ინფორმაცია

რა საშუალებას აძლევს აზაციტიდინს ჩაერთოს როგორც დნმ-ში, ასევე რნმ-ში?

რა საშუალებას აძლევს აზაციტიდინს ჩაერთოს როგორც დნმ-ში, ასევე რნმ-ში?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

მე გავაკეთე მინი-პროექტი წამლის აზაციტიდინზე ჩემი ფარმაკოლოგიის გაკვეთილისთვის და გავიგე, რომ აზაციტიდინს აქვს უნარი ჩაერთოს როგორც დნმ-ში, ასევე რნმ-ში. მე ვფიქრობ, რომ ეს მართლაც უნიკალურია, რადგან მსგავსი პრეპარატი, დეციტაბინი, ექსკლუზიურად შედის დნმ-ში. არსებობს თუ არა აზაციტიდინის რაიმე სპეციფიკური ფიზიკური/სტრუქტურული მახასიათებელი, რომელიც საშუალებას აძლევს მას გავლენა მოახდინოს დნმ/რნმ-ის სტრუქტურასა და ფუნქციაზე? ნებისმიერი დახმარება ძალიან მადლიერი იქნება!


თუ გადახედავთ ვიკიპედიის გვერდის დასაწყისში, ნახავთ, რომ აზაციტიდინი არის ციტიდინის ანალოგი,Cდნმ-ის და რნმ-ის პოპულარობის ასო. დეციტაბინი არის დეოქსიდური წარმოებული და, შესაბამისად, მხოლოდ დეზოქსირიბონუკლეინის მჟავაში, ან დნმ-ში იქნება ჩართული.

შემდგომი კითხვისას, აზაციტიდინი სტრუქტურის მიხედვით არის რიბონუკლეოზიდის წარმოებული და უპირატესად შედის რნმ-ში. თუმცა, ის შეიძლება მეტაბოლიზდეს 5-აზა-2'-დეოქსიციტიდინ-ტრიფოსფატად და, შესაბამისად, შევიდეს დნმ-ში.


ქიმიური ბიოლოგია მოლეკულური სტრუქტურისა და მექანიზმის გზაჯვარედინზე

ბიოლოგიური ფუნქციის ქიმიური ხედვა არის სტრუქტურული ბიოლოგიის წმინდა გრაალი. მცირე მოლეკულები არის ცენტრალური მოთამაშეები, როგორც მაკრომოლეკულური სტრუქტურისა და ფუნქციის სამშენებლო ბლოკები, ეფექტორები და ზონდები.

ქიმიური ბიოლოგიის მიმართ ბოლოდროინდელი ინტერესის აფეთქება ასახავს ქიმიისა და ბიოლოგიის ინტერფეისის კვლევით მოხიბვლას, სადაც ქიმიური შეხედულებები ასახულია საინტერესო ბიოლოგიურ და ბიოსამედიცინო პრობლემებზე. თუმცა, სინამდვილეში, მცირე მოლეკულებს დიდი ხანია აქვთ მნიშვნელოვანი როლი ფუნდამენტურ ბიოლოგიურ კითხვებზე პასუხების გაშიფვრაში. მაგალითად, დნმ-ის მცირე მოლეკულური მოდიფიკატორების გამოყენებამ, მოგვიანებით კი დიდოქსი ნუკლეოზიდის ტრიფოსფატებმა, წარმოადგინეს პირველი შეხედულებები დნმ-ის თანმიმდევრობის შესახებ და განაპირობა ფლუორესცენტური ნუკლეოტიდის ანალოგების განვითარება, რამაც შესაძლებელი გახადა მთელი გენომის თანმიმდევრობა. ადრეულმა მცირე მოლეკულურმა ინდიკატორებმა უჯრედშიდა კალციუმისთვის განაპირობა კალციუმის კონცენტრაციის ცვლილებების აღმოჩენა, რაც ყველაფერზე მიუთითებს კვერცხუჯრედის განაყოფიერებიდან მეხსიერების ფორმირებამდე.


ტრანსკრიპტები

შესაძლოა, თანამედროვე რნმ-ის ბიოლოგიაში ყველაზე გამორჩეული აღმოჩენა არის ტრანსკრიპტომის მრავალფეროვნების გაცნობიერება. შემდეგი თაობის თანმიმდევრობის (NGS) საფუძველზე დაფუძნებულმა ტექნოლოგიებმა აჩვენა ტრანსკრიპტების მრავალი ახალი კლასის არსებობა და ცილის კოდირების ტრანსკრიპტების დიდი მრავალფეროვნება, როგორც იზოფორმების, ისე სინონიმური ვარიანტების თვალსაზრისით. ტრანსკრიპტომის მრავალფეროვნება და მისი ურთიერთქმედება ფენოტიპებთან ორივე ძირითადი მოხსენების მთავარი თემა იყო. ბენ ბლენკოვმა (ტორონტოს უნივერსიტეტმა) გააცნო ალტერნატიული სპლაისინგის მარეგულირებელი ქსელების კონცეფცია და მათი როლი განვითარებასა და აუტისტური სპექტრის აშლილობებში. ბლენკოუმ აჩვენა, თუ როგორ NGS მონაცემების ანალიზმა საშუალება მისცა აღმოჩენილიყო ახალი კლასის მიკრო-ექსონები (3-27 ნუკლეოტიდი), რომლებიც მკაცრად არის კონსერვირებული და რომელთა ალტერნატიული გამორიცხვა დაკავშირებულია აუტიზმის ფენოტიპთან. იზოფორმული რაოდენობრივი მეთოდები განიხილა ედუარდო ეირასმა (პომპეუ ფაბრას უნივერსიტეტი, ბარსელონა, ესპანეთი), რომელმაც განმარტა, თუ როგორ აღწევს SUPPA მეთოდი მაღალ გამოთვლით შესრულებას ტრანსკრიპტის ანოტაციისგან წაკითხული რუკის გამოყოფით. იზოფორმების რაოდენობრივი განსაზღვრის მეთოდოლოგიები დროის სერიების RNA-seq მონაცემებიდან DICEseq მეთოდის გამოყენებით ასევე წარმოდგენილი იყო პოსტერის სესიაზე Yuanhua Huang-ის მიერ (ედინბურგის უნივერსიტეტი, დიდი ბრიტანეთი). ბუნებრივია, იზოფორმული რნმ-ის მოლეკულების არსებობა დაუყოვნებლივ არ გულისხმობს იზოფორმის გამოხატვას ცილის დონეზე, რადგან ტრანსლაციის რეგულაციამ შეიძლება უპირატესად შეარჩიოს იზოფორმების მხოლოდ ქვეჯგუფი. ამ კითხვას მიმართა ლორენცო კალვიელომ (მაქს დელბრიუკის მოლეკულური მედიცინის ცენტრი, ბერლინი, გერმანია), რომელმაც გამოიყენა რიბოსომის პროფილირების მონაცემები და Splice-aware Translational Annotation (SaTAnn) ინსტრუმენტი. ამ ანალიზმა აჩვენა, რომ გენების თითქმის 55% (ადამიანის HEK293 უჯრედებში) თარგმნის ერთ იზოფორმას და ხაზს უსვამს ფართო ტრანსლაციის კონტროლს. SaTAnn-მა ასევე მიიღო საუკეთესო აკრონიმის ჯილდო, რომელმაც დაამარცხა CRAC-ისა და BUM-HMM-ის მკაცრი კონკურენცია (იხილეთ ქვემოთ).

მიუხედავად იმისა, რომ ალტერნატიული შერწყმა დიდი ხანია აღიარებულია, როგორც ტრანსკრიპტომის მრავალფეროვნების მთავარი განმსაზღვრელი, ბოლო კვლევა ასევე ნათელს ჰფენს სინონიმური ვარიანტების ფუნქციურ მნიშვნელობას, ანუ ტრანსკრიპტებს, რომლებიც განსხვავდება მხოლოდ არაკოდირების რეგიონში. კრისტინ მაირმა (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, ნიუ-იორკი) აღწერა, თუ როგორ შეიძლება ტრანსკრიპტის ვარიანტებმა სხვადასხვა 3′ UTR-ებით წარმოქმნას მკვეთრად განსხვავებული ფუნქციები პროტეინში, რომლის კოდირებაც ხდება. თვალსაჩინო მაგალითი მოცემულია ადამიანში CD47 ტრანსკრიპტით: ვარიანტები გრძელი 3′ UTR უპირატესად დაკავშირებულია HuR პროტეინთან (ხანგრძლივ UTR-ზე HuR დამაკავშირებელი ადგილების სიმრავლის გამო), რაც შემდეგ იწვევს ახალშობილის მემბრანულ ლოკალიზაციას. ცილა, ხოლო CD47 ცილები, რომლებიც სინთეზირებულია მოკლე 3′ UTR ვარიანტიდან, რჩება პერინუკლეარულ ლოკალიზაციაში. მოკლე ტრანსკრიპტის ვარიანტები ასევე შეიძლება წარმოიშვას polyA საიტების ალტერნატიული გამოყენებისგან, კრისტინა ლესლის საპრეზენტაციო თემიდან (ასევე მემორიალ სლოან კეტერინგის კიბოს ცენტრიდან, ნიუ იორკი), თუმცა ამ შემთხვევაში უფრო მოკლე ტრანსკრიპტი ძირითადად იწვევს შეკვეცილ ცილას ან არა- კოდირებადი რნმ (ncRNA).

ახალი ncRNA-ების მრავალფეროვნების აღმოჩენა ასევე იყო NGS ტექნოლოგიების ერთ-ერთი მთავარი მიღწევა. ალბინ სანდელინი (ბიოტექნიკური კვლევისა და ინოვაციების ცენტრი, კოპენჰაგენი, დანია) აღწერა მონაცემები გენის ექსპრესიის (CAGE) ექსპერიმენტებიდან, რომლებიც ასახავს ორმხრივი ტრანსკრიფციის გამჭვირვალობას, რაც ხშირად იწვევს mRNA-ncRNA წყვილებს. მან ასევე განმარტა, თუ როგორ გავლენას ახდენს გენომიური მახასიათებლები, როგორიცაა polyA ადგილების სიმკვრივე ან მჭიდროდ განლაგებული ტრანსკრიფციის საწყისი ადგილები ncRNA გამოხატვაზე. იგორ ულიცკიმ (ვეიზმანის ინსტიტუტი, რეჰოვოტი, ისრაელი) გამოიყენა სინტენია lincRNA-ების ფუნქციისა და წარმოშობის გასარკვევად (გრძელი ინტერგენური ncRNAs), რაც ხაზს უსვამს თანმიმდევრობის კონსერვაციის მოკრძალებულ დონეს, რომელიც ნაწილობრივ აიხსნება lincRNA-ში გამაძლიერებლების არსებობით. თანმიმდევრობის შედარების მეთოდოლოგია, რომელიც თავდაპირველად შეიქმნა პარალოგის გენების შესასწავლად, ასევე განიხილა იანა ჰერტელმა (ლაიფციგის უნივერსიტეტი, გერმანია) ncRNA ევოლუციის განსახილველად. და ბოლოს, ტოდ ლოუმ (კალიფორნიის უნივერსიტეტი, სანტა კრუზი, აშშ) გამოიყენა ქრომატინის მონაცემები დნმ-ის ელემენტების ენციკლოპედიიდან (ENCODE) პროექტიდან, რათა აღმოეჩინა ადამიანის tRNA ტრანსკრიპტომის ფართოდ გავრცელებული ეპიგენეტიკური რეგულირება.


1 შესავალი

ცილების აგრეგაცია განუწყვეტლივ იზრდება დაბერებასთან ერთად ცხოველთა ყველა სახეობაში და ყველა გამოკვლეულ ქსოვილში (Ayyadevara, Balasubramaniam, Johnson, et al., 2016 Ayyadevara, Balasubramaniam, Suri, et al., 2016 Brignull et al., 2007, Cohen 20. David et al., 2010 Dillin & Cohen, 2011 Reis-Rodrigues et al., 2012). კონკრეტული აგრეგატული კომპონენტები, სადიაგნოსტიკო თითოეული ადამიანის ნეიროდეგენერაციული დაავადებისთვის, მიჩნეულია, რომ ასრულებენ გამომწვევ როლს, რადგან მათი პათოლოგიასთან დაკავშირებული მუტაცია და/ან გადაჭარბებული გამოხატვა საკმარისია მემკვიდრეობითი ნეიროპათიის მოსატანად ადამიანის საგვარეულოებში და ტრანსგენურ-ცხოველურ მოდელებში (Bandyopadhyay et al., 2007ll. & Cohen, 2011 Li et al., 2013 Miller et al., 2010 Roodveldt et al., 2009). პროტეინები, რომლებიც საჭიროებენ სტრუქტურულ მოქნილობას, ხშირად აერთიანებენ უწესრიგო უბნებს, რითაც ისინი დაუცველნი ხდებიან აგრეგაციის მიმართ, სხვა ცილები აგრეგაციისადმი მგრძნობიარეა მხოლოდ დაჟანგვის ან თარგმანის შემდგომი სპეციფიკური მოდიფიკაციების შემდეგ (Ayyadevara et al., 2015, 2017 Ayyadevara, Balasubramani. 2016 წელი).

ჩვენ ახლახან შევიმუშავეთ გაუმჯობესებული დაწკაპუნების ქიმიის ჯვარედინი კავშირის რეაგენტები და ანალიტიკური პროგრამული უზრუნველყოფა აგრეგატებში მიმდებარე ცილების იდენტიფიცირებისთვის, პეპტიდ-პეპტიდის ჯვარედინი ბმულზე დაფუძნებული და გამოვიყენეთ აგრეგატების პროტეინ-ადჰერენტული ქსელის, ანუ „კონტაქტომის“ დასადგენად. ჩვენ დავიწყეთ მთლიანი, სარკოზილში უხსნადი აგრეგატებით, იზოლირებული SY5Y-APP-დანსვ ადამიანის ნეირობლასტომის უჯრედები (Ayyadevara et al., 2017), ოჯახური ალცჰეიმერის დაავადების მოდელი (fAD). ამ ნაშრომმა გამოავლინა აგრეგატების რთული, არაშემთხვევითი სტრუქტურა, რომელშიც მეგაჰაბები (ძალიან მაღალი კავშირის ჰაბები ≥100 პარტნიორით) და კვანძის კონექტორები (დაბალი შეერთების პროტეინები, რომლებიც აკავშირებენ დიდ ჰაბებს) ფუნქციურად ხელს უწყობენ დიდი აგრეგატების შეკრებას (Balasubramaniam et ალ., 2019). ჩვენ აღვნიშნეთ მნიშვნელოვანი გამდიდრება მეგაჰაბებს შორის დიდი სტრუქტურული პროტეინებით, როგორიცაა ტიტინი, ანკირინები 1-3, ნესპრინები 1-3, MAP1A და სხვა ნეიროფილამენტური პროტეინები, მხოლოდ მათი ზომის შედეგად. ჩვენ ასევე დავაფიქსირეთ მნიშვნელოვანი გამდიდრება სხვადასხვა ნუკლეინის მჟავას დამაკავშირებელი პროტეინებისთვის (Balasubramaniam et al., 2019).


2 რნმ პრიონების თერმოდინამიკა და კინეტიკა

რნმ-ის მეორადი სტრუქტურა კარგი მიახლოებაა რეალური რნმ-ის სტრუქტურისთვის, რადგან, ცილებისგან განსხვავებით, რნმ-ის მეორადი სტრუქტურა იპყრობს დასაკეცი თავისუფალი ენერგიის უმეტეს ნაწილს. გარდა ამისა, არსებობს კარგად ჩამოყალიბებული ენერგეტიკული მოდელი რნმ-ის მეორადი სტრუქტურებისთვის, რომელიც ფართოდ არის პარამეტრიზებული დნობის ექსპერიმენტებით [39]. გამოთვლის მხრივ, შემუშავებულია ალგორითმები რნმ-ის მეორადი სტრუქტურების თერმოდინამიკური და კინეტიკური დახასიათებისთვის [28]. კერძოდ, ენერგიულად ოპტიმალური სტრუქტურა და სტრუქტურული ანსამბლის თვისებები თერმოდინამიკური წონასწორობის დროს შეიძლება ეფექტურად გამოითვალოს. დისკრეტული დასაკეცი ლანდშაფტის ტოპოლოგია [12], რომელიც ძლიერ გავლენას ახდენს დასაკეცი კინეტიკაზე, შეიძლება დეტალურად გაანალიზდეს. რამდენიმე მიდგომა მოდელირებს რნმ-ის მეორადი სტრუქტურის დასაკეც კინეტიკას, როგორც სტოქასტურ პროცესს დასაკეცი ლანდშაფტის განსხვავებული გარჩევადობით [9, 45, 26] (მიმოხილვისთვის იხ. [10]). ბოლო დროს ეს მიდგომები გაფართოვდა დასაკეცი ლანდშაფტების გამოსაყენებლად, რომლებიც დროთა განმავლობაში იცვლება, როგორც ტრანსკრიფციის დროს დასაკეცი [19].

2.1 თერმოდინამიკა

მოდით, რნმ-ის მეორადი სტრუქტურების Ω კომპლექტი შემოიფარგლოს მხოლოდ იმით, რომლებიც წარმოიქმნება ბუდობრივი იზოტერული ბაზის წყვილებისგან (GC, AU, GU), რომლებსაც აქვთ თმის სამაგრის მინიმალური ზომა 3 ნტ და შიდა მარყუჟის მაქსიმალური ზომა 30 ნტ. ეს შეზღუდვები საკმარისად ფართოა, რათა მოიცავდეს ცნობილი ფსევდოკვანძისგან თავისუფალი რნმ-ის კონფორმაციების დიდ უმრავლესობას და ისინი განსაზღვრავენ სტრუქტურების ერთობლიობას, რომლისთვისაც ექსპერიმენტულად განსაზღვრული ენერგიის მოდელია. არსებობს [29]. რაც მთავარია გამოთვლითი პერსპექტივიდან, ეს განმარტებები საშუალებას გვაძლევს გამოვთვალოთ მინიმალური თავისუფალი ენერგიის სტრუქტურა (MFE) და წონასწორული დანაყოფის ფუნქცია ()-ში ( 3) დრო, სად არის მიმდევრობის სიგრძე.

2.2 კინეტიკური დასაკეცი

საუკეთესო დასაკეცი ბილიკის პოვნა ნაჩვენებია, როგორც NP-მყარი პრობლემა [30]. თუმცა, არსებობს სწრაფი ევრისტიკა ორ სტრუქტურას შორის პირდაპირი (უმოკლესი) ბილიკის გამოსათვლელად, როგორიცაა findpath [11] მეთოდი ხელმისაწვდომი ViennaRNA პაკეტში, ისევე როგორც არაპირდაპირი ბილიკები, მაგალითად, RNAtabupath [7] გამოყენებით. დაახლოებით 100 ნტზე მოკლე მიმდევრებისთვის, მინიმალური ენერგეტიკული ბარიერის მქონე ბილიკები შეიძლება ზუსტად გამოითვალოს RNAsubopt [46] და ბარიერებით [12]. პირველი პროგრამა ითვლის ყველა რნმ-ის მეორადი სტრუქტურის ჩამონათვალს გარკვეული ენერგეტიკული დიაპაზონის ბარიერებში, ამუშავებს ამ კონფორმაციების დახარისხებულ სიას, რათა გამოითვალოს ყველა ლოკალური მინიმუმი და უნაგირების წერტილები, რომლებიც აკავშირებს მათ დატბორვის ალგორითმით.

2.3 რნმ პრიონების პეიზაჟები

რნმ პრიონები ბისტაბილი მოლეკულებია, რომლებიც ხელს უწყობენ ერთ სტრუქტურას (1) თუ წარმოდგენილია მონომერის სახით და სხვა სტრუქტურა (2) დიმერიზაციისას. სპონტანური განმეორების თავიდან ასაცილებლად შორის 2 და 1ენერგეტიკული ბარიერი β21 უნდა იყოს ძალიან მაღალი (იხ. სურათი 1).

სქემატური მოთხოვნები რნმ პრიონისთვის. მოლეკულის წითელი და ლურჯი ნაწილები ერთმანეთს ავსებენ და შეუძლიათ შექმნან ინტერმოლეკულური ჰიბრიდიზაციის რეაქცია. ზედა პანელი: 1 და 2 არის სტაბილური კონფორმაციები, რომლებიც არ იშლება ერთმანეთში, ვინაიდან კონფორმაციები გამოყოფილია ენერგეტიკულ ლანდშაფტში მაღალი ენერგეტიკული ბარიერით. ქვედა პანელი: 2 დესტაბილიზაციას ახდენს 1 აივ-დის ტიპის კოცნის მარყუჟის ურთიერთქმედებით. ენერგეტიკული ბარიერი ამისთვის 12 კომპლექსი დასაკეცი შევიდა 22 კომპლექსი დაბალია და ამიტომ იძლევა სპონტანურ ხელახლა დაკეცვას.

სქემატური მოთხოვნები რნმ პრიონისთვის. მოლეკულის წითელი და ლურჯი ნაწილები ერთმანეთს ავსებენ და შეუძლიათ შექმნან ინტერმოლეკულური ჰიბრიდიზაციის რეაქცია. ზედა პანელი: 1 და 2 არის სტაბილური კონფორმაციები, რომლებიც არ იშლება ერთმანეთში, ვინაიდან კონფორმაციები გამოყოფილია ენერგეტიკულ ლანდშაფტში მაღალი ენერგეტიკული ბარიერით. ქვედა პანელი: 2 დესტაბილიზაციას ახდენს 1 აივ-დის ტიპის კოცნის მარყუჟის ურთიერთქმედებით. ენერგეტიკული ბარიერი ამისთვის 12 კომპლექსი დასაკეცი შევიდა 22 კომპლექსი დაბალია და ამიტომ იძლევა სპონტანურ ხელახლა დაკეცვას.

ჩვენს დიზაინში, 2 ქმნის ორ 10-ნტ თმის სამაგრს, რომლებიც მიდრეკილნი არიან ჰიბრიდიზაციისკენ კოცნის ურთიერთქმედების გზით, როგორც მოხსენებულია HIV-DIS მარყუჟისთვის [8], უაღრესად კონსერვირებული ღერო-მარყუჟის თანმიმდევრობა, რომელიც გვხვდება ბევრ რეტროვირუსში. მნიშვნელოვანია, 2 არ უნდა მოხდეს მხოლოდ სხვა მოლეკულების სტაბილიზაცია 2 კონფორმაცია მაღალ კონცენტრაციებში, მაგრამ აქტიურად ამცირებს ენერგეტიკული ბარიერის დასაკეცად 1 შევიდა 2 (იხ. სურათი 1).

თუ ეს ლანდშაფტის თვისებები შესრულებულია, ეს უზრუნველყოფს თავდაპირველ პოპულაციას მხოლოდ ს1 მოლეკულები არ იშლება 2 გარდა იმ შემთხვევისა, როდესაც ხელახალი დაკეცვა არ არის გამოწვეული გარე მექანიზმით. თუმცა, როგორც კი მოლეკულების მცირე პოპულაცია შემოვა 2 კონფორმაცია არსებობს, მათ შეუძლიათ ხელახალი დაკეცვის კატალიზირება 1 მოლეკულებში შევიდა 2.


რნმ-ის სტაბილური იზოტოპური ფოსფატის მარკირების გამოყენება და უპირატესობები მას-სპექტრომეტრიაში

მასის სპექტრომეტრია (MS) გახდა ხელშემწყობი ტექნოლოგია რიბონუკლეინის მჟავებში (რნმ) პოსტტრანსკრიპციულად მოდიფიცირებული ნუკლეოზიდების დასახასიათებლად. ეს მოდიფიცირებული რნმ-ები, როგორც წესი, უფრო რთულია სრული დახასიათება ჩვეულებრივი გენომზე დაფუძნებული თანმიმდევრობის ტექნოლოგიების გამოყენებით. როგორც მრავალი ბიოლოგიური მოლეკულის შემთხვევაში, ინფორმაცია, რომელიც ეხება კონკრეტული ნაერთის არსებობას ან არარსებობას (ანუ ხარისხობრივი გაზომვა) ნიმუშის დახასიათების მხოლოდ ერთი ეტაპია. დამატებითი სასარგებლო ინფორმაცია მოძიებულია ნიმუშში საინტერესო ნივთიერების დონეებზე რაოდენობრივი გაზომვების განხორციელებით. მოდიფიცირებული რნმ-ების ფოსფატის მარკირება შემუშავებულია ჩვენი ლაბორატორიის მიერ, მასობრივი სპექტრომეტრიის ჩვეულებრივი ტექნიკის გასაუმჯობესებლად. მრავალი რიბონუკლეაზას (RNases) მოქმედების მექანიზმის გამოყენებით, რნმ-ის ნიმუშების მონელება 18 O-მონიშნული წყლის თანდასწრებით წარმოქმნის 18 O- მარკირებულ 3'-ფოსფატს თითოეულ მონელების პროდუქტში. ჩვენ აღვწერთ ამ მიდგომის ისტორიულ განვითარებას, ვაპირისპირებთ ამ სტაბილური იზოტოპური მარკირების სტრატეგიას რნმ-ის მასის სპექტრომეტრიაში გამოყენებულ სხვა სტრატეგიებთან და გთავაზობთ ახალი ანალიტიკური მასის სპექტრომეტრიის მეთოდების მაგალითებს, რომლებიც ნებადართულია ამ გზით ფოსფატის მარკირებით.

ეს არის გამოწერის შინაარსის გადახედვა, წვდომა თქვენი დაწესებულების მეშვეობით.


ᲒᲐᲙᲕᲔᲗᲘᲚᲘᲡ ᲒᲔᲒᲛᲐ

გაკვეთილის ფონი

ინსტრუქტორის კვლევის ჩასართავად და სტუდენტებს მართვადი, მაგრამ ავთენტური კვლევის შესაძლებლობის მისაცემად, ფაკულტეტი და სტუდენტები ერთობლივად მუშაობენ რედაქტირებისთვის საინტერესო გენის იდენტიფიცირებისთვის. ამ გაკვეთილის პირველმა გამოყენებამ შექმნა შეკვეცის მუტანტები C. elegans გენი klp-4, მაგრამ ნებისმიერი მოდელი ან გენის სამიზნე შეიძლება გამოყენებულ იქნას ინსტრუქტორის შეხედულებისამებრ. მიუხედავად იმისა, რომ ჩვენ ჩავრთეთ ჩვენი სპეციფიკური რეაგენტები, ჩვენ ვცდილობთ, რომ ეს გაკვეთილი ზოგადი გაგვეკეთებინა, რათა გაკვეთილი გამოყენებული იქნას მრავალ კონტექსტში/მოდიფიკაციაში. საჭირო ზოგადი მასალებისა და გადაწყვეტილებების სრული სია შეგიძლიათ იხილოთ დამხმარე ფაილებში 6 და 7 (მხარდაჭერის ფაილი S6: საჭირო გაკვეთილის აღჭურვილობა/რეაგენტები და დამხმარე ფაილი S7: საერთო გადაწყვეტილებები).

ამ ლაბორატორიის ყოველი სესია უნდა დაიწყოს ცარცი-საუბრით, რომელიც მოიცავს საკვანძო პუნქტებსა და პროცესებს, რომლებიც დაკავშირებულია უნარების განვითარებასთან. ჩვენ უპირატესობას ვანიჭებთ ცარცის საუბრებს, ვიდრე მომზადებულ ლექციებს, სტუდენტების მრავალფეროვანი ცოდნის გათვალისწინებით და „რეალურ დროში“ ადაპტაციის შესაძლებლობის გათვალისწინებით, სტუდენტების კითხვებისა და ინტერაქციის საფუძველზე. ცარცის საუბრები საშუალებას იძლევა ფოკუსირება მოახდინოს თითოეული უნარის როლზე მეცნიერების პროცესში და როგორ იქნა გამოყენებული თითოეული ეს უნარი კვლევის მიზნების მისაღწევად (მხარდამჭერი ფაილი S8: ცარცის სასაუბრო წერტილები და პასუხები სადისკუსიო კითხვებზე). გარდა ამისა, ყოველი ლაბორატორიული მასალის დასასრული შეიცავს დისკუსიას და აპლიკაციის კითხვებს საკვანძო იდეების განსამტკიცებლად (მხარდაჭერის ფაილი S8). გაკვეთილის ქრონოლოგიის ნიმუში შეგიძლიათ იხილოთ ცხრილში 1.

მოდული 1: PCR-ის პრინციპები - ჰომოლოგიით მიმართული შეკეთება (HDR) შაბლონის სინთეზი

სტუდენტები ასრულებენ ფონურ კვლევას საინტერესო გენზე და კონსულტაციებს უწევენ ინსტრუქტორს, რათა აირჩიონ პოტენციური რედაქტირება, რომელიც შეიძლება განხორციელდეს ამ გენზე და დააპროექტონ ჰომოლოგიაზე მიმართული სარემონტო (HDR) კასეტები (მხარდამჭერი ფაილი S9: სახელმძღვანელო სტუდენტური პროექტების შესახებ კონსულტაციისთვის) . ამ პროცესის მეშვეობით სტუდენტები შეისწავლიან მოლეკულური კლონირების პროგრამული უზრუნველყოფის საფუძვლებს, ბიოინფორმატიკის ძირითად უნარებს და გაეცნობიან პირველადი ლიტერატურას, რომელიც დასჭირდებათ პოსტერების შეფასებისთვის.

სტუდენტები იყენებენ მოლეკულური კლონირების პროგრამულ უზრუნველყოფას პრაიმერების შესაქმნელად, რათა გააძლიერონ მათი HDR დარტყმის თანმიმდევრობა კასეტაში, ყურადღება მიაქციონ ჰომოლოგიური მკლავების დამატებას და კითხვის ჩარჩოს შენარჩუნებას წარმატებული ჩასმისას (Supporting File S10: Lab 1 - PCR and Primer Design and 7 ). აქცენტის პუნქტებია დნმ-ის 5'-3' ორიენტაცია, საპირისპირო ჯაჭვის მიმდევრობის დაშვება და დამატებითი დნმ-ების დნობისა და ანელების თერმოდინამიკური თვისებები.

მათი PCR რეაქციების შესრულების შემდეგ, თითოეული რეაქციის მცირე ნაწილაკები გადის აგაროზას გელებზე ანალიზისთვის (მხარდამჭერი ფაილი S11: ლაბორატორია 2 - PCR რეაქციების დაყენება, დამხმარე ფაილი S12: ლაბორატორია 3 - დნმ აგაროზის გელის ელექტროფორეზი და სურათი 1A). მოსწავლეებს უნდა შეეძლოთ პროდუქტის ზომის პროგნოზირება და შემდეგ მათი მონაცემების ანალიზი და პოტენციური დადებითი რეაქციების იდენტიფიცირება. პოტენციური დადებითი ნიმუშები შემდეგ იწმინდება და თანმიმდევრობით (Supporting File S13: Lab 4 - PCR Purification and Sequence Prep). მოლეკულური კლონირების პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით, სტუდენტები აანალიზებენ თავიანთი თანმიმდევრობის მონაცემებს, რათა დაადგინონ წარმატებული იყო თუ არა მათი PCR რეაქციები (მხარდაჭერილი ფაილი S14: ლაბორატორია 5 - თანმიმდევრობის ანალიზი, დამხმარე ფაილი S15: KIF17B-1 - .ab1 ფაილი, დამხმარე ფაილი S16: KIF17B-2.ape ფაილი, დამხმარე ფაილი S17: Unknown.ab1 ფაილი და სურათი 1B). თანმიმდევრობით დამოწმებული HDR შაბლონები შემდეგ ინახება შემდგომი გამოყენებისთვის, თუ სასურველია.


სურათი 1. mCherry ჰომოლოგიის მიმართული შეკეთების (HDR) შაბლონების გაძლიერება. (A) PCR რეაქციის პროდუქტების წარმომადგენლობითი აგაროზის გელი HDR შაბლონებისთვის 1-4. mCherry PCR პროდუქტების მოსალოდნელი ზომა ჰომოლოგიური იარაღით არის 935 ბაზის წყვილი. (B) სტუდენტის მიერ შექმნილი თანმიმდევრობის შედეგების გასწორება, რომელიც აჩვენებს mCherry-ის წარმატებულ გაძლიერებას HDR შაბლონისთვის-3. ნუკლეოტიდები 61-100 mCherry ნაჩვენებია მოკლედ. თანმიმდევრობის გასწორება შეიქმნა ApE პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით.

მოდული 2: რეკომბინანტული დნმ-ის წარმოება - ერთი სახელმძღვანელო რნმ პლაზმიდების აგება

Cas9-ის უბნის სპეციფიური სამიზნე ერთჯერადი სახელმძღვანელო რნმ-ები (sgRNAs) შექმნილია სამიზნე გენის ანოტირებული გენომიური თანმიმდევრობის გამოყენებით (მხარდამჭერი ფაილი S18: ლაბორატორია 6 - crRNA ოლიგოსის დიზაინი). შეგახსენებთ, რომ სრული sgRNA შეიცავს ორ დაკავშირებულ კომპონენტს: სპეციფიკურ CRISPR RNA-ს (crRNA), რომელიც მიზნად ისახავს სპეციფიკურ დნმ-ის თანმიმდევრობას და უნივერსალურ ტრანსაქტივაციურ CRISPR RNA-ს (tracrRNA), რომელიც აკავშირებს crRNA-ს Cas9 ფერმენტთან. ჰვანგმა და სხვ. შექმნეს პლაზმიდი DR274 (Addgene Plasmid #42250, საჭიროა MTA), რომელიც შეიცავს crRNA-ს ჩასმის ადგილს, რასაც მოჰყვება tracrRNA თანმიმდევრობა. ამ პლაზმიდის გამოსაყენებლად მომხმარებლებს სჭირდებათ მხოლოდ დამატებითი ოლიგონუკლეოტიდების შემუშავება და ანეილირება, რომლებიც შეესაბამება სასურველ crRNA თანმიმდევრობას. მნიშვნელოვანია, რომ DR274 შექმნილია ანეილირებული crRNA ოლიგონუკლეოტიდების მიმართული (ცალმხრივი) ჩასართავად. DR274 შეიცავს ორ BsaI შეზღუდვის ფერმენტის ადგილს, რომლებიც გამოყოფილია სპაზერის თანმიმდევრობით. BsaI ფერმენტის ამოცნობის თანმიმდევრობა არის 5' GGTCTC 3', თუმცა ფერმენტი ანაწილებს ერთ არასპეციფიკურ ნუკლეოტიდს GGTCTC ამოცნობის თანმიმდევრობის 3' დასასრულის შემდეგ (5'GGTCTCN3') და ხუთ არასპეციფიკურ ნუკლეოტიდს 5' ბოლოსკენ. ქვედა ძაფზე (3'CCAGAGNNNN5'). DR274-ის crRNA-ს ჩასმის ადგილზე განლაგებული თანმიმდევრობები განზრახ განსხვავებულია, რათა ხელი შეუწყოს ანილირებული crRNA ოლიგონუკლეოტიდების მიმართულების შეყვანას ტრაკრრნმ-ის თანმიმდევრობის ზემოთ, რათა წარმოქმნას sgRNA-ების მეშვეობით. ინ ვიტრო ტრანსკრიფცია (10). სტანდარტული ლიგაციის რეაქციებში გამოიყენება BsaI მონელებული, დეფოსფორილირებული DR274 და ანეილირებული ოლიგონუკლეოტიდები (მხარდამჭერი ფაილი S19: ლაბორატორია 7 - sgRNA პლაზმიდების მომზადება). ლიგაციის რეაქციები გარდაიქმნება კომპეტენტურ ბაქტერიებად და იდება LB-კანამიცინის ფირფიტებზე ღამის ინკუბაციისთვის 37°C-ზე.

სტუდენტები შეარჩევენ ბაქტერიულ კლონებს ღამით თხევადი კულტურებისთვის და მიიღებენ დეტალურ ინსტრუქციას დნმ-ის იზოლაციაში გამოყენებული თითოეული ხსნარის დანიშნულების შესახებ (მხარდამჭერი ფაილი S20: ლაბორატორია 8 - მინიპრეპსები და დიაგნოსტიკური დაიჯესტი და 5). მას შემდეგ, რაც დნმ წარმატებით იზოლირებულია, პლაზმიდები რიგდება და ანალიზდება ბიოინფორმაციული უნარების შესახებ მეტი პრაქტიკისთვის. crRNA კასეტების შემცველი პლაზმიდები დიაგნოსტიკურად იშლება NheI და HindIII გამოყენებით. საჭმლის მონელების შედეგად წარმოიქმნება 2018 და 143-ნუკლეოტიდების ფრაგმენტები, რომლებიც საჭიროებენ მაღალი პროცენტული აგაროზის გელს. ამ დიაგნოსტიკური დაიჯესტის წარმატება განსხვავებულია, მაგრამ 50% შემთხვევაში სტუდენტებს შეუძლიათ შექმნან სწორი ზომის ზოლები. დაუჭრელი პლაზმიდი ასევე შეიძლება გაშვებული იყოს მონელებული პლაზმიდის გვერდით, რათა აჩვენოს სუპერმოხვეული და ხაზოვანი დნმ (სურათი 2A). სტუდენტები აანალიზებენ მათ გელებს პოტენციური დადებითი კლონების დასადგენად. მაშინაც კი, თუ დიაგნოსტიკური დაჯესტები წარუმატებელია, სტუდენტები რეგულარულად იღებენ დადებით შედეგებს ზემოთ მოყვანილი თანმიმდევრობის ანალიზიდან (სურათი 2B).


სურათი 2. sgRNA პლაზმიდის კლონირების შემოწმება. (A) სტუდენტის გენერირებული წარმომადგენლობითი აგაროზის გელი HindIII/NheI-ის გამოყენებით DR274 + crRNA-3 ოთხი ცალკეული კლონის დიაგნოსტიკური დაჯესტის შესასრულებლად იმავე კლონის დაუმუშავებელი, ზეგადახვეული ნიმუშის წინააღმდეგ. ორმაგად მონელებული დადებითი კლონების მოსალოდნელი ზომა: 2152 ბაზის წყვილი და 134 ბაზის წყვილი (B) თანმიმდევრობის შედეგების გასწორება DR274 + crRNA-3 კლონ 2-სა და შემუშავებულ crRNA-3 თანმიმდევრობას შორის. თანმიმდევრობის გასწორება შეიქმნა ApE პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით.

მოდული 3: რნმ-თან მუშაობა - SGRNA-ს წარმოება

გაშვება ინ ვიტრო ტრანსკრიფცია გამოიყენება sgRNA-ს წარმოებისთვის (Supporting File S21: Lab 9 - ინ ვიტრო ტრანსკრიფცია). თანმიმდევრობით დამოწმებული sgRNA პლაზმიდები ჯერ ხაზოვანი ხდება DraI-ით, რასაც მოჰყვება ფენოლ-ქლოროფორმის ექსტრაქცია და ეთანოლის დალექვა. სტუდენტებმა უნდა იზრუნონ რნმ-ით დაბინძურების თავიდან აცილებაზე, რადგან დნმ-ები გამოყენებული იქნება ქვედა დინებაში რნმ-ის აპლიკაციებში. სტუდენტის ტიპიური გამოსავალი ამ გამწმენდი პროცედურისგან მერყეობს 10-დან 200 ნგ/მკლ-მდე ხაზოვანი შაბლონის დნმ-ის. შემდეგ sgRNA წარმოიქმნება ინ ვიტრო ტრანსკრიფცია. სულ მცირე 10 ნგ ხაზოვანი შაბლონის დნმ-ის გამოყენება შეიძლება ინ ვიტრო ტრანსკრიფციის რეაქცია. ნიმუშები უნდა იყოს დამუშავებული DNase-ით, რათა შემდეგ ამოიღონ დნმ-ის შაბლონი ინ ვიტრო ტრანსკრიფცია. ინ ვიტრო წარმოებული sgRNA-ები იწმინდება და ექვემდებარება დენატურირებადი აგაროზის გელის ელექტროფორეზის (მხარდამჭერი ფაილი S22: ლაბორატორია 10 - სგრნმ-ების გამწმენდი). ტრადიციული დენატურირების გელის ტექნიკის გამოყენების ნაცვლად, არნანდამ და კოლეგებმა შეიმუშავეს მარტივი ეფექტური ალტერნატივა, რომელიც იყენებს სტანდარტული აგაროზის გელებს, რომლებიც შეიცავს 5%-მდე სტანდარტულ საყოფაცხოვრებო მათეთრებელს რნმ-ების დენატაციისთვის (7). მთლიანი რნმ-ის 200-250 ნგ ნიმუში წარმოქმნის სწორი ზომის ზოლებს (

133 ნუკლეოტიდი) და გელზე რნმ-ის ამ რაოდენობაზე მეტი გაშვება იწვევს რნმ-ის მეორადი სტრუქტურის ფორმირებას, ზოლების ცუდ გარჩევადობას და გელზე არასწორ ზომას (სურათი 3).


სურათი 3. ინ ვიტრო ტრანსკრიბირებული sgRNA 1-4 დენატურირებული გაუფერულების გელი. პროდუქტის სავარაუდო ზომაა 133 ბაზა. გაითვალისწინეთ, რომ sgRNA-4 ინ ვიტრო ტრანსკრიფციის რეაქციამ წარმოქმნა დაბალი გამოსავალი.

მოდული 4: ექსპერიმენტული დიზაინი AN IN VITRO CAS9 CLEAVAGE ASSAY

CRISPR-Cas9-ის პრინციპისა და ექსპერიმენტული დიზაინის პროცესის საჩვენებლად ვიყენებთ ა ინ ვიტრო მეთოდი (მხარდაჭერილი ფაილი S23: ლაბორატორია 11 - ინ ვიტრო Cas9 Assay და 8, ასევე იხილეთ https://www.neb-online.de/wp-content/uploads/2015/06/LocusModificationDetectionCas9_Protocol_0515.pdf ანალიზის საფუძვლებისთვის). ჩვენ შევქმენით ჩვენი საკუთარი სინთეზური სამიზნე კონსტრუქცია, შემუშავებული ინდივიდუალური dsDNA, რომელიც შეიცავს თითოეული ჯგუფის 20-ნუკლეოტიდულ სამიზნეს, რასაც მოჰყვება PAM თანმიმდევრობა. მორგებული dsDNA ბლოკი ლიგირებულია pET28a(+) მრავალ კლონირების ადგილზე. pET ვექტორზე დაფუძნებული სინთეზური სამიზნე პირველად ხაზოვანია EcoRV-ით, რათა უზრუნველყოს ხაზოვანი სუბსტრატი ჩვენი ანალიზისთვის. ამ სინთეზური სამიზნე სუბსტრატის გამოყენებით, sgRNA-Cas9 დუპლექსის წარმატებული გაყოფა გამოიწვევს პროდუქტებს

4 კბ და 1,5 კბ (მხარდამჭერი ფაილი S24: გაკვეთილზე დამოწმებული რეაგენტები და მეთოდები და სურათი 4). სავარაუდოდ, ნებისმიერი ორჯაჭვიანი დნმ (პლაზმიდი, cDNA კლონი, PCR პროდუქტი და ა.შ.), რომელიც შეიცავს სპეციფიკურ 20-ნუკლეტიდურ სამიზნე თანმიმდევრობას, რასაც მოჰყვება PAM თანმიმდევრობა, შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც სუბსტრატი ამ ანალიზისთვის. სინთეზური სამიზნის გამოყენებას აქვს უპირატესობა, რომ მოითხოვს მხოლოდ ერთი საერთო სუბსტრატს ყველა სტუდენტური ჯგუფისთვის, იმის ნაცვლად, რომ წარმოიქმნას ან მიიღონ სხვადასხვა სამიზნე. ჩვენ გირჩევთ გამოიყენოთ ხაზოვანი შაბლონი ამ ანალიზისთვის, რათა გაადვილდეს შედეგების ინტერპრეტაცია სტუდენტებისთვის. მოსწავლეებმა უნდა შეინარჩუნონ ნუკლეაზასგან თავისუფალი გარემო ანალიზის დროს. თუ დრო იძლევა, მას შემდეგ რაც სტუდენტებმა აჩვენეს თავიანთი რეაგენტების წარმატებული დიზაინი, არსებობს ამ რეაგენტების გამოყენების შესაძლებლობა. in vivo ან ex vivo.


სურათი 4. უბნის სპეციფიკური სამიზნის გაყოფა in vitro Cas9 ანალიზში. სგრნმ 1-4 ინ ვიტრო Cas9 ანალიზის წარმომადგენლობითი სტუდენტური მონაცემები სინთეზური სამიზნე სუბსტრატის წინააღმდეგ. არცერთი sgRNA და არც sgRNA/no Cas9 არ იყო გამოყენებული როგორც კონტროლი. წარმატებული გაყოფა აწარმოებს პროდუქტებს

4000 ბაზის წყვილი და 1500 ბაზის წყვილი.


ცხრილი 1. CRISPR-Cas9 სწავლების ვადები - კვირა 1


ცხრილი 1. CRISPR-Cas9 სწავლების ვადები - კვირა 2


ცხრილი 1. CRISPR-Cas9 სწავლების ვადები - კვირა 3


ცხრილი 1. CRISPR-Cas9 სწავლების ვადები - კვირა 4


ცხრილი 1. CRISPR-Cas9 სწავლების ვადები - კვირა 5


ცხრილი 1. CRISPR-Cas9 სწავლების ვადები - კვირა 6


ცხრილი 1. CRISPR-Cas9 სწავლების ვადები - კვირა 7


ცხრილი 1. CRISPR-Cas9 სწავლების ვადები - კვირა 8


ცხრილი 1. CRISPR-Cas9 სწავლების ვადები - მე-9 კვირა


ცხრილი 1. CRISPR-Cas9 სწავლების ვადები - 10-12 კვირა


იშემიით გამოწვეული ენდოთელური უჯრედების დისფუნქცია

მიოკარდიუმის ქსოვილში სისხლის მიწოდების ნაკლებობა ან შეზღუდვა არის ცენტრალური გულის დისფუნქციის ხელშეწყობისთვის HF-ში, იშემიით და ჰიპოქსიით, რომელიც სპეციალურად ასოცირდება ECM-ის დეპონირებასთან, ანთებასთან და უჯრედების სიკვდილთან [93, 94]. ვინაიდან EC-ები ძალზე მნიშვნელოვანია მიოკარდიუმის პერფუზიის შესანარჩუნებლად, ისინი ხელს უწყობენ HF-ის ყველა კლინიკურ გამოვლინებას. როგორც გულის უჯრედების სხვა ტიპები, EC-ები მგრძნობიარეა იშემიური დაზიანების მიმართ, რამაც შეიძლება გავლენა მოახდინოს მათ ფუნქციურ შესაძლებლობებზე. ცნობილია, რომ ჰიპოქსია არღვევს EC მთლიანობას, რის შედეგადაც იზრდება სისხლძარღვთა გამტარიანობა და ლეიკოციტების ინფილტრაცია [95]. რაც უფრო მნიშვნელოვანია, მიოკარდიუმის რეპერფუზიის კონტექსტში, EC-ებს შეუძლიათ იმოქმედონ როგორც ორმაგი მახვილი სისხლის ნაკადის ხელშეწყობის გზით, ხოლო გულის იშემიური დაზიანების გაძლიერებით გაძლიერებული ოქსიდაციური სტრესის მეშვეობით [96]. მართლაც, დასაფასებელია, რომ ჰიპოქსიას და ROS-ს შეუძლია ხელი შეუწყოს დნმ-ის მეთილაციის ცვლილებას EC-ებში, რაც იწვევს ფენოტიპსა და ფუნქციის ცვლილებას და სისხლძარღვთა ჰომეოსტაზის დარღვევას.

დაგროვილი მტკიცებულება ვარაუდობს, რომ EC-ებმა შეიძლება განიცადონ ფენოტიპური ცვლილება ჰიპოქსიის საპასუხოდ, რომელიც ცნობილია როგორც ენდოთელურიდან მეზენქიმურ გადასვლას (EndoMT), რომელშიც უჯრედები იღებენ ფიბრობლასტების მსგავს თვისებებს. მაგალითად, როგორც ადამიანის კორონარული არტერიის მაკროვასკულარული (HCAEC) ასევე HCMEC-ები აჩვენებდნენ მეზენქიმურ ფენოტიპს 72 საათის შემდეგ 1% ჟანგბადში (მორფოლოგიური ცვლილებები, შემცირებული CD31, ამაღლებული SNAIL, SLUG, TWIST, S100A4 და α-გლუვი კუნთების მოქმედება). . ეს დაკავშირებული იყო EC ფენოტიპის დაკარგვასთან და ექსპრესიის შემცირებასთან RASAL1 გაზრდილი DNMT3A-ს შუამავლობით CpG მეთილაციის გამო პრომოტორულ რეგიონში [67], როგორც ადრე იყო ნაჩვენები ბოლო სტადიის HF პაციენტების მიოკარდიუმში [49]. EndoMT-ის გამო გულში სისხლძარღვთა მხარდაჭერის დაკარგვა საბოლოოდ იწვევს მიოკარდიუმის ჰიპოქსიის გაძლიერებას, რითაც ხელს უწყობს შემდგომ EndoMT-ს, სისხლძარღვთა დაკარგვას და გულის პათოლოგიურ რემოდელირებას. როგორც ასეთი, EC ფენოტიპის შენარჩუნება დნმ-ის მეთილაციის მიზნობრივი გზით შეიძლება წარმოადგენდეს ახალ მიდგომას ჰიპოქსიით გამოწვეული EndoMT-ის შესუსტების მიზნით HF-ში.

ჰიპოქსიის საპასუხოდ, HIF-დამოკიდებული EC სიგნალის გააქტიურება ხელს უწყობს ადაპტირებულ ანგიოგენურ პასუხს გარემოს დაბალი ჟანგბადის მიმართ, რომელიც, როგორც ჩანს, მოიცავს დნმ-ის მეთილაციის ცვლილებებს. მაგალითად, HUVEC-ებმა 2 დღის განმავლობაში ჰიპოქსიის ქვეშ (0.5% ჟანგბადი) კულტივირებულმა აჩვენა უჯრედშიდა ადენოზინის დონის მომატება ადენოზინ-მეტაბოლიზებელი ფერმენტის ადენოზინ კინაზას (ADK) HIF-დამოკიდებული შემცირების გამო. ეს დაკავშირებული იყო გაზრდილ ანგიოგენურ შესაძლებლობებთან და DNMT აქტივობის დაქვეითებასთან და გლობალურ ჰიპომეთილაციასთან ანგიოგენეზის ძირითადი გენების პრომოტორ რეგიონებში, მათ შორის KDR, NOS3, GATA4 და SEMA5 [68]. ამის საპირისპიროდ, HUVEC-ების სხვა კვლევამ, რომელიც შენარჩუნებულია ჰიპოქსიაში 16 საათის განმავლობაში, იტყობინება გაზრდილი დნმ-ის მეთილაცია 5'-გვერდით რეგიონში. NOS3 რომელიც შეიცავს 13 CpG ელემენტს, რაც იწვევს MBD2-ის რეკრუტირებას და eNOS ექსპრესიის ჩახშობას, რაც შეცვალა მიზნობრივი siRNA-ს ნოკდაუნით და გაძლიერებული ექსპრესიით. KDR [66]. დამატებითი ანალიზები Mbd2-დეფიციტური თაგვები აჩვენებდნენ eNOS და KDR ექსპრესიის სისხლძარღვთა ექსპრესიის გაზრდას და გაუმჯობესებული აღდგენა ექსპერიმენტული უკანა კიდურის იშემიისგან, რაც მიუთითებს კაპილარების და არტერიოლების სიმკვრივის გაზრდით ველური ტიპის კონტროლის წინააღმდეგ [66]. ამ დაკვირვებამ შეიძლება ნაწილობრივ მაინც ახსნას, თუ რატომ რეაგირებენ სისხლძარღვთა დაავადების მქონე პაციენტები პრო-ანგიოგენურ აგენტებზე, რადგან ჰიპოქსიით გამოწვეული დნმ-ის მეთილაციის ცვლილებები, შუამავლობით მოქმედი ცილები, როგორიცაა MBD2, შეიძლება ხელი შეუწყოს EC დისფუნქციას. მართლაც, თაგვების ცერებრალური EC-ები (MCEC), რომლებიც ექვემდებარებოდნენ როგორც ანოქსიას, ასევე გლუკოზის დეპრივაციას, აჩვენეს გაზრდილი დნმ-ის მეთილაცია თრომბოსპონდინ-1-ის პრომოტორზე (Thbs1), მატრიცელულარული გლიკოპროტეინი, რომელიც ხელს უწყობს ანტიანგიოგენურ მოქმედებებს VEGF/NO სიგნალიზაციის და EC მიგრაციის/პროლიფერაციის დათრგუნვით, რამაც გამოიწვია Thbs1 ექსპრესიის შემცირება როგორც რნმ-ის, ასევე ცილის დონეზე [69, 97,98,99]. საინტერესოა, რომ ჟანგბადის და გლუკოზის ნორმალური პირობების შემდგომ აღდგენამ 4 საათის განმავლობაში გამოიწვია დემეთილირება. Thbs1 პრომოტორი და გენის ექსპრესიის აღდგენა, რაც ვარაუდობს, რომ მეთილაციის ეს დინამიური ცვლილებები არსებითად შექცევადია უჯრედულ დონეზე [69]. პირიქით, ადამიანის კანის მიკროსისხლძარღვთა ECs (HMECs) კულტურა ჰიპოქსიაში (1% ჟანგბადი) 24 საათის განმავლობაში ნაჩვენები იყო, რომ ზრდის დონეს THBS1, მაშინ როდესაც ნორმოქსიური EC-ების მკურნალობა ჰიპოქსიური EC-განპირობებული მედიით ამცირებს EC პროლიფერაციას და ინდუცირებულ აპოპტოზს [100]. მიუხედავად იმისა, რომ ეს კვლევა არ გამოიკვლია THBS1 მეთილაცია იცვლება, სავარაუდოა, რომ კულტურის დიფერენციალური პირობები და ექსპოზიციის დრო (მაგ. ანოქსიური და გლუკოზის შიმშილი 4 საათის განმავლობაში [69] 1% ჟანგბადის წინააღმდეგ და ნორმალური გლუკოზა 24 საათის განმავლობაში [100]) და სხვადასხვა EC-ების გამოყენება (პირველადი MCEC-ები უკვდავებული HDMEC-ების წინააღმდეგ ) შესაძლოა განსხვავებულ შედეგებს ითვალისწინებდეს. მიუხედავად იმისა, რომ არ არის საბოლოო, ეს ნაშრომი ერთობლივად ვარაუდობს, რომ დნმ-ის მეთილაციამ შეიძლება მნიშვნელოვანი როლი ითამაშოს პლეიოტროპული ფაქტორების რეგულირებაში, როგორიცაა THBS1, EC-ების უნიკალურ პოპულაციებში სხვადასხვა გარემო ვითარებაში.

ჟანგბადის დონის გარდა, სისხლძარღვთა პერფუზია და სისხლის ნაკადის მიმართულება ცნობილია, რომ არეგულირებს დნმ-ის მეთილაციას და გენის ექსპრესიას EC-ებში, რამდენიმე ჯგუფი ხაზს უსვამს DNMT1-ის მნიშვნელოვან როლს EC ფუნქციის მოდულაციაში ათვლის სტრესის და დიფერენციალური ნაკადის საპასუხოდ. მაგალითად, გაზრდილი ბირთვული DNMT1 ექსპრესია 5MeC-ის გაძლიერებულ დონეებთან ერთად დაფიქსირდა EC-ებში, რომლებიც ექვემდებარებოდნენ დაბალ და რხევითი ათვლის სტრესს როგორც in vitro, ასევე in vivo სისტემების გამოყენებით [70]. ანალოგიურად, ამაღლებული DNMT1 დონეები დარღვეული სისხლის ნაკადის საპასუხოდ შემცირდა 5aza მკურნალობით [71]. Other studies have also reported increased DNMT1-mediated DNA methylation in the context of both increased shear stress (induced in vivo by vascular occlusion or in vitro using cone and plate flow apparatus) and unidirectional flow, associated with global hypermethylation of genes associated with cellular metabolism, nucleic acid turnover and transcription [72]. Interestingly, and consistent with the previously described study, increased expression of DNMT1 observed under unidirectional flow resulted in reduced monocyte adhesion to ECs which was reversed by treatment with 5azadC in both in vitro and in vivo models [72]. Notably, when ECs maintained under shear stress were exposed to reversed flow, DNMT1 expression remained unaltered whilst monocyte adhesion to ECs was increased, prompting the authors to propose that hypermethylation under shear stress with unilateral flow may limit the arteriogenic capacity of ECs, thereby preventing hypertrophy/hyperplasia which may lead to impaired perfusion and tissue hypoxia [72]. In addition to DNMT1, other DNMT enzymes have been implicated in regulating EC function in response to altered blood flow. For example, increased DNMT3A levels are reported in HAECs subjected to disturbed flow for 2 days, linked with hypermethylation at the promotor of anti-inflammatory and anti-thrombotic, KLF4, and decreased binding and expression of myocyte enhancer factor-2 [73]. DNMT3A-mediated methylation negatively impacted on downstream functional targets of KLF4 such as NOS3, THBD და MCP1, which was rescued by treatment with pharmacological inhibitors of DNMT (RG108 and 5aza) [73].

Collectively, these studies highlight that both hypoxia and abnormal perfusion dynamics can influence DNA methylation in ECs resulting in changes to their normal physiology and behaviour, thereby promoting EC dysfunction. Whilst there is clear potential for specifically targeting this epigenetic process in ECs for treatment of HF, particularly in the context of ischaemic cardiomyopathy, further investigation is required to define underlying mechanisms.


Აბსტრაქტული

Termini often determine the fate of RNA molecules. In recent years, 3′ ends of almost all classes of RNA species have been shown to acquire nontemplated nucleotides that are added by terminal nucleotidyltransferases (TENTs). The best-described role of 3′ tailing is the bulk polyadenylation of messenger RNAs in the cell nucleus that is catalyzed by canonical poly(A) polymerases (PAPs). However, many other enzymes that add adenosines, uridines, or even more complex combinations of nucleotides have recently been described. This review focuses on metazoan TENTs, which are either noncanonical PAPs or terminal uridylyltransferases with varying processivity. These enzymes regulate RNA stability and RNA functions and are crucial in early development, gamete production, and somatic tissues. TENTs regulate gene expression at the posttranscriptional level, participate in the maturation of many transcripts, and protect cells against viral invasion and the transposition of repetitive sequences.

  • RNA Interactions with Proteins and Other Molecules > Protein-RNA Recognition
  • RNA Processing > 3′ End Processing
  • RNA Turnover and Surveillance > Regulation of RNA Stability

Bruce A. Shapiro, Ph.D.

Dr. Shapiro directs research on computational and experimental RNA structure prediction and analysis and has pioneered research in the emerging field of RNA nanobiology. His work has led to several novel RNA folding and analysis algorithms, experimental techniques and discoveries in RNA biology. His interests include RNA nanobiology, nucleic acid structure prediction and analysis, the relationships between RNA structure and function. His has fostered a synergy between computational and experimental techniques, where computationally designed novel RNA based nanostructures have been shown to be able to self-assemble as predicted and be delivered to cell cultures and mouse models to control gene expression and thus show potential for use in RNA-based therapeutics. For additional information, please visit our web site at http://www-CCRNP.ncifcrf.gov/

1) RNA structure, 2) RNA folding, 3) RNA nanobiology – computational and experimental, 4) computational RNA structure prediction and analysis, 5) molecular dynamics, 6) RNA 3D modeling

Contact Info

A complete understanding of the function of RNA molecules requires knowledge of their higher order structures (2D and 3D) as well as the characteristics of their primary sequence. RNA structure is important for many functions, including regulation of transcription and translation, catalysis, transport of proteins across membranes and the regulation of RNA viruses. The understandings of these functions are important for basic biology as well as for the development of drugs that can intervene in cases where pathological functionality of these molecules occurs.

Our group does research and development of methodologies for improving RNA folding and analysis techniques to help further our understanding of the functional properties of these molecules. In addition, we are focusing on the emerging field of RNA nanobiology. RNA represents a relatively new molecular material for the development of biologically oriented nano devices. It is an interesting material because of its natural functionalities, its ability to fold into complex structures and self-assemble. We have developed computational and experimental methodologies that permit the design of RNA-based nanoparticles that potentially have a variety of uses. Thus, our research on RNA covers five highly related and integrated areas of research:

  1. Research in algorithms for RNA secondary structure prediction and analysis
  2. RNA biology and its relationship to sequence and secondary structure folding characteristics
  3. Research in algorithms for RNA 3D structure prediction and analysis and their application to RNA biology
  4. Research in algorithms for the design and analysis of RNA nanoparticles
  5. Experimental design, synthesis and delivery of RNA-based nanoparticles.

What is learned in one area is applied to the other areas, enhancing our understanding of RNA structure, function, and RNA nanobiology and self-assembly.

Parallel Computational Biology and RNA Structure
Revolutionary changes in computational paradigms are required to maintain the necessary computational power to solve problems in molecular biology. Methodologies based on sequential computer architectures could not be expected to continually keep pace with the needed computational speeds. In order to accommodate the high speeds that are necessary, highly parallel computational techniques are now employed. Our group was one of the pioneers in the area of computational biology and the use of parallel high performance computer architectures for this endeavor.

Computational Techniques for RNA Secondary Structure Prediction and Analysis
We were the first to develop an RNA folding technique that uses concepts from genetic algorithms. Our algorithm, MPGAfold, was originally developed to run on a massively parallel SIMD supercomputer, a MasPar MP-2 with 16384 processors. This algorithm was modified and now runs on parallel high performance Linux clusters. Exceptional scaling characteristics are obtained with the ability to run the algorithm with hundreds of thousands of population elements. RNA pseudoknot prediction is part of the genetic algorithm, resulting in its ability to predict tertiary interactions. Other features include simulation of co-transcriptional folding, the ability to incorporate different energy rules, and the forced inhibition and embedding of desired helical stems. In addition, STRUCTURELAB, our heterogeneous bioinformatical RNA analysis workbench, can be used in conjunction with MPGAfold and RNA2D3D to produce predicted 3D atomic coordinates of RNA structures along with the visualization of these structures. Also, we developed a novel interactive visualization methodology that is part of STRUCTURELAB. This technique enables the comparison and analysis of multiple sequence RNA folds from a phylogenetic point of view, thus allowing improvement of predicted structural results across a family of sequences.

We developed KNetFold, a novel and powerful algorithm for RNA structure prediction from sequence alignments. The algorithm uses a unique hierarchical classification network based on mutual information, thermodynamics and Watson-Crick base-pairedness to predict structures. In addition, we have developed a web-based application, CorreLogo, that uses mutual information derived from RNA sequence alignments to determine covariations amongst base-paired positions. The algorithm includes a unique error measure and depicts results in 3D.

We developed, CyloFold, a unique algorithm for predicting, from a single sequence, RNA secondary structures that may include pseudoknots. This algorithm utilizes a novel technique that approximates the potential for 3D steric clashes in the predicted structures, thus filtering out those structures from consideration. The algorithm has been shown to have high accuracy when compared to other algorithms of its type.

We developed web software based on a Bayesian statistical approach that estimates the accuracy of base pair formation from data derived from SHAPE (Selective 2' - Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension) experiments. The statistical/probabilistic results were derived by analyzing known RNA 3D structures having various types of known base interactions, and correlating them with SHAPE values. It was shown that low SHAPE values correlate well with Watson-Crick base pairing and stacking interactions while high SHAPE values indicate single stranded regions. Improvements could be seen if a 2 or 3 base context was also taken into account. We also showed that other types of known interactions did not correlate well. This type of information is helpful in ultimately determining the secondary structure of RNAs.

Computational Studies of RNA Folding Pathways
RNA folding pathways are proving to be quite important in the determination of RNA function. Studies indicate that RNA may enter intermediate conformational states that are key to its functionality. These states may have a significant impact on gene expression. It is known that the biologically functional states of RNA molecules may not correspond to their minimum energy state, that kinetic barriers may exist that trap the molecule in a local minimum, that folding often occurs during transcription, and cases exist in which a molecule will transition between one or more functional conformations before reaching its native state. Thus, methods for simulating the folding pathways of an RNA molecule, including co-transcriptional folding, and locating significant intermediate states are important for the prediction of RNA structure and its associated function. Several biological RNA folding pathways have been successfully studied using MPGAfold and STRUCTURELAB. Examples include the potato spindle tuber viroid, the host-killing mechanism of ეშერიხია კოლი plasmid R1, the hepatitis delta virus, HIV, and the dengue virus. These computational results are consistent with those derived from biological experiments. In addition, novel structural interactions and important functional intermediate and native states have been predicted. These have led to further successful confirmatory experiments.

Computational Prediction of RNA Interaction Networks
We have also developed programs CovaRna and CovStat to explore long-range co-varying RNA interaction networks using whole genome alignments. This new methodology, which was applied to დროზოფილა genomes, is currently being applied to other genomes. A parallel version of the program was devised to speed-up processing and the algorithms also rely on fast indexing schemes and conservative statistical methods to determine highly significant interactions. The methodology has found interesting interactions that are related to endogenous siRNAs, gene transport and genes related to morphogenesis.

Computational Studies of Three-Dimensional RNA Structures
Some structural elements of RNA molecules have been studied using molecular mechanics and molecular dynamics simulations. The structures examined include an RNA tetraloop where temperature-dependent denaturation of the tetraloop and the subsequent refolding to the original crystal structure were performed. A three-way junction from the core central domain of the 30S ribosomal subunit from თერმუს თერმოფილუსი was explored. It has been experimentally determined that the intermolecular interactions between the three-way junction and the S15 ribosomal protein initiate the process of the assembly of the 30S ribosomal subunit. By using molecular dynamics simulations we obtained insights into the conformational transitions of the junction associated with the binding of S15. We determined using, molecular dynamics simulations, the structural effects of utilizing new types of modified RNA nucleotides containing carbocyclic sugars that are constrained to north or south conformations (C2' or C3' exo). In addition, we showed using molecular dynamics simulations, how ions and flanking bases play a very important role in human immunodeficiency virus (HIV) kissing loop monomer conformations. These results correlate well and may explain in detail, experimental studies that indicate the importance of ions for HIV-1 dimerization.

We have also examined the pseudoknot domain of telomerase. Molecular modeling and molecular dynamics of the pseudoknot domain, including its hairpin loop, were performed. Results indicated how the hairpin loop dynamics affected the opening and closing of the non-canonical U-U base pairs found in the stem. The opening suggested nucleation points for the formation of the pseudoknot. We have also examined the effect of dyskeratosis congenita (DKC) mutations in the loop and how they reduced the propensity for the opening of the stem by forming a relatively stable hydrogen bond network in the hairpin loop. We modeled the pseudoknot itself using our RNA2D3D software combined with phylogenetic analysis. We studied the dynamical impact of the DKC mutations on the pseudoknot with the result that the pseudoknot became unstable while the hairpin form became more stable.

We discovered and elucidated the 3D structures of new types of translational enhancers that are found in the 3' UTRs of the Turnip Crinkle Virus (the first of its kind found) and the Pea enation Mosaic Virus. The discovery of these structural elements has brought to light new mechanisms for translational enhancement in eukaryotic plant viruses that may have broader implications for understanding translational mechanisms in general. This was accomplished with the combined use of MPGAfold, our 3D molecular modeling software RNA2D3D, and close interactions with our experimental collaborators. We also modeled a novel pseudoknot found in the CCR5 mRNA. This pseudoknot is involved in frameshifting and appears to be stabilized by a microRNA, a novel function for a microRNA.

In addition, we have employed methods based on elastic network interpolation to reduce the computational costs related to RNA 3D dynamics. Three-dimensional dynamics trajectories can be determined using a reduced atom representation and given conformational states. Compute time can be reduced from weeks to hours using this approach.

Computational RNA Nanobiology
RNA nanobiology represents a new modality for the development of nanodevices that have the potential for use in a number of areas, including therapeutics. Building on our experience as outlined above, we developed several computational and experimental techniques (see below) that provide a means to determine a set of nucleotide sequences that can assemble into desired nano complexes. One of these tools is a relational database called RNAJunction. The database contains structure and sequence information for known RNA helical junctions and kissing loop interactions. These motifs can be searched for in a variety of ways, providing a source for RNA nano building blocks. Another computational tool, NanoTiler, permits a user to construct specified RNA-based nanoscale shapes. NanoTiler provides a 3D graphical view of the objects being designed and provides the means to work interactively or with computer scripts on the design process even though the precise RNA sequences may not yet be specified, and an all-atom model is not available. NanoTiler can use the 3D motifs found in the RNAJunction database with those derived from specified RNA secondary structure patterns to build a defined RNA nano shape. Also, a combinatorial search can be applied to enumerate structures that would not normally be considered.

Another web-based software tool for RNA nanostructure design is NanoFolder, which is one of the few software tools that are capable of predicting the structure and sequence attributes of multi-stranded RNA constructs. With this software it is possible to specify the desired secondary structure motifs and have the software predict the set of sequences that generate these desired motifs with the correct intra- and inter-strand folding characteristics.

Experimental RNA Nanobiology
Based on the above described computational approaches to RNA nanodesign we have demonstrated the ability to experimentally self-assemble and functionalize several RNA-based nanoparticles. This was accomplished with close interactions between the experimental and computational approaches leading to enhancements to both sets of methodologies. Examples include the self-assembly of 6 and 10 stranded cubes the self-assembly of hexagonal rings of various sizes and double rings utilizing an RNA motif extracted from nature the modification of sequences in the motif to improve yield while also maintaining appropriate geometries and the self-assembly of triangular structures. We also developed techniques that define self-assembly protocols and that allow for co-transcriptional assembly of constructs that can also include modified bases to increase the chemical stability of these nanoparticles. In addition, we have functionalized these particles with up to six different siRNAs to enable controlled stoichiometry and gene silencing, and showed that these particles do indeed silence the designated genes when transfected into various cell lines.

We have also been exploring another paradigm based on the use of RNA/DNA hybrid nanoconstructs containing split functionalities. This allows, for example, the splitting of a Diceable siRNA into two DNA/RNA hybrid components with DNA toeholds, which when transfected into cells reassembles into a DNA duplex and a Diceable siRNA. This hybrid approach has been incorporated in our hexagonal nanorings and nanocubes. The utility of this approach permits, amongst other things, controlled activation of functionalities, incorporation of molecular beacons on the DNA strands without intefering with RNA functionality and resistance to nuclease degradation. This approach has been tried successfully in cell cultures and xenograph tumor mouse models.


Უყურე ვიდეოს: From DNA to protein - 3D (აგვისტო 2022).