. 2000). These proapoptotic effects have been proposed to increase the efficacy of the competition process, by enabling to decrease actively the survival or axon outgrowth of neuronal competitors (Deppmann et al. 2008).

The prominent role of neurotrophins in regulating neuronal survival in the peripheral and neuromuscular systems has been widely established in vivo, in particular through the studies centered on mouse mutants for neurotrophins and their receptors, but such analyses have yielded surprisingly few phenotypes related to cell death within the CNS (Buss et al. 2006 Oppenheim et al. 2001). Although these findings have been mainly interpreted as evidence for a high degree of redundancy of neurotrophic genes in the CNS, they also leave open the possibility that additional cues could be involved in specific patterns of neuronal death in these contexts, including axon guidance factors.

Although neuronal death is classically thought to contribute to the qualitative and quantitative matching of presynaptic and postsynaptic partners, in some cases it appears that neurons undergo PCD even before reaching their target (Buss et al. 2006 de la Rosa and de Pablo 2000). This suggests that neuronal death could contribute to other regulatory processes, such as the correction of errors of axonal navigation, which could be particularly relevant in the case of cell death events mediated by some axon guidance molecules. Neuronal death has also been proposed to play a role in sculpting the fine pattern of connectivity in some structures, such as the mapping of retinal projections to the superior colliculus (Buss et al. 2006 Cellerino et al. 2000 O’Leary et al. 1986), although from the data available so far, it seems that pruning of axon branches is by far the most prominent regressive event involved in topgraphic mapping.

Early Neural Cell Death and Brain Morphogenesis

The physiological meaning of apoptosis in neural progenitors has remained largely unexplored for a long time (Bello et al. 2003 Kuan et al. 2000). The presence of significant levels of apoptosis in the proliferative zone of the mouse brain (Blaschke et al. 1996), since then confirmed in other species including the human (Rakic and Zecevic 2000 Yeo and Gautier 2003), suggested that cell death is not a phenomenon exclusively restricted to postmitotic neurons, but this did not necessarily imply that apoptosis regulation was linked to brain patterning. A first important hint came from the analysis of caspase gene invalidation in mutant mice: The mutants invalidated for pro-apoptotic genes Caspase-3, Caspase-9, and Apaf1 present a similar phenotype, consisting in a drastic reduction in early cerebral apoptosis and an inappropriate amplification of specific populations of neural progenitors, resulting in brain exencephaly and neural overgrowth (Cecconi et al. 1998 Hakem et al. 1998 Kuida et al. 1996 Kuida et al. 1998 Pompeiano et al. 2000). Most strikingly, the overgrowth is mostly confined to the forebrain, including sometimes an increase in the thickness and surface of the cerebral cortex.

These data support the idea that even modest modifications in the size of the progenitor pool during its exponential growth can directly affect the final size and shape of the mammalian forebrain, which can occur by influencing the proliferation, but also the survival of neural progenitors (Caviness Jr. et al. 1995 Rakic 2005).

Region-specific apoptosis of neural progenitors was also proposed recently as a patterning mechanism to restrict in time and space the size of distinct neural stem cell lineages in დროზოფილა CNS, thereby playing an essential role in the spatial patterning of the nervous system (Bello et al. 2003).

In vertebrates, the contribution of apoptotic processes to neural regional patterning remains unclear at this stage, although the patterns of neural progenitor apoptosis are strikingly dynamic in time and space (Blaschke et al. 1996 Rakic and Zecevic 2000 Yeo and Gautier 2003). On the other hand, several extracellular cues have been recently identified that control early neural cell death. Intriguingly, most of them turn out to be axon guidance factors as well.


შესავალი

The hepatocyte growth factor (HGF)/scatter factor/Met receptor tyrosine kinase (RTK) is a cell surface receptor that was first identified as an oncoprotein, Tpr-Met (Cooper და სხვ., 1984). This oncoprotein is the product of a chromosomal rearrangement fusing a leucine zipper dimerization domain to the Met cytoplasmic domain, resulting in a constitutively active cytosolic kinase in the absence of ligand (Park და სხვ., 1986 Rodrigues and Park, 1993). Deregulation of Met receptor signaling has been implicated in a variety of human malignancies. For example, the Met receptor is overexpressed in many different types of human tumors, including breast, gastric, thyroid, and colorectal carcinomas and sarcomas, and point mutations have been identified in the Met receptor in both hereditary and sporadic papillary renal carcinomas as well as lung cancers (Jeffers და სხვ., 1997 Birchmeier და სხვ., 2003 Ma და სხვ., 2003 Zhang and Vande Woude, 2003).

From studies in mice, the Met receptor has been implicated in several facets of embryogenesis, such as the growth and survival of epithelial cells, migration of myogenic and neuronal precursor cells, development of the kidney and mammary glands as well as liver and placenta formation (Bladt და სხვ., 1995 Schmidt და სხვ., 1995 Uehara და სხვ., 1995). Moreover, the activation of the Met receptor promotes angiogenesis and wound healing in mice (Toyoda და სხვ., 2001 Horiguchi და სხვ., 2002), and evidence indicates a role in primitive hematopoiesis during early ქსენოპუსი development (Koibuchi და სხვ., 2004). In cell culture systems, the HGF/Met receptor has been shown to affect many cellular functions, including mitogenesis of hepatocytes and myoblasts, cell scattering, invasion and branching tubulogenesis of epithelial cells as well as chemoattraction of motor neurons (for reviews, see Birchmeier და სხვ., 2003 Zhang and Vande Woude, 2003).

The recruitment of signaling proteins and the biological activities of both the Met receptor and Tpr-Met oncoprotein are dependent on only two phosphotyrosine residues outside of the catalytic domain (pTyr-482 and -489 in Tpr-Met and pTyr-1349 and -1356 in Met). When phosphorylated, Tyr-1356 (Tyr-489 in Tpr-Met) provides a direct binding site for the Grb2 and Shc proteins (Fixman და სხვ., 1996 Ponzetto და სხვ., 1996). In turn, Grb2 acts to indirectly recruit the c-Cbl ubiquitin ligase and docking protein Gab1 (Weidner და სხვ., 1996 Bardelli და სხვ., 1997 Fixman და სხვ., 1997 Nguyen და სხვ., 1997). In addition, the docking protein Gab1 associates directly with the Met receptor through an interaction between the Met-binding motif (MBM) within Gab1 (13-amino acid proline-rich motif), and pTyr-1349 along with upstream residues of the Met receptor (pTyr-482 in Tpr-Met) (Lock და სხვ., 2003). Importantly, regardless of its mode of association, Gab1 becomes phosphorylated on multiple tyrosine residues upon its recruitment by the Met receptor, providing binding sites for multiple signaling proteins, including the p85 subunit of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), phospholipase Cγ (PLCγ), the Crk adaptor protein, and the tyrosine phosphatase SHP-2 (Garcia-Guzman და სხვ., 1999 Maroun და სხვ., 1999a Gual და სხვ., 2000 Lamorte და სხვ., 2000).

Structure–function studies have revealed key roles for Grb2, Shc, and Gab1 adaptor proteins downstream of the Met receptor in various biological events, which, if not strictly coordinated, may contribute to the development and progression of cancers. Recruitment of the Grb2 or Shc adaptor proteins is required and sufficient for oncogenic transformation, anchorage-independent growth, and experimental metastasis by the Met receptor oncoprotein (Fixman და სხვ., 1996 Ponzetto და სხვ., 1996 Bardelli და სხვ., 1999 Saucier და სხვ., 2002). Shc also plays a critical role in promoting the production of vascular endothelial growth factor and early onset of tumor angiogenesis by the Met receptor (Saucier და სხვ., 2004). Alternatively, the recruitment of the docking protein Gab1 is essential for Met receptor-mediated invasive branching morphogenesis of epithelial cells (Weidner და სხვ., 1996 Nguyen და სხვ., 1997 Maroun და სხვ., 1999a).

Although the mitogenic effect of HGF is well documented (Birchmeier და სხვ., 2003), little is known about the signals involved in the induction of cell cycle progression by the HGF/Met receptor. The ქსენოპუსი system is an extremely tractable system for dissecting the signaling networks implicated in cell cycle progression induced by proto-oncogenes and kinases. Significantly, many of the signaling networks implicated in cell cycle progression of ქსენოპუსი oocytes have been shown to be shared with those of somatic cell division (Ferrell, 1999 Nebreda and Ferby, 2000). In a recent study, we exploited this system to define which one of the many signaling pathways engaged downstream of the oncogenic Met receptor Tpr-Met is involved in cell cycle progression (Mood და სხვ., 2006). Similar to the signal requirements for Met receptor-mediated cell transformation, we have shown that cell cycle progression as well as activation of MAPK and c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) required both the kinase activity of Tpr-Met and an intact multidocking protein site (phosphotyrosine residues Y482 and Y489). Moreover, using Met oncoproteins engineered to recruit a signaling protein of choice (Saucier და სხვ., 2002), we have established that although the recruitment of Grb2 or Shc is sufficient to induce cell cycle progression and the activation of MAPK and JNK, their recruitment to the oncogenic Met receptor is not essential for cell cycle progression (Mood და სხვ., 2006). This study suggested that, in addition to Grb2 and Shc adaptor proteins, another proximal-binding protein of the Met receptor contributes to its ability to induce cell cycle progression and cell transformation.

In the present study, we establish for the first time a critical contribution of the Gab1-docking protein downstream of the oncogenic Met receptor Tpr-Met in cell cycle progression of ქსენოპუსი oocytes as well as proliferation and cellular transformation of fibroblast cells. By performing structure–function studies, we show that the direct interaction of Gab1 protein with the Tpr-Met oncoprotein is necessary and sufficient to promote cell cycle progression, and associated MAPK and JNK activation, whereas the recruitment of Gab1 via Grb2 is dispensable. Furthermore, we show that the Gab1 pleckstrin homology (PH) domain and the PI3K and SHP-2 binding sites in Gab1 are crucial for cell cycle progression mediated by Tpr-Met.


წვდომის პარამეტრები

მიიღეთ სრული წვდომა ჟურნალზე 1 წლის განმავლობაში

ყველა ფასი არის წმინდა ფასები.
დღგ მოგვიანებით დაემატება ანგარიშსწორებისას.
გადასახადის გაანგარიშება საბოლოო იქნება გადახდისას.

მიიღეთ დროში შეზღუდული ან სრული სტატიის წვდომა ReadCube-ზე.

ყველა ფასი არის წმინდა ფასები.


მეთოდები

საფუარი Saccharomyces cerevisiae wild type (BY 4741) was used as a model organism. They were cultivated for approximately 24 h in an orbital shaking incubator (Yihder Co., Ltd LM-420D) at (30,^circ hbox ) , 180 rpm, in standard YPD medium (1 % yeast extract, 2 % peptone, 2 % D-glucose). Then, they were centrifuged (Heraeus Biofuge Stratos) 2 times and the YPD medium was changed to Milli-Q (< ext >_2 hbox ) . Measurement of yeast concentration was performed with a cell counter (Beckman Coulter, Z2 series) in the range (3 , hbox <->, 9, upmu hbox ) . საფუარი Saccharomyces cerevisiae has a diameter between 1 and (10, hbox ) . Their mean cell size depends on various factors such as growth temperature 40 , strain, and age 41 .

Biological autoluminescence measurement setup

Induced BAL

Induced emission was measured from a 3 mL of yeast sample in Milli-Q water in a Petri dish (Thermo Scientific, diameter 35 mm). The concentration of yeast was between (10^7) and (10^9 , hbox ,, >^<-1>) . The amount of ROS in the sample was regulated by the Fenton reaction

After preparation of a yeast sample at a required cell concentration, (50, upmu hbox ) of iron(II) sulfate was added to the sample so that the final (< ext >_4) concentrations in the sample was 50 nM, (5, upmu hbox ) , or 0.5 mM. Then the sample was placed into a special black box with a photomultiplier module H7360-01 (Hamamatsu Photonics K.K., spectral range 300–650 nm) where the measurements of BAL were performed. After approximately 1 min of BAL measurement, (50, upmu hbox ) of (< ext >_2 < ext >_2) (final concentrations: (25, upmu hbox ) , (250, upmu hbox ) , 2.5 mM, and 25 mM) was injected into the yeast sample with (< ext >_4) . The whole BAL measurement took approximately 10 minutes. A scheme of the experimental setup is shown in Fig. 5a.

A scheme of the experimental setup for the measurements of BAL during () induced oxidation in a Petri dish in a black box and () spontaneous oxidation in a bioreactor. The bioreactor with the photodetector chamber was light-isolated by a black cloth construction.

Spontaneous BAL

Spontaneous emission was measured in a bioreactor Biostat Aplus (Sartorius Stedim Biotech) in a dark room. The bioreactor with the photodetector chamber was light-isolated by a black cloth construction to further minimize any background light. Yeasts at an initial concentration of (5 cdot 10^5 , hbox ,, >^<-1>) were stirred (180 rpm), bubbled with air ( ( 1 , hbox ,, >^<-1>) ) and maintained at a temperature of (30,^circ hbox ) during their cultivation in YPD medium. (75, hbox ) of antifoaming agent (polypropylene glycol) was added to the 750 mL sample. The measurement time was between 15 and 20 h. The photomultiplier module (H7360-01, Hamamatsu Photonics K.K., spectral range 300–650 nm) was used for BAL measurements. A scheme of the experimental setup is shown in Fig. 5b. Measurement of the pH, (< ext >_2) , and temperature was performed by original probes included in the bioreactor.

The initial yeast concentration is lower compared with measurements of BAL intensity after short-time oxidation of yeast cells in water induced by the Fenton reaction. If we want to measure spontaneous BAL of yeast and their growth curve simultaneously, it is better to start at a lower yeast concentration to have a nicer shape of the curve. (The higher initial amount of yeast quickly depletes the glucose , the exponential phase is really short, and the difference between the initial and the final cell concentration is not so distinct.) Also, the measurement of yeast concentration is easier and more precise (without dilution of a sample) in the used concentration range. (Upper limit of a sample concentration is approximately (3 cdot 10^8 , hbox ,, >^<-1>) for the cell counter.)

The experiment for observing the influence of glucose re-supply into the sample on BAL intensity was performed in an Erlenmeyer flask in a black box similar to the measurements of induced BAL. The measurement setup is described in 42 . Cells were cultivated in an orbital shaking incubator (YPD, (30,^circ hbox ) , 180 rpm) for 16 h. The cell concentration in the sample was established with a Bürker chamber. The required amount of yeast cells was transported to 200 mL of cold YPD medium so that the initial yeast concentration was (5 cdot 10^5 , hbox ,, >^<-1>) . The sample was bubbled with filtered room air. After 16 h of spontaneous BAL measurement, 11 mL 40% glucose was added into the sample.

Glucose concentration measurement

The glucose concentration was established with a commercial glucose kit (Glu 1000, Erba Lachema). Optical density was measured at 500 nm and subsequently recalculated to a real glucose concentration in mM (using calibration solutions at known glucose concentration).

Growth curve

Growth curves were measured in a Spark microplate reader (Tecan). After approximately 24-h cultivation of yeast in an orbital shaking incubator ( (30,^circ hbox ) , 180 rpm) in standard YPD medium, the samples ware centrifuged (2 ( imes) ) and the YPD medium was changed to Milli-Q (< ext >_2 hbox ) . Then, oxidation of the yeast sample (concentration of (10^8 , hbox ,, >^<-1>) ) was performed with the Fenton reaction ( (0.5, hbox , < ext >_4) , 2.5 mM/25 mM/250 mM (< ext >_2 < ext >_2) ) for 10 min. The samples were in the shaker ( (30,^circ hbox ) , 180 rpm) during the oxidation. Then, the samples were centrifuged and the water was changed to fresh YPD medium. After dilution of each sample 100 times, (200, hbox ) of each sample was put in a well of a 96-well plate (Thermo Scientific Nunc, transparent, non-treated, flat bottom, type no. 269620) and covered with a lid. 5–7 replicates of each sample were prepared on the same plate. The optical density at 600 nm was measured every 10 min for 24 h. The samples were shaken for the rest of the time. The temperature during measurement of the growth curves was maintained at (30,^circ hbox ) .

Microscopic imaging

Microscopic imaging before and after the oxidation by the Fenton reaction was performed with the microscope BX50 (Olympus) with the camera Moticam 1080. Phase contrast and an objective magnification of 20 ( imes) was used.


Უყურე ვიდეოს: უჯრედი ირჩევს სიცოცხლეს 1 (აგვისტო 2022).